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Neuroscience

प्राथमिक मुरीन कंकाल की मांसपेशी microvascular एंडोथीलियल कोशिकाओं के अलगाव

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

कंकाल की मांसपेशियों की माइक्रोसंवहनी एंडोथीलियल कोशिकाओं (mmec) मांसपेशी केशिकाओं की भीतरी दीवार को आकार और दोनों को विनियमित, तरल पदार्थ के आदान-प्रदान/अणुओं और मांसपेशियों के ऊतकों और रक्त के बीच (प्रतिरक्षा) कोशिकाओं के प्रवास । प्राथमिक मुरीन mmec का अलगाव, जैसा कि यहां वर्णित है, "मायोवैस्कुलर यूनिट" के विट्रो जांच में व्यापक सक्षम बनाता है ।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी केशिकाओं की endothelial कोशिकाओं (मांसपेशी microvascular एंडोथेलियल कोशिकाओं, mmec) रक्त प्रवाह और कंकाल की मांसपेशियों के बीच बाधा का निर्माण तरल पदार्थ और पोषक तत्वों के आदान-प्रदान के साथ ही संक्रामक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एजेंटों प्रतिरक्षा सेल प्रवास को नियंत्रित करने के द्वारा । इन कार्यों के लिए, mmec एक कार्यात्मक "मायोवैस्कुलर यूनिट" (mvu), आगे के सेल प्रकारों के साथ, जैसे कि फाइब्रोब्लास्ट, पेरिसाइट्स और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के रूप में । नतीजतन, mmec की शिथिलता और इसलिए mvu myopathies की एक विशाल विविधता के लिए योगदान देता है । हालांकि, स्वास्थ्य और रोग में mmec के विनियामक तंत्र अपर्याप्त रूप से समझ में आता है और उनके आविर्तन मायोपेथिस के लिए और अधिक विशिष्ट उपचार से पछाड़ । अलगाव और mvu के संदर्भ में प्राथमिक mmec कार्यों की गहराई से जांच इन प्रक्रियाओं की एक बेहतर समझ की सुविधा हो सकती है ।

यह लेख शुद्धिकरण और संस्कृति के रखरखाव के कदमों सहित यांत्रिक और एंजाइमेटिक वियोजन द्वारा कंकाल की मांसपेशी के प्राथमिक मुरीन mmec को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।

Introduction

रक्त प्रवाह के माध्यम से, कोशिकाओं और अंगों ऑक्सीजन, substrates और अन्य आवश्यक अणुओं के साथ आपूर्ति की जाती है । यह विनिमय capillaries, छोटी जहाजों में जगह लेता है । capillaries एक भीतरी endothelial कोशिका (ईसी) परत जिसका अखंडता intravascular और अंतरालीय अंतरिक्ष के बीच मांसपेशी homeostasis के सफल नियमन के लिए एक शर्त बनी हुई है द्वारा बनाई गई हैं । घुलनशील कारकों और कोशिकाओं के एक चयनात्मक संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, चुनाव आयोग एक तंग और पंना जंक्शन 1द्वारा परस्पर monolayer का गठन । पोषक तत्वों या चयापचय उत्पादों के लिए बाधा के रूप में अपनी भूमिका के अलावा, चुनाव आयोग भड़काऊ प्रक्रियाओं में ल्यूकोसाइट्स की भर्ती को विनियमित । सूजन या ऊतक क्षति के लिए एक अप-चुनाव आयोग की सतह पर आसंजन अणुओं के विनियमन और ल्यूकोसाइट लगाव को सुविधाजनक बनाने के chemokines के उत्पादन और लक्ष्य ऊतक 2में स्थानांतरगमन की ओर जाता है । नतीजतन, चुनाव आयोग गंभीर रूप से इस तरह के रोगजनकों या ऊतक की मरंमत के खिलाफ रक्षा के रूप में भड़काऊ प्रक्रियाओं के नियमन में शामिल हैं ।

चुनाव आयोग की शिथिलता सीधे संवहनी रोगों, क्रोनिक गुर्दे की विफलता, शिरापरक थ्रोम्बोसिस गंभीर रोगज़नक़ संक्रमण के साथ जुड़ा हुआ है । इसके अलावा, चुनाव आयोग वस्तुतः हमेशा ऐसे मधुमेह मेलिटस या मल्टीपल स्केलेरोसिस 3के रूप में अंग विशेष autoimmunity में शामिल हैं । रक्त प्रवाह और अंगों के बीच बाधा समारोह इसलिए अलग सेल प्रकार के एक ठोस परस्पर क्रिया द्वारा नियंत्रित किया जाता है । कंकाल की मांसपेशी microvascular एंडोथेलियल कोशिकाओं में (mmec) मांसपेशी कोशिकाओं के साथ साथ, फाइब्रोब्लास्ट और pericytes एक कार्यात्मक इकाई के रूप में, "मायोवैस्कुलर यूनिट" (mvu). इसलिए, mvu की शिथिलता myopathies की पैथोफिजियोलॉजी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । हालांकि, इन नियामक तंत्र की एक गहरी समझ अभी भी लापता है और वर्तमान में नए की पहचान precludes, तत्काल की जरूरत है, myopathies में चिकित्सीय लक्ष्यों ।

जटिल शारीरिक और pathophysiological तंत्र की जांच करने के लिए, पशु मॉडल आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है । तथापि, इन विट्रो मॉडल में लाभ की पेशकश करने के लिए कई conसंस्थापकों की एक किस्म को छोड़कर ब्याज के विषय पर ध्यान केंद्रित । विट्रो में प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए यह शुद्ध और व्यवहार्य प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है । कोशिका रेखाओं के विपरीत, ट्रांसजेनिक जंतुओं से पृथक प्राथमिक कोशिकाएं विट्रो में आनुवंशिक संशोधनों के परिणामों की जांच करने में सक्षम होती हैं ।

यहाँ, एक विधि को अलग करने के लिए प्राथमिक murine mmec यांत्रिक और एंजाइमी पृथक्करण का उपयोग करके वर्णित है चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई तकनीक (mcs) शुद्धि के लिए बाद. इस प्रयोजन के लिए, विशिष्ट सतह मार्कर के खिलाफ चुंबकीय मोती का उपयोग किया जाता है । प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु-1 (PECAM1, CD31) मुख्य रूप से चुनाव आयोग पर व्यक्त की है और इस सेल प्रकार को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उच्च सेल शुद्धता वारंट करने के लिए, हेमटोपोइटिक मूल की कोशिकाओं प्रोटीन tyrosine फॉस्फाटेस रिसेप्टर प्रकार सी के लिए एक नकारात्मक चयन से बाहर रखा गया है (ptprc, CD45). इसके अलावा, गुणवत्ता नियंत्रण, प्राथमिक मूरीन mmec की खेती, संभावित अनुप्रयोगों और सीमाओं के साथ ही विशेष विचार प्रस्तुत कर रहे हैं ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को स्थानीय प्राधिकरणों द्वारा अनुमोदित किया गया और जर्मन पशु कल्याण अधिनियम (84-02.05.20.13.097) के अनुसार आयोजित किए गए.

