Summary

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

Published: March 06, 2019
doi:

Summary

Microvascular خلايا بطانية لعضلات الهيكل العظمى (مك) شكل الجدار الداخلي للعضلات الشعيرات الدموية وتنظم على حد سواء، تبادل السوائل/الجزيئات والهجرة من الخلايا (المناعية) بين أنسجة العضلات والدم. عزل مك مورين الأولية، كما هو موضح هنا، يتيح إجراء تحقيقات شاملة في المختبر لوحدة “ميوفاسكولار”.

Abstract

خلايا بطانية للهيكل العظمى والعضلات الشعيرات الدموية (العضلات خلايا بطانية ميكروفاسكولار، مك) بناء الحاجز بين مجرى الدم وعضلات الهيكل العظمى التي تنظم تبادل السوائل والمواد الغذائية، فضلا عن الاستجابة المناعية ضد المعدية وكلاء بمراقبة الهجرة الخلية المناعية. لأداء هذه المهام، تشكل مك وظيفية “وحدة ميوفاسكولار” (مفو)، مع زيادة أنواع الخلايا، مثل الخلايا الليفية، وبيريسيتيس، وخلايا الهيكل العظمى والعضلات. ونتيجة لذلك، يسهم خلل وظيفي مك ومن ثم مفو مجموعة متنوعة واسعة من ميوباثيس. ومع ذلك، آليات تنظيمية من مك في الصحة والمرض تظل مفهومة غير كاف وعلى توضيح تسبق علاجات أكثر تحديداً ميوباثيس. عزلة والتحقيق المتعمق في وظائف مك الأولية في سياق مفو قد تيسر فهم أفضل لهذه العمليات.

توفر هذه المقالة بروتوكول لعزل مك مورين الأولية من الهيكل العظمى والعضلات بالتفكك الميكانيكية والانزيميه بما في ذلك تنقية وخطوات الحفاظ على الثقافة.

Introduction

عبر مجرى الدم والخلايا والأجهزة مزودة بالأكسجين وركائز والجزيئات الضرورية الأخرى. ويجري هذا التبادل في الشعيرات الدموية، سفن أصغر. الشعيرات الدموية تتشكل من طبقة خلايا بطانية داخلية (EC) سلامتها يظل شرطا أساسيا للتنظيم الناجح للعضلات التوازن بين المساحة داخل الأوعية والمتداخلة. لضمان انتقال انتقائية من العوامل القابلة للذوبان والخلايا، تشكل الجماعة الأوروبية أحادي الطبقة مترابطة بضيق و تقاطعات أدهيرينس 1. وإلى جانب دورها كحاجز للمواد الغذائية أو المنتجات الأيضية، تنظيم المفوضية الأوروبية تجنيد الكريات البيضاء في عمليات الالتهابات. أضرار التهاب أو الأنسجة يؤدي إلى أعلى لائحة جزيئات الالتصاق على السطح EC وإنتاج المستقطبات تيسير مرفق الكريات البيض والتهجير في الأنسجة المستهدفة 2. ونتيجة لذلك، تشارك المفوضية الأوروبية حاسمة في تنظيم عمليات تحريضية مثل الدفاع ضد العوامل الممرضة أو إصلاح الأنسجة.

خلل من المفوضية الأوروبية مباشرة المرتبطة بأمراض الأوعية الدموية والفشل الكلوي المزمن وتجلط وريدي مسببات المرض شديد العدوى. وعلاوة على ذلك، تشارك المفوضية الأوروبية تقريبا دائماً في الخاصة بجهاز المناعة الذاتية مثل السكري أو التصلب المتعدد 3. وظيفة الحاجز بين مجرى الدم والأجهزة ولذلك تسيطر تفاعل متضافرة من أنواع مختلفة من الخلايا. في الهيكل العظمى والعضلات microvascular غشائي الخلايا (مك) جنبا إلى جنب مع خلايا العضلات، الليفية وبيريسيتيس تشكل وحدة وظيفية، ووحدة “ميوفاسكولار” (مفو). ولذلك، اختلال وظيفي مفو قد دور حاسم في الفسيولوجيا المرضية ميوباثيس. ومع ذلك، فهم أعمق لهذه الآليات التنظيمية لا يزال مفقوداً وحاليا يحول دون تحديد أهداف جديدة، وهناك حاجة ماسة إليها، والعلاجية في ميوباثيس.

للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية المعقدة، ويشيع استخدام نماذج حيوانية. ومع ذلك، ميزة نماذج في المختبر التركيز على هذا موضوع اهتمام باستثناء مجموعة متنوعة من العوامل المؤثرة الأخرى. للتحقيق في العمليات في المختبر من الضروري عزل الخلايا الابتدائية نقية وقابلة للحياة. وعلى النقيض من خطوط الخلايا، تمكين الخلايا الأولية المعزولة من الحيوانات المحورة وراثيا بالتحقيق في آثار التعديلات الوراثية في المختبر.

هنا، يتم وصف طريقة لعزل مك مورين الأولية باستخدام التفكك الميكانيكية والانزيميه متبوعاً بخلية تنشيط مغنطيسية الفرز تقنيات (MCS) لتنقية. وتستخدم لهذا الغرض، حبات مغناطيسية ضد علامات سطح معين. الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء-1 (PECAM1, CD31) هو أساسا عن المفوضية الأوروبية ويمكن استخدامها لإثراء هذا النوع الخلية. لتبرير خلية عالية النقاء، مستبعدة خلايا المنشأ المكونة للدم بتحديد سلبي لبروتين تيروزين الفوسفاتيز مستقبلات نوع ج (بتبرك، CD45). علاوة على ذلك، يتم عرض عمليات مراقبة الجودة، وزراعة مك مورين الأولية، والتطبيقات المحتملة والقيود، فضلا عن اعتبارات خاصة.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات كانت معتمدة من قبل السلطات المحلية وتجري وفقا للقانون الألماني الرفق بالحيوان (84-02.05.20.13.097). الملاحظات العامة على التجارب على الحيوانات إجراء جميع التجارب الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية الخاصة بكل منها واستخدام اللجن…

Representative Results

يوم واحد بعد عزلة، مك مورين الأولية وبقايا الخلايا الأخرى تشكيل التكتلات والتقيد بالجزء السفلي من ثقافة الأطباق (اليوم 1 منالشكل 1A ). من يوم 7، يمكن ملاحظة خلايا مسطحة وممدود. ومع ذلك، لا تزال واضحة تلوث أخرى، معظمها خلايا كروي، (الشكل 1A يوم …

Discussion

خلايا بطانية microvascular توفر وظائف الحاجز في جميع الأنسجة ونتائجها اختلال وظيفي في المرض من الأجهزة المرتبطة بها 3. وعلاوة على ذلك، الدراسات الخاصة بالجهاز للجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار قد يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، فهم أعمق للدالة EC ميكروفاسكولار تحت الظ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل “آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ” (2018_A03 إلى TR)، “مبتكرة Medizinische Forschung (صندوق النقد الدولي) مونستر” (I-RU211811 إلى TR) ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG أنست 2105/27-1، لي 3283/5-1 ولي 3283/6-1 إلى SGM). الصور مصورة قدمتها هايك بلوم.

Materials

0,25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Play Video

Cite This Article
Müntefering, T., Michels, A. P., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

View Video