Summary

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

Published: March 06, 2019
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Summary

Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 “myovascular 단위”의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

Abstract

골격 근육의 모세 혈관 (근육 microvascular 내 피 세포, MMEC)의 내 피 세포 혈 류 감염에 대 한 면역 반응 뿐만 아니라 체액과 영양분의 교류를 통제 하는 골격 근육 사이 장벽을 구축합니다 면역 세포 이동 제어 하 여 대리인입니다. 이러한 기능에 대 한 MMEC 형성 기능 “myovascular 단위” (MVU), 더 세포 유형, 섬유 아 세포, pericytes 및 골격 근육 세포 등으로. 따라서, MMEC 및 MVU는의 역 기능 다양 한 myopathies에 기여 한다. 그러나, 건강과 질병에 있는 MMEC의 규제 메커니즘 충분 이해 남아 있고 그들의 설명 앞 myopathies에 대 한 좀 더 구체적인 치료. 분리와 기본 MMEC 함수는 MVU의 맥락에서의 심층 조사 이러한 프로세스의 더 나은 이해를 용이 하 게 수 있습니다.

이 문서는 골격 근육의 기본 murine MMEC 정화 및 문화 유지 보수 단계를 포함 하 여 기계 및 효소 분리 하 여 격리 프로토콜을 제공 합니다.

Introduction

혈 류를 통해 , 세포와 장기 산소, 기판 및 다른 필요한 분자와 함께 제공 됩니다. 이 교환 모 세관, 작은 혈관에서에서 일어난다. 모 세관 내부 내 피 세포 (EC) 층이 누구의 무결성 유지 혈관 내 고 중간 공간 사이의 근육 항상성의 성공적인 규제에 조건 형성 된다. 수용 성 요소와 세포의 선택적 전환할 수 있도록, EC 꽉 연결 되어 단층 및 외화 접속점 1을 구성 합니다. 영양소 또는 대사 제품에 대 한 장벽으로 서의 역할 외 EC 염증 과정에서 백혈구의 채용을 통제 한다. 염증이 나 조직 손상 접착 분자의 최대 규정 EC 표면에 발산 촉진 백혈구 첨부 파일 및 대상 조직 2로 환생의 생산 리드. 따라서, EC 비판적으로 병원 체 또는 조직 복구에 대 한 방어와 같은 염증 성 프로세스의 규칙에서 포함 된다.

EC의 장애는 직접 관련 혈관 질환, 만성 신부전, 정 맥 혈전 증 심한 병원 체 감염 된. 또한, EC는 거의 항상 당뇨병 mellitus 또는 다 발성 경화 증 3같은 기관 특정 면역에 관여 하 고. 혈 류 및 기관 사이의 장벽 기능 따라서 다른 종류의 공동된 작용에 의해 제어 됩니다. 골격 근육 microvascular 내 피 세포 (MMEC) 근육 세포와 섬유 아 세포와 pericytes 형성 기능 단위, “myovascular 단위” (MVU). 따라서,는 MVU의 부전 myopathies의 이상에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 그러나, 이러한 규제 메커니즘에 대 한 깊은 이해는 여전히 누락 이며 현재 myopathies에 새로운, 긴급 하 게 필요한, 치료 대상의 식별을 방해.

복잡 한 생리 적 및 병 태 생리 기계 장치를 조사, 동물 모델은 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 생체 외에서 모델 제외 혼동 요인의 다양 한 관심 주제에 초점을 이점을 제공 합니다. 프로세스를 조사 하기 위해 생체 외에서 그것은 순수 하 고 가능한 1 차 셀을 분리 하는 데 필요한입니다. 셀 라인, 달리 1 차 셀 유전자 변형 동물에서 분리 가능 유전 수정은 체 외의 결과 조사

여기, 뒤에 자석 활성화 된 셀 정렬 기법 (MCS) 정화 기계 및 효소 분리를 사용 하 여 기본 murine MMEC를 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적을 위해 특정 표면 표식에 대 한 자석 구슬 사용 됩니다. 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자-1 (PECAM1, CD31)은 주로 EC에 표현 하 고이 셀 종류를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 높은 셀 순도 보증 하기 위하여 원래 조 혈 모 세포 (PTPRC, CD45) 단백질 티로신 인산 가수분해 효소 수용 체 유형 C에 대 한 부정적인 선택에 의해 제외 됩니다. 또한, 품질 컨트롤, 기본 murine MMEC, 잠재적인 응용 프로그램 제한 뿐만 아니라 특별 한 고려의 재배 되 게 됩니다.

Protocol

모든 동물 실험 했다 지방 기관에 의해 승인 및 독일 동물 복지 법 (84-02.05.20.13.097) 실시. 1. 일반 발언 동물 실험에 각 기관 동물 관리의 지침에 따라 모든 마우스 실험을 수행 하 고 위원회를 사용 하 여. 마우스 및 실험실 동물 과학 협회 (FELASA)에 대 한 연맹 같은 국제 지침에 따라 표준화 된 조건에서 유지.참고: 일반적으로이 절연 기술은 마우스…

Representative Results

절연, 기본 murine MMEC 및 잔여 후에 1 일 다른 셀 대기업을 형성 하며 문화 요리 (그림 1A 주 1)의 하단을 준수 합니다. 제 7 일에,에서 평평 하 고 길쭉한 세포를 관찰할 수 있습니다. 그러나, 다른 사람, 주로 회전 타원 체 세포의 오염 여전히 표시 됩니다 (그림 1A 주 7). 따라서, CD31 긍정적인 선택을 통해 MCS가 필요의 다른 주?…

Discussion

Microvascular 내 피 세포는 모든 조직에 장벽 기능과 관련된 장기 3의 질병에 그들의 기능 장애 결과 제공합니다. 또한, microvascular EC의 기관 특정 연구 새로운 치료 전략에 대 한 방법을 포장 수 있습니다. 따라서, microvascular EC 기능 생리 및 병 태 생리 조건 하에서 깊은 이해 큰 과학적인 관심입니다. 백혈구/endothelium 상호 작용의 모듈레이션 natalizumab, 림프 구 접착을 방지 하는 항 체?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품으로는 “다른 Kröner-Fresenius-재단”을 지원 했다 (2018_A03 TR), “혁신적인 Medizinische Forschung (IMF) Münster” (나-RU211811 TR에)와 독일 연구 재단 (DFG, INST 2105/27-1, 나 3283/5-1, 그리고 나 3283/6-1 SGM). 일러스트 이미지가 케 블 룸에서 제공 합니다.

Materials

0,25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

References

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Cite This Article
Müntefering, T., Michels, A. P., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

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