1. पशु प्रयोगों पर सामान्य टिप्पणी

  1. संबंधित संस्थागत पशु परिचर्या और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार सभी माउस प्रयोगों को निष्पादित करें.
  2. मानकीकृत शर्तों के तहत चूहों रखें और अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुसार जैसे प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों (फेलासा) के लिए फेडरेशन.
    नोट: सामांय में यह अलगाव तकनीक उंर, लिंग या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के स्वतंत्र चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक पर्याप्त सेल संख्या प्राप्त करने के लिए, 4 – 10 सप्ताह पुराने पुरुषों पसंद कर रहे हैं, क्योंकि जैविक गुणों उम्र और लिंग के साथ भिन्न हो सकते हैं.

2. समाधान, मीडिया और कोटिंग की तैयारी

  1. २०० μl कोलेजीनेस-dispase और ४५ μl desoxyribonuclease (dnase) के साथ २.२ मिलीलीटर dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (dmem) मिश्रण द्वारा पाचन समाधान (डी एस) तैयार करें ।
  2. ५० मिलीलीटर एफसीएस (लगभग 10%), ०.२५ एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर बीएफजीएफ (20 μg/एमएल; लगभग ०.०५%) के साथ ४५० एमएल का मिश्रण करके एंडोथीलीयल सेल मीडियम (ईएसएम) की ५०० मिलीलीटर तैयार करें और 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (लगभग 1%) । एक गिलास ट्यूब (फिल्टर pores के व्यास: ०.२ μm) में बाँझ निस्पंदन प्रदर्शन । बाद में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  3. नीचे वर्णित के रूप में कोट सेल संस्कृति प्लेटें ।
    1. नए सिरे से पृथक प्राथमिक मुरीन mec की खेती के लिए 1 मिलीलीटर की अच्छी तरह से एक जिलेटिन आधारित गति कोटिंग समाधान के साथ एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति थाली के साथ पूरी सतह को कवर ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए निर्माता के निर्देश के अनुसार 3-5 मिनट में कमरे में तापमान (आरटी) ।
    2. महाप्राण और कोटिंग समाधान त्यागें । दो लगातार धोने कदम में 2 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट buffered खारा (pbs), पीएच 7.1 – 7.5 के साथ एक अच्छी तरह से कुल्ला ।
    3. महाप्राण और पीबीएस त्यागें । ईएसएम के 1 मिलीलीटर मात्रा के साथ कुओं को भरें ।

3. प्राथमिक मुरीन मांसपेशी microvascular एंडोथेलीयल कोशिकाओं के अलगाव (mmec)

