عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات
Summary
Microvascular خلايا بطانية لعضلات الهيكل العظمى (مك) شكل الجدار الداخلي للعضلات الشعيرات الدموية وتنظم على حد سواء، تبادل السوائل/الجزيئات والهجرة من الخلايا (المناعية) بين أنسجة العضلات والدم. عزل مك مورين الأولية، كما هو موضح هنا، يتيح إجراء تحقيقات شاملة في المختبر لوحدة “ميوفاسكولار”.
Abstract
خلايا بطانية للهيكل العظمى والعضلات الشعيرات الدموية (العضلات خلايا بطانية ميكروفاسكولار، مك) بناء الحاجز بين مجرى الدم وعضلات الهيكل العظمى التي تنظم تبادل السوائل والمواد الغذائية، فضلا عن الاستجابة المناعية ضد المعدية وكلاء بمراقبة الهجرة الخلية المناعية. لأداء هذه المهام، تشكل مك وظيفية “وحدة ميوفاسكولار” (مفو)، مع زيادة أنواع الخلايا، مثل الخلايا الليفية، وبيريسيتيس، وخلايا الهيكل العظمى والعضلات. ونتيجة لذلك، يسهم خلل وظيفي مك ومن ثم مفو مجموعة متنوعة واسعة من ميوباثيس. ومع ذلك، آليات تنظيمية من مك في الصحة والمرض تظل مفهومة غير كاف وعلى توضيح تسبق علاجات أكثر تحديداً ميوباثيس. عزلة والتحقيق المتعمق في وظائف مك الأولية في سياق مفو قد تيسر فهم أفضل لهذه العمليات.
توفر هذه المقالة بروتوكول لعزل مك مورين الأولية من الهيكل العظمى والعضلات بالتفكك الميكانيكية والانزيميه بما في ذلك تنقية وخطوات الحفاظ على الثقافة.
Introduction
عبر مجرى الدم والخلايا والأجهزة مزودة بالأكسجين وركائز والجزيئات الضرورية الأخرى. ويجري هذا التبادل في الشعيرات الدموية، سفن أصغر. الشعيرات الدموية تتشكل من طبقة خلايا بطانية داخلية (EC) سلامتها يظل شرطا أساسيا للتنظيم الناجح للعضلات التوازن بين المساحة داخل الأوعية والمتداخلة. لضمان انتقال انتقائية من العوامل القابلة للذوبان والخلايا، تشكل الجماعة الأوروبية أحادي الطبقة مترابطة بضيق و تقاطعات أدهيرينس 1. وإلى جانب دورها كحاجز للمواد الغذائية أو المنتجات الأيضية، تنظيم المفوضية الأوروبية تجنيد الكريات البيضاء في عمليات الالتهابات. أضرار التهاب أو الأنسجة يؤدي إلى أعلى لائحة جزيئات الالتصاق على السطح EC وإنتاج المستقطبات تيسير مرفق الكريات البيض والتهجير في الأنسجة المستهدفة 2. ونتيجة لذلك، تشارك المفوضية الأوروبية حاسمة في تنظيم عمليات تحريضية مثل الدفاع ضد العوامل الممرضة أو إصلاح الأنسجة.
خلل من المفوضية الأوروبية مباشرة المرتبطة بأمراض الأوعية الدموية والفشل الكلوي المزمن وتجلط وريدي مسببات المرض شديد العدوى. وعلاوة على ذلك، تشارك المفوضية الأوروبية تقريبا دائماً في الخاصة بجهاز المناعة الذاتية مثل السكري أو التصلب المتعدد 3. وظيفة الحاجز بين مجرى الدم والأجهزة ولذلك تسيطر تفاعل متضافرة من أنواع مختلفة من الخلايا. في الهيكل العظمى والعضلات microvascular غشائي الخلايا (مك) جنبا إلى جنب مع خلايا العضلات، الليفية وبيريسيتيس تشكل وحدة وظيفية، ووحدة “ميوفاسكولار” (مفو). ولذلك، اختلال وظيفي مفو قد دور حاسم في الفسيولوجيا المرضية ميوباثيس. ومع ذلك، فهم أعمق لهذه الآليات التنظيمية لا يزال مفقوداً وحاليا يحول دون تحديد أهداف جديدة، وهناك حاجة ماسة إليها، والعلاجية في ميوباثيس.
للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية المعقدة، ويشيع استخدام نماذج حيوانية. ومع ذلك، ميزة نماذج في المختبر التركيز على هذا موضوع اهتمام باستثناء مجموعة متنوعة من العوامل المؤثرة الأخرى. للتحقيق في العمليات في المختبر من الضروري عزل الخلايا الابتدائية نقية وقابلة للحياة. وعلى النقيض من خطوط الخلايا، تمكين الخلايا الأولية المعزولة من الحيوانات المحورة وراثيا بالتحقيق في آثار التعديلات الوراثية في المختبر.
هنا، يتم وصف طريقة لعزل مك مورين الأولية باستخدام التفكك الميكانيكية والانزيميه متبوعاً بخلية تنشيط مغنطيسية الفرز تقنيات (MCS) لتنقية. وتستخدم لهذا الغرض، حبات مغناطيسية ضد علامات سطح معين. الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء-1 (PECAM1, CD31) هو أساسا عن المفوضية الأوروبية ويمكن استخدامها لإثراء هذا النوع الخلية. لتبرير خلية عالية النقاء، مستبعدة خلايا المنشأ المكونة للدم بتحديد سلبي لبروتين تيروزين الفوسفاتيز مستقبلات نوع ج (بتبرك، CD45). علاوة على ذلك، يتم عرض عمليات مراقبة الجودة، وزراعة مك مورين الأولية، والتطبيقات المحتملة والقيود، فضلا عن اعتبارات خاصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلايا بطانية microvascular توفر وظائف الحاجز في جميع الأنسجة ونتائجها اختلال وظيفي في المرض من الأجهزة المرتبطة بها 3. وعلاوة على ذلك، الدراسات الخاصة بالجهاز للجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار قد يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، فهم أعمق للدالة EC ميكروفاسكولار تحت الظ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ” (2018_A03 إلى TR)، “مبتكرة Medizinische Forschung (صندوق النقد الدولي) مونستر” (I-RU211811 إلى TR) ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG أنست 2105/27-1، لي 3283/5-1 ولي 3283/6-1 إلى SGM). الصور مصورة قدمتها هايك بلوم.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