  1. euthanize एक वयस्क 4-12 सप्ताह पुराने, किसी भी एनेस्थेसिया के बिना गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से पुरुष माउस । इसका उद्देश्य मस्तिष्क से रीढ़ की हड्डी को जल्दी से अलग करना है ताकि जानवर को तेज और दर्द रहित मौत के साथ प्रदान की जा सके ।
  2. हाथ-पांव तोड़ ।
    1. एक शल्य तेज/कुंद का उपयोग करें (अत्याधुनिक ४२ मिमी, सीधे) और तेज/तेज (अत्याधुनिक 23 मिमी, सीधे) कैंची, एक सीधे (दांतेदार, 2 मिमी x १.२५ मिमी x 12 सेमी) और एक घुमावदार (दांतेदार, १.३ मिमी x 1 मिमी x 13 सेमी) forceps ।
    2. ७०% इथेनॉल के साथ सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों कीटाणुरहित ।
    3. अपनी पीठ पर जानवर की स्थिति, ७०% इथेनॉल के साथ पैरों को गीला । तेज के साथ हिप संयुक्त पर काटने से पूरे पैर तोड़/सर्जिकल कैंची । एक बंद सेल संस्कृति पकवान (३५ मिमी x 10 मिमी) में हाथ-पांव प्लेस ।
      नोट: अब से एक बाँझ स्तरीय प्रवाह हुड के तहत हर कदम प्रदर्शन और निष्फल उपकरणों के साथ काम करते हैं ।
  3. मांसपेशी ऊतक को अलग करें (अधिमान्य रूप से दोनों पैरों से मस्क्युलस क्वाड्रीसेप्स फेमोरिस या मस्क्युलस ट्राइसेप्स सुराए का उपयोग करते हैं) ।
    1. एक तेज/तेज कैंची और घुमावदार कांसेप्स का उपयोग करके त्वचा को कूल्हे से पैर की अंगुली-टिप में काटें । सीधे forceps के साथ पैर की अंगुली या फ़ुटपैड पकड़ो । त्वचा को पैर की अंगुली से कूल्हा के साथ छीलकर कूल्हे में बंद कर दें ।
    2. घुटने से कण्डरा काटने और कूल्हे को फीमूर के साथ मांसपेशी तोड़ द्वारा मस्क्यूलस क्वाड्रीसेप्स शिरस्क को अलग करें । अशिकाओं के कणन को विच्छेद करके मस्क्युलस ट्राइसेप्स सुराए को अलग कर दीजिये । इसके बाद, टिबिया के साथ जानुपृष्ठीय खात में कटौती और मांसपेशियों को हटा दें ।
      नोट: यदि बड़े जहाजों (ए. फेमोरेलिस, ए. टिबिलिस कीमोथैरेपी, ए. टीबीलिस पश्च, ए. फिब्लारिस) पृथक मांसपेशियों में दिखाई देती हैं, तो मैक्रोवैस्कुलर एंडोथीलियम द्वारा प्रदूषण से बचने के लिए जहाजों को हटा दें ।
    3. बड़े जहाजों को हटाने के लिए, मांसपेशी के हिस्से को एक घुमावदार कांटा के साथ बड़े जहाजों से युक्त नहीं रखें और पोत के बगल में काट दें । इस प्रोटोकॉल के लिए, 1 जी या कम मांसपेशी ऊतक दोनों क्वाड्रीसेप्स शिरस्क और triceps सुराए के बराबर की सिफारिश की है ।
    4. जोड़ें २,४४५ μl डी एस (से कदम २.१) करने के लिए एक सेल संस्कृति पकवान (३५ मिमी x 10 मिमी) और वजन का निर्धारण.
    5. इस सेल संस्कृति २४४५ μl डी एस युक्त पकवान और वजन निर्धारित करने के लिए सभी मांसपेशी टुकड़े स्थानांतरण । दोनों मापा मूल्यों के अंतर मांसपेशी ऊतक जो 1 ग्राम से अधिक नहीं होना चाहिए के शुष्क वजन प्रदान करता है ।
    6. तेज/तेज कैंची का उपयोग करके छोटे टुकड़ों (≤ 2 मिमी cubes, के बारे में १०० टुकड़े) में पूरे मांसपेशी ऊतक काटें ।
  4. मांसपेशी ऊतक को अलग करना.
    नोट:     इस कदम के बारे में १२० मिनट लगते हैं ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्नायु/(5% CO2के साथ इनकोबेटर) के लिए १.५ h. एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर के बारे में 5 मिनट के लिए निलंबन ध्यान से हर 20 मिनट मिलाएं ।
    2. एक ७० μm नायलॉन सेल छलनी एक ५० मिलीलीटर ट्यूब पर रखा और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए स्थानांतरण निलंबन । dmem के 8 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी धोने और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
    3. 20 डिग्री सेल्सियस पर ३०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए सेल छलनी और अपकेंद्रिप निलंबन छोड़ें । ध्यान से सुपरनांट हटा दें ।
      सावधानी: गोली खोना आसान है ।
    4. एक अमोनियम क्लोराइड के 1 मिलीलीटर में resuspend सेल गोली-पोटेशियम (ACK) बफर lysing ( सामग्री की तालिकासंलग्न देखें) लाल रक्त कोशिकाओं के lysis के लिए और आर टी पर 30 एस के लिए सेते हैं । जोड़ें 9 मिलीलीटर dmem + 10% एफसीएस प्रतिक्रिया और स्थानांतरण सेल निलंबन को रोकने के लिए एक 15 मिलीलीटर टी Ube.
  5. CD45 microbeads निर्माता के निर्देश के बाद CD45+ कोशिकाओं चूस । CD45+ कमी का उपयोग mcs बफर के सभी निम्न चरणों के लिए (सामग्री की तालिका संलग्न देखें).
    नोट:     इस कदम के बारे में ६० मिनट लगते हैं ।
    1. सेल संख्या का उपयोग कर एक नेबआउर सेल गिनती चैंबर का निर्धारण (जी मांसपेशी ऊतक प्रति 5 x 106 कोशिकाओं के बारे में उम्मीद).
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रिज निलंबन । ९० μl mcs बफर (प्रति 107 कोशिकाओं या उससे कम) में सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से और resuspend सेल गोली ले लो । CD45 microbeads के 10 μl जोड़ें (प्रति 107 कोशिकाओं या उससे कम).
    3. मिश्रण सेल निलंबन और फ्रिज में 4-8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते ।
    4. 1ml mcs बफर जोड़ें (प्रति 107 कोशिकाओं या उससे कम). 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका । सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें और ५०० μl mcs बफर में resuspend कोशिकाओं ।
    5. चुंबकीय कोशिका पृथक्करण के लिए एक बड़े चुंबकीय स्तंभ का उपयोग करें (lmc) 8 मिलीलीटर की एक जलाशय मात्रा और अप करने के लिए 2 x 109 कुल कोशिकाओं की क्षमता के साथ । विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एलएमसी को रखें ।
    6. एलएमसी के जलाशय में mcs बफर के 3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला । धोने के बाद, प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए कॉलम के नीचे एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब रखें । पूरे सेल निलंबन (५०० μl) कॉलम पर लागू करें और इसे पूरी तरह से प्रवाह के माध्यम से करते हैं ।
    7. जलाशय में mcs बफर के 3 मिलीलीटर जोड़कर कॉलम को तीन बार धोएं और प्रतीक्षा करें जब तक कि कॉलम का जलाशय अगले वाशिंग चरण के प्रदर्शन से पहले खाली न हो जाए ।
    8. आगे जुदाई चरणों के लिए कॉलम का उपयोग पारित (CD45- अंश का प्रतिनिधित्व) लेबल वाले कक्षों लीजिए । लेबल किए गए कक्ष (CD45+ अंश का प्रतिनिधित्व करते हुए) स्तंभ में संचित छोड़ दिया जा सकता है ।
  6. CD31 microbeads निर्माता के निर्देशों का पालन CD31+ कोशिकाओं संचित । CD31+ संचय का उपयोग mcs बफर के सभी निम्न चरणों के लिए.
    नोट:     इस कदम के बारे में ६० मिनट लगते हैं ।
    1. सेल संख्या का उपयोग कर निर्धारित करें एक न्यूबायर सेल गिनती चैंबर (जी मांसपेशी ऊतक प्रति 4 x 106 कोशिकाओं के बारे में उम्मीद).
    2. अपकेंद्रिका ३.५ चरण से 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए बिना लेबल वाले सेल निलंबन प्राप्त किया ।
    3. सुपरनेटंट को पूरी तरह से हटा दें । ९० μl mcs बफर में गोली resuspend और CD31 microbeads के 10 μl जोड़ें (प्रति 107 कुल कोशिकाओं या कम) । पूरे निलंबन मिश्रण और फ्रिज में 4-8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी में 1ml एमसीएस बफर और अपकेंद्रिप जोड़ें । एमसीएस बफर के ५०० μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को दूर ले जाओ ।
    5. चुंबकीय कोशिका पृथक्करण के लिए एक मध्यम चुंबकीय कॉलम (एमएमसी) का उपयोग करें ३.५ मिलीलीटर की एक जलाशय मात्रा और 2 x 108 कुल कोशिकाओं की क्षमता के साथ ।
    6. विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में MMC को रखें । mcs बफर के ५०० μl के साथ एमएमसी कुल्ला । धोने के बाद, प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए कॉलम के नीचे एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब रखें ।
    7. पूरे सेल निलंबन (५०० μl) कॉलम पर लागू करें और इसे पूरी तरह से प्रवाह के माध्यम से करते हैं ।
    8. कॉलम से तीन बार धो mcs बफर के ५०० μl जोड़कर और रुको जब तक कॉलम जलाशय खाली है अगले धोने कदम प्रदर्शन से पहले । स्तंभ को पास करने वाले लेबल न किए गए कक्ष CD45- CD31- भिंन दर्शाते हैं । उन्हें आगे की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए स्टोर.
    9. विभाजक से कॉलम निकालें और इसे एक उपयुक्त संग्रह ट्यूब (15 मिलीलीटर ट्यूब) पर रखें । पिपेट 2 मिलीलीटर mcs बफ़र स्तंभ पर । तुरंत कॉलम में मजबूती से डुबकी लगाने के द्वारा चुंबकीय कोशिकाओं को बाहर निकलवाने । इस CD45- CD31+ अंश समृद्ध प्राथमिक murine चुनाव आयोग का प्रतिनिधित्व करता है.
    10. 20 डिग्री सेल्सियस पर ३५० एक्स जी में 5 मिनट के लिए सेंट्रेसेज सेल निलंबन । सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें और कोशिकाओं resuspend (आसपास की अपेक्षा ०.६ x 10 जी मांसपेशी ऊतक प्रति6 कोशिकाओं) में 1 मिलीलीटर ecm (देखें चरण २.२.) । कोशिकाओं (0.5-0.7 x 106 कोशिकाओं) स्थानांतरण एक लेपित 6-well संस्कृति प्लेट के एक ही अच्छी तरह से (चरण २.३ से) जिसमें 1 मिलीलीटर ecm ।
  7. खेती के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर एक बाँझ इनकोबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं । ईएसएम को हर दो से तीन दिन में रिफ्रेश करें ।

४. प्राथमिक मूर्तीने mmec शुद्धीकरण

  1. CD31+ संचय के एक दूसरे चक्र प्रदर्शन, निर्माता के निर्देशों का पालन (CD31 microbeads माउस प्रोटोकॉल; चरण ३.६ देखें.) ।
    1. trypsin के साथ कोशिकाओं को अलग/edta समाधान जब वे 80 पर है-90% संगम (आमतौर पर 7 दिनों के बाद) । इसके लिए, 2 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ एक अच्छी तरह से कुल्ला, दो लगातार धोने के चरणों में । प्रति 6 ८०० μl ट्रिप्सिन/edta समाधान का उपयोग करें-अच्छी तरह से और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 के लिए एक बाँझ इनकोबेटर में 3 – 5 मिनट के लिए, और 10% की एक कम से युक्त के रूप में...
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर ३५० एक्स जी में 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रिप ।
    3. शुद्धता बढ़ाने के लिए दूसरा CD31-mcs चरण निष्पादित करें (CD31 microbeads निर्माता के निर्देशों के अनुसार; ३.६ देखें.) ।
    4. उज्ज्वल क्षेत्र या मानक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सेल संगम का निरीक्षण करें
      20x इज़ाफ़ा और ०.३५ लेंस संख्यात्मक एपर्चर । चित्रा 1देखें ।
      नोट: कोशिकाओं को संबंधित प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या passaging द्वारा संस्कृति में रखा. कम मार्गों में तुरंत प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें । यह पारित होने के बाद कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है
      ८-१०.

5. गुणवत्ता नियंत्रण

  1. द्वितीय CD31-mcs-step के बाद प्राथमिक मुरीन mmec के प्रवाह cytometry निष्पादित करें ।
    1. 1 मिलीलीटर प्रवाह cytometry (एफसी) बफर जोड़कर एक facs ट्यूब तैयार ( सामग्री की तालिकासंलग्न देखें) ।
    2. trypsin के साथ कोशिकाओं को अलग/edta समाधान जब वे १००% संगम पर है (आमतौर पर 14 दिनों के बाद) । इसके लिए, 2 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ एक अच्छी तरह से कुल्ला, दो लगातार धोने के चरणों में । 6 के लिए ८०० μl trypsin/edta समाधान का उपयोग करें-अच्छी तरह से और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 के लिए एक बाँझ इंयूबेटर में 3 – 5 मिनट के लिए बंद करना एंजाइमेटिक गतिविधि १२०० μl dmem का उपयोग कर 10% FCS युक्त.
    3. एक न्यूबायर सेल गिनती चैंबर का उपयोग कर सेल संख्या निर्धारित करें और तैयार facs ट्यूब के लिए 1 एक्स 105 कोशिकाओं की एक न्यूनतम जोड़ें ।
    4. ३०० एक्स जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रेसेज सेल निलंबन । 1 मिलीलीटर एफसी बफर में सुपरनाटंट, resuspending कोशिकाओं को हटाकर और 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रण करके दो वाशिंग स्टेप निष्पादित करें ।
    5. विरोधी माउस CD31-fitc एंटीबॉडी (1:100) और विरोधी माउस CD45-PE (1:100) एफसी बफर के साथ जोड़कर एक धुंधला मिश्रण तैयार करें ।
    6. facs ट्यूबों में धुंधला मिश्रण के १०० μl में कोशिकाओं resuspend । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते । एफसी बफर के 1 एमएल जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए सेंट्रेसेज सेल निलंबन । सावधानी से २०० μl एफसी बफर के में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को हटा दें ।
    7. एक प्रवाह cytometer में कोशिकाओं को मापने के बाद गेटिंग रणनीति चित्रा में दिखाया गया है । 2A.
  2. वैकल्पिक रूप से दूसरा CD31-mcs-कदम के बाद प्राथमिक मुरीन mmec की इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन ।
    1. coverslips कोट ।
      1. एक अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक बाँझ 13 मिमी व्यास दौर गिलास coverslip स्थानांतरण । कोट coverslip प्रति अच्छी तरह से गति कोटिंग समाधान के ३०० μl जोड़कर । कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट के लिए सेते (आरटी) ।
      2. महाप्राण और कोटिंग समाधान त्यागें । दो लगातार धोने के चरणों में 2 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ एक अच्छी तरह से कुल्ला । महाप्राण और पीबीएस त्यागें ।
      3. लेपित coverslip पर 1 मिलीलीटर ecm में बीज 1 x 105 कोशिकाओं और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर एक बाँझ इनकूबेटर में सेते जब तक कोशिकाओं ९९% संगामी हैं ।
    2. निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन ।
      1. 5.2.1.3 से खेती की गई कोशिकाओं के ईएसएम माध्यम को हटा दें ।
      2. ३०० μl 4% पैराफॉर्मालडिहाइड (पीएफए) जोड़कर ७.४ के पीएच के साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं को ठीक करें, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
        सावधानी: पीएफए विषाक्त है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए ।
      3. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर pbs जोड़कर 3 धोने कदम प्रदर्शन और आरटी पर 5 मिनट के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें ।
      4. 5% bsa, ०.२% triton-X और pbs में 1% बकरी सीरम युक्त एक अवरुद्ध समाधान तैयार करें ।
      5. एक अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान के ३०० μl जोड़ें और आरटी में 1 एच के लिए सेते ।
      6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक विरोधी pecam-1 (CD31) एंटीबॉडी (1:200) 5% bsa, pbs में 1% बकरी सीरम में अच्छी तरह से प्रति २०० μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
      7. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर pbs जोड़कर और प्रत्येक चरण में आरटी पर 5 मिनट के बाद सतह पर तैरनेवाला को हटाने के द्वारा 3 धोने कदम प्रदर्शन ।
      8. 1% bsa और pbs में Cy3-संयुग्मित विरोधी चूहा igg एंटीबॉडी (1:500) युक्त एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान की अच्छी तरह से प्रति ३०० μl जोड़ें और अंधेरे में आरटी में 1 एच के लिए सेते हैं ।
      9. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर pbs जोड़कर और प्रत्येक चरण में आरटी पर 5 मिनट के बाद सतह पर तैरनेवाला को हटाने के द्वारा 3 धोने कदम प्रदर्शन ।
    3. संदंश के साथ गोल गिलास coverslips बाहर ले लो और यह एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर स्थानांतरण । सेल परत पर dapi युक्त बढ़ते मध्यम के एक उचित राशि जोड़ें और ध्यान से उस पर एक कवर गिलास डाल ( सामग्री की तालिकासंलग्न देखें) ।
    4. एक प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत (१२० डब्ल्यू) और दो फिल्टर सेट के साथ सुसज्जित एक उचित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं का निरीक्षण करें: एक उत्तेजना/उत्सर्जन फ़िल्टर 550/25 एनएम और 605/70 एनएम तरंगदैर्ध्य के साथ Cy3 540/562 एनएम का पता लगाने के लिए सेट ।
    5. dapi 350/440 एनएम का पता लगाने के लिए 365/50 एनएम और 445/50 एनएम के एक उत्तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य के साथ एक दूसरे फ़िल्टर का उपयोग करें । का उपयोग करें 40x की वृद्धि और ८०% की तीव्रता के साथ dapi के लिए १४.५ मेगावाट/cm2 का पता लगाने के लिए 30 ms. Cy3 का उपयोग ८०% की प्राप्ति अवधि के साथ ६७.५ मेगावाट/cm2 ६० ms.
  3. मात्रात्मक पीसीआर प्रदर्शन ।
    1. मृणा का अलगाव ।
      1. एक एसिड का उपयोग कर मानक प्रक्रियाओं का पालन करें guanidinium थायोसिनेट-phenol (agtp) एक अभिकर्मक mrna को अलग करने के लिए. CD45- CD31 से न्यूनतम ०.५ x 106 कक्षों का उपयोग करें- (चरण 3.6.8 देखें), CD45- CD31+ (चरण 3.6.9 देखें.) भिन्नक्रियाएँ और खेती की गई प्राथमिक मुरीन mmec (4.1.3)
      2. 20 डिग्री सेल्सियस पर ३०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए सेंट्रेसेज सेल निलंबन । सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से दूर ले । agtp अभिकर्मक के ५०० μl में सेल गोली resuspend और एक 2 मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण । आरटी में 5 मिनट के लिए सेते ।
      3. क्लोरोफॉर्म के १०० μl जोड़ें और 15 एस के लिए जोरदार शेक आरटी में 3 मिनट के लिए सेते ।
      4. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० एक्स जी में 15 मिनट के लिए अपकेंद्रिप निलंबन ।
      5. ऊपरी जलीय चरण (आरएनए युक्त) को सावधानीपूर्वक लें और एक १.५ मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में स्थानांतरित करें । जोड़ें २५० μl के isopropanol और सेते के लिए 10 मिनट में आरटी.
      6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० एक्स जी पर एक अपकेंद्रीकरण कदम प्रदर्शन ।
      7. सतह पर तैरनेवाला दूर ले और ७५% इथेनॉल की 1 मिलीलीटर ध्यान से जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ७,५०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका ।
        नोट: गोली खोना आसान है ।
      8. सुपरनेटंट को पूरी तरह से हटा दें । हवा पर 5-10 मिनट के लिए गोली सूखी चलो ।
        नोट: इथेनॉल को हटाने की जरूरत है लेकिन बहुत ज्यादा सूखा नहीं है ।
      9. 30 μl डाईथाइलपाइरॉकार्बोनेट में गोली भंग पानी में युक्त और ५५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी का इलाज किया ।
        नोट: आरएनए एकाग्रता और शुद्धता एक वर्णक-प्रकाशमापी द्वारा मापा जा सकता है ।
    2. cdna संश्लेषण (रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ पीसीआर) करते हैं ।
      1. एक mastermix युक्त तैयार: पीसीआर बफर के 10 μl (5x), 2, 5 μl desoxyribonucleosid-ट्राइफॉस्फेट (dntp (10 मिमी)), सिंगल-असहाय प्राइमर (०.२ μg/μl) के ०.५ μl यादृच्छिक मिश्रण, 1 μl के rnase अवरोधक (४० u/μl, ०.४ रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ (२०० u/μl) और के ५.६ μl डाइथाइलपाइरकार्बोन का इलाज पानी ( सामग्री की तालिकासंलग्न देखें) ।
      2. पतला ५०० एनजी आरएनए में 30 μl डाईथाइलपाइरोकार्बोनेट ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों में पानी का इलाज किया और पूरे 20 μl mastermix जोड़ें ।
      3. निम्न चरणों का पालन करते हुए PCR cycler का उपयोग करें: 10 मिनट 25 ° c, 30 मिनट ५० ° c, 5 ंयूनतम ८५ ° c और 4 ° c पर पकड़ ।
  4. मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) निष्पादित करें ।
    नोट: डुप्लिकेट या triplicates में नमूने के qpcr प्रदर्शन ।
  5. दो अलग प्रतिदीप्ति रंजक के साथ प्राइमर का प्रयोग करें । ४९५ एनएम के अवशोषण और ब्याज के जीन के लिए ५१७ एनएम के उत्सर्जन के साथ प्राइमर ।
  6. सैटेलाइट सेल मार्कर जीन एक्सप्रेशन का पता लगाने के लिए, युग्मित बॉक्स प्रोटीन 7 (Pax7) और एम-कैडहरिन (Cdh15) के लिए प्राइमर्स का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकासंलग्न देखें) ।
  7. endothelial सेल मार्कर जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए, claudin के लिए प्राइमरों का उपयोग करें-5 (Cld5), occludin (ocln) और जोनुला occludin-1 (Tjp1 या ZO1) ( सामग्री की तालिकासंलग्न देखें).
  8. 18s rrna के लिए संदर्भ जीन के रूप में, ५३८ एनएम के अवशोषण और ५५४ एनएम तरंगदैर्ध्य के उत्सर्जन के साथ एक प्राइमर का उपयोग करें ।
  9. संबंधित प्राइमर के साथ ब्याज की प्रत्येक जीन के लिए एक qpcr मास्टर्मिक्स तैयार करें । mastermix शामिल हैं: 10μl qpcr बफर (2x), ब्याज के जीन के लिए प्राइमरी के 1 μl (10 μm), 18s rrna के लिए प्राइमर के 1 μl और 4 μl के nuclease मुक्त पानी.
  10. एक ९६-वेल रिएक्शन प्लेट की एक अच्छी तरह से mastermix के 16 μl जोड़ें । cdna के 4 μl जोड़ें (चरण 5.3.2 से प्राप्त) प्रति अच्छी तरह से mastermix युक्त.
  11. निम्न चरणों का पालन करते हुए एक रीयल-टाइम पीसीआर cycler का उपयोग करें: 2 मिनट और ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस के साथ स्टेज होल्डिंग । ९५ ° c 15 एस और ६० ° c के ४० चक्र के साथ 1 मिनट के लिए सायक्लिंग स्टेज ।

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Representative Results

अलगाव के बाद एक दिन, प्राथमिक मुरीन mmec और अवशिष्ट अंय कोशिकाओं के रूप में समूह और संस्कृति व्यंजन (चित्रा 1a दिवस 1) के नीचे का पालन करें । 7 दिन से, सपाट और लम्बी कोशिकाओं को देखा जा सकता है । हालांकि, अंय के संदूषण, ज्यादातर गोलाभ कोशिकाओं, अभी भी दिखाई दे रहा है (चित्रा 1a दिन 7) । इस प्रकार, mcs के माध्यम से CD31 सकारात्मक चयन का एक और चक्र की आवश्यकता है । इसके बाद, प्राथमिक मुरीन mmec लगभग 80-90% की एक घनत्व के लिए पैदा करना । संगम पर वे आम तौर पर अनुदैनिधिक संरेखित कोशिकाओं के एक गैर अतिव्यापी monolayer (चित्रा 1a दिन 14) के रूप में । संपर्क-निषेध के कारण संगम पर प्रसार रुक जाता है । 14 दिनों के बारे में 5-10 x 105 कोशिकाओं के बाद आगे की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

प्रवाह cytometry के माध्यम से गुणवत्ता नियंत्रण fixable व्यवहार्यता डाई FVD780 का उपयोग (मृत कोशिकाओं के लिए दाग), PECAM1 (CD31) और ptprc (CD45, हेमटोपोइटिक मूल की कोशिकाओं के लिए मार्कर के रूप में) दोनों व्यवहार्यता और ७०% के आसपास लेकर शुद्धता के लिए मूल्यों को दिखाया कोशिकाओं के लिए प्रत्येक अलगाव के तुरंत बाद (चित्रा 2a) । कोशिकाओं mcs के माध्यम से एक और CD31 सकारात्मक चयन के बाद खेती की, शुद्धता के लिए संतोषजनक मूल्यों के रूप में अच्छी तरह से ९५% प्रत्येक (चित्रा 2b) को लेकर व्यवहार्यता के लिए दिखाया ।

चयन चरणों की सटीकता का मूल्यांकन करने के लिए, प्राप्त कोशिकाओं की आगे की जांच की गई मांसपेशी सैटेलाइट सेल मार्कर जीन युग्मित बॉक्स प्रोटीन 7 (Pax7) और एम-कैडहरिन (Cdh15) के जीन अभिव्यक्ति के लिए मात्रात्मक पीसीआर (qpcr) द्वारा mrna स्तर पर । प्राथमिक मुरीन mmec (pmmmec) और विभेदित प्राथमिक मुरीन मांसपेशी कोशिकाओं (pmmc) क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. मरीन पेशी कोशिकाएँ व्यावसायिक रूप से खरीदी गईं. जैसा कि उम्मीद है, केवल CD45- CD31- अंश के साथ-साथ pmmc ने Pax7 और Cdh15को व्यक्त किया, जबकि CD45- CD31+ और प्राथमिक मुरीन mmec इन मार्करों (चित्रा 2c) के लिए नकारात्मक थे ।

चुनाव आयोग कंकाल मांसपेशी एक्सप्रेस तंग जंक्शन प्रोटीन 4,5के endomysium में केशिकाओं से व्युत्पंन । qpcr का उपयोग करके, claudin की अभिव्यक्ति-5 (Cld5), occludin (ocln) और जोनुला occludin-1 (Tjp1 या ZO1) संगामी प्राथमिक मुरीन mmec के बाद दूसरे CD31 mcs कदम का मूल्यांकन किया गया था । pmmc नियंत्रण (चित्रा 2d) के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्राथमिक मुरीन mmec ने Cld5, ocln और Tjp1के उच्च स्तर को व्यक्त किया, जबकि pmmc केवल Tjp1की कम अभिव्यक्ति दिखाती है. इसके अलावा, गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्राथमिक मुरीन mmec (चित्रा 2e) में endothelium-विशिष्ट मार्कर PECAM1 की सतह अभिव्यक्ति की पुष्टि की ।

Figure 1
चित्रा 1: प्राथमिक मुरीन mmec की morphology. (क) चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा सुसंस्कृत प्राथमिक मूरीन mmec के प्रतिनिधि छवि 1 से 14 दिनों तक । d1 = दिन 1, d7 = दिन 7, d14 = 14 दिन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्राथमिक मुरीन mmec की गुणवत्ता नियंत्रण । प्राथमिक मुरीन mmec के प्रवाह cytometric विश्लेषण के तुरंत अलगाव (ए) के बाद और 15 दिन (ख) का उपयोग कर (I) fsc/SSC, (II) FVD780 और (iiia) CD45, (iiia) CD31 (डैश्ड लाइंस = समप्ररूप नियंत्रण) के लिए Gating रणनीति । (ग) Pax7 और एम-कैधेरीन (Cdh15) के एक्सप्रेशन स्तर CD45- CD31-, CD45- CD31+ अंशों के बाद mcs अलगाव के साथ-साथ प्राथमिक मुरीन mmec (pmmmec) और प्राथमिक मुरीन मांसपेशी कोशिकाओं (pmmc ). अभिव्यक्ति स्तर के रूप में दिखाया गया है δ सीटी मान (नमूना-18s rrna), जवाबतलब = निर्धारित नहीं. (घ) टाइट जंक्शन प्रोटीन्स क्लॉडिन-5 (Cldn5), occludin (ocln) या जोनुला occludin-1 (Tjp1 या ZO-1) के pmmmec और pmmc की अभिव्यक्ति स्तर, के रूप में दिखाया गया है δ सीटी मान. (ई) PECAM1 के लिए immunofluorescence धुंधला (लाल) खेती में प्राथमिक मूरीन mmec 24 एच के बाद दूसरा CD31 सकारात्मक चयन । परमाणु दाग के साथ dapi युक्त (नीला) बढ़ते मध्यम; वाम = anti-PECAM1/dapi, सही: नकारात्मक नियंत्रण/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

माइक्रोसंवहनी endothelial कोशिकाओं सभी ऊतकों में बाधा कार्य प्रदान करते हैं और संबंधित अंगों की बीमारी में उनके रोग परिणाम 3. इसके अलावा, माइक्रोवैस्कुलर ईसी के अंग-विशिष्ट अध्ययन नई चिकित्सीय रणनीतियों के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकते हैं । इसलिए, शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के तहत माइक्रोसंवहनी ईसी समारोह की गहरी समझ महान वैज्ञानिक हित की है । ल्यूकोसाइट/endothelium बातचीत का मॉडुलन सफलतापूर्वक एक एंटीबॉडी जो लिम्फोसाइट आसंजन रोकता है और इस तरह 6स्थानांतरगमन के साथ मल्टीपल स्केलेरोसिस रोगियों का इलाज करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, भड़काऊ उपप्रकार सहित विभिन्न myopathies अभी भी केवल खराब तारीख करने के लिए इलाज रहते हैं । इसलिए, विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशी अन्तःचूचुक में चुनाव आयोग गुण का आविर्तन मायोपैथी या उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण में परिणाम के लिए उपलब्ध उपचार का विस्तार करने में मदद कर सकता है ।

अमर endothelial सेल लाइनों (iecl) स्थापित किया गया है और इन विट्रो मॉडल में कई के लिए इस्तेमाल किया । इन सेल लाइनों को अमर और तेजी से प्रसार के कारण प्राथमिक microvascular चुनाव आयोग की तुलना में कुछ लाभ प्रदान करते हैं । इसके अलावा, प्राथमिक सुसंस्कृत कोशिकाओं को एक समय या मार्ग के बाद उनके आकारिकी या शारीरिक कार्य को कम करने और खोने या बदल सकते हैं । हालांकि, आईईसीएल केवल कुछ एंडोथेलीयल सेल संपत्तियों को बनाए रखता है और विभिन्न अंगों-जनित प्राथमिक माइक्रोवैस्कुलर ईसी की विविधता के समान नहीं हो सकता है । नोट की, वे शायद ही कभी कंकाल की मांसपेशियों से प्राप्त कर रहे हैं । तिथि करने के लिए, केवल एक ही प्रकाशन एक मानव कंकाल माइक्रोवैस्कुलर endothelial सेल नाम TSM15 5लाइन का वर्णन है । इसके विपरीत, मुरीन माइक्रोवैस्कुलर ईसी अब तक वर्णित नहीं किया गया है । अंत में, ट्रांसजेनिक जानवरों से प्राथमिक कोशिकाओं को विट्रो मेंआनुवंशिक संशोधनों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं । हालांकि, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों भी कुछ नुकसान पकड़ । सबसे पहले, कोई ब्याज की कोशिकाओं के साथ संदूषण प्रयोगात्मक निष्कर्षों की वैधता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । इसलिए, कई चयन चरणों की सटीकता और पृथक कक्षों की एक उच्च शुद्धता की गारंटी होनी चाहिए । मांसपेशी ऊतक के वियोजन के बाद सेल निलंबन एरिथ्रोसाइट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं, उपग्रह कोशिकाओं, pericytes, फाइब्रोब्लास्ट और endothelial कोशिकाओं के रूप में अलग mononuclear सेल प्रकार शामिल हैं 7. इसलिए, CD31 mcs चरण के बाद सेल भिन्न विशेष रूप से मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं द्वारा व्यक्त मार्कर के लिए परीक्षण किया गया । उम्मीद के रूप में CD45- CD31- भिन्न और प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं ने पैक्स-7 और Cdh15 अभिव्यक्ति दिखाई, जबकि CD45- CD31+ और खेती की गई प्राथमिक मुरीन mmec एक दूसरे के बाद इन मार्कर के लिए नकारात्मक थे CD31 mcs कदम । इसके अलावा पृथक या संवर्धित कोशिकाओं की गुणवत्ता नियंत्रण अनिवार्य रूप से विश्वसनीय और पुनरुत्प्राप्य प्रयोगों की गारंटी है । प्राथमिक मूरीन mmec के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं: रूपात्मक गुणों की माइक्रोस्कोपी के अलावा, प्रवाह cytometry, पीसीआर और विशेषता ईसी मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (जैसे CD31, sca-1) इस्तेमाल किया जा सकता है । ताजा पृथक प्राथमिक मुरीन mmec की शुद्धता मूल्यांकन केवल 60-70% के बारे में था, जबकि के बारे में ७०% की व्यवहार्यता का पता लगाया जा सकता है । इन कोशिकाओं की सूक्ष्मदर्शी आंशिक रूप से कोशिका समूह को दर्शाती है, जो कि फाइब्रोब्लास्ट या ईसी से जुड़ी pericytes जैसे कोशिकाओं contaminating से मिलकर हो सकता है । 7 दिनों के बाद मुख्य रूप से फ्लैट और लम्बी कोशिकाओं और अंडाकार कोशिकाओं को देखा जा सकता है । हालांकि, दो CD31 mcs मार्ग उच्च व्यवहार्यता और शुद्धता के परिणामस्वरूप । puromycin युक्त मीडिया के रूप में शुद्धता बढ़ाने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण प्राथमिक मुरीन mmec में विफल रहा है जबकि murine मस्तिष्क microvascular ईसी 8में प्रभावी किया जा रहा.

के बाद से microvascular ईसी केशिकाओं एक्सप्रेस तंग जंक्शन प्रोटीन से व्युत्पंन, Cld5की जीन अभिव्यक्ति, ocln और प्राथमिक murine mmec में Tjp1 विभेदित मांसपेशी कोशिकाओं की तुलना में जांच की गई थी । के रूप में की उंमीद सभी तंग जंक्शन अणुओं प्राथमिक murine mmec में पाया गया । इसकी तुलना में, मांसपेशी कोशिकाओं Tjp1की केवल कम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन, जबकि Cld5 और ocln की कोई अभिव्यक्ति निर्धारित किया जा सकता है. इसी तरह की अभिव्यक्ति पैटर्न पहले पूरे murine कंकाल की मांसपेशी में प्रदर्शित किया गया । यहां, जीन और प्रोटीन के स्तर पर एक अभिव्यक्ति Tjp1 के लिए नहीं बल्कि 9occludin के लिए पता लगाया जा सकता है । transendothelial प्रतिरोध के रूप में आगे कार्यात्मक सुविधाओं मापा जा सकता है.

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल केवल मस्तिष्क मांसपेशी ऊतक से microvascular चुनाव आयोग के अलगाव सुविधाएँ. हालांकि, यह विभिंन अंय प्रजातियों के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है उदाहरण के लिए एक समान प्रोटोकॉल चूहा microvascular ईसी के लिए प्रकाशित किया गया था epididymal वसा पैड से व्युत्पंन । यहां, CD31 mcs के माध्यम से सकारात्मक चयन घनत्व ढाल केन्विगेशन द्वारा पहले किया गया था 10. इसी तरह के दृष्टिकोण चूहा ऊरु धमनियों 11से मैक्रोवैस्कुलर ईसी अलगाव में सफल रहे थे । दिल और फेफड़ों के ऊतकों के microvascular चुनाव आयोग को अलग करने के लिए एक हाल ही में प्रकाशित विधि CD31 और endoglin का उपयोग करता है (CD105) चुंबकीय सेल के लिए एंटीजन के रूप में 12छँटाई. हालांकि, चुनाव आयोग की पवित्रता अतिरिक्त CD105 चुंबकीय मनका जुदाई का उपयोग करके आगे नहीं बढ़ाया जा सकता है । एक और संभावना को अलग करने और शुद्ध प्राथमिक मूरीन mmec बहुरंगा प्रतिदीप्ति सेल छंटाई (facs) सक्रिय है । sca की एक अलग आबादी-1+, CD31+, CD34मंद और CD45- कोशिकाओं की मूरीन की मांसपेशियों से अलग किया जा सकता है और प्राथमिक murine mmec 13के रूप में विशेषता थी. इस विधि का एक लाभ एक शुद्ध चुनाव आयोग की आबादी है जो सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है या आगे के प्रयोग के लिए सभ्य (ध्यान दें कि हमारे अनुभव facs में वृद्धि सेल तनाव के कारण कोशिका मृत्यु की ओर जाता है) । इसके अलावा, मृत कोशिकाओं या अलग कोशिका प्रकार के कंपनियों काफी facs द्वारा अलग सेल संख्या को कम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यह सूचना दी है कि प्राथमिक facs द्वारा अलग mmec असफल 21% O2 और 5% सह2के सामांय रूप से इस्तेमाल किया संस्कृति की स्थिति में सुसंस्कृत थे । यहां ऑक्सीजन का स्तर 13के लिए पर्याप्त खेती के लिए 5% तक समायोजित किया जाना था । इसके अलावा, facs तकनीक अधिक जटिल है, समय लेने वाली और ढांचागत पूर्वावश्यकताएं महंगी हैं ।

मस्कुलस क्वाड्रीसेप्स फेमोर्स और 4-12 सप्ताह की उम्र में पुरुष चूहों के मस्क्यूलस triceps सुराए प्राथमिक murine mec के अलगाव के लिए सबसे उपयुक्त हैं के रूप में वे आसानी से सुलभ और पर्याप्त के अलगाव के लिए पर्याप्त बड़े हैं काफी सेल नंबर (5-10 x 105 प्रति ग्राम मांसपेशी). इसलिए, यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि स्थितियां स्वतंत्र प्रयोगों में तुलनीय हैं । जैसा कि ऊपर बताया गया है, प्राथमिक कोशिकाएँ संदीप्ति से गुजर सकती हैं । इसलिए, निम्न मार्ग में तुरंत संबंधित प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें । 8 बीतने के बाद-10 प्राथमिक murine mmec उनके morphology बदलने के लिए, धीमी गति से प्रसार दरों का प्रदर्शन और dedifferentiation और senescence के लिए संकेत के रूप में अपने संपर्क निषेध खो देते हैं ।

इसके अलावा इस प्रोटोकॉल के लिए समस्या निवारण के लिए कुछ नोट्स हैं । contaminations से बचने के लिए बाँझ काम करना आवश्यक है । गुणवत्ता नियंत्रण अलग कोशिकाओं की शुद्धता और व्यवहार्यता की निगरानी करने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सामग्रियों को संग्रहित करना चाहिए और निर्माता के निर्देशों के अनुसार लागू किया जाना चाहिए । इस्तेमाल किए गए जानवरों की अतिरिक्त, उम्र और सेक्स, साथ ही विभिन्न मांसपेशी समूह प्रयोगों में अलग-अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता और तुलनीयता को प्रभावित कर सकते हैं ।

वर्णित प्रोटोकॉल के रूप में माना जाना चाहिए मंच विधि कंकाल की मांसपेशियों के प्राथमिक microvascular चुनाव आयोग को अलग करने के लिए. अलग कोशिकाओं रक्त मांसपेशी बाधा समारोह में आगे अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कोशिकाओं दोनों प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कार्यात्मक assays (स्थानांतरगमन और आसंजन अध्ययन सहित) के लिए उपयुक्त हैं । हालांकि, इस प्रोटोकॉल भड़काऊ प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया था और इसलिए मामूली संशोधनों विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों के संबंध में आवश्यक हो सकता है.

mvu के भीतर जटिल स्थानिक और कार्यात्मक सेलुलर बातचीत मॉडल करने के लिए, प्राथमिक मुरीन mmec अन्य कोशिका प्रकार के साथ और अधिक जटिल 3 डी सेल संस्कृति प्रणालियों में खेती की जा सकती है. prospectively, यह भी mvu organoids उत्पंन संभव होना चाहिए के रूप में यह 14से पहले अंय ऊतकों के लिए वर्णित किया गया है । हालांकि, प्राथमिक मुरीन mmec के सफल अलगाव इस अगले कदम पर लक्ष्य के लिए अपरिहार्य है ।

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Disclosures

लेखकों को कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था "और kröner-फ्रेनिअस-stiftung" (2018_a03 करने के लिए TR), "अभिनव medizinische forschung अंतरराष्ट्रीय मुद्रा कोष () münster" (I-RU211811 से TR) और जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (dfg, 2105/27-1 inst, मुझे 3283/5-1, और मुझे 3283/6-1 sgm के लिए) । सचित्र heike blum द्वारा प्रदान की छवियां ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

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References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४५ कोशिका अलगाव मुरीन microvascular एंडोथीलियल कोशिकाओं कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं रक्त मांसपेशी बाधा मायोवैस्कुलर यूनिट मायोपैथी
प्राथमिक मुरीन कंकाल की मांसपेशी microvascular एंडोथीलियल कोशिकाओं के अलगाव
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Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

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