Summary
Her presenterer vi forenklet metoder for fabrikasjon gjennomsiktig nevrovaskulære fantomer og karakterisere flyten der. Vi markere flere viktige parametere og demonstrere deres forhold til feltet nøyaktighet.
Abstract
Partikkel bilde velocimetry (PIV) brukes i en rekke felt, på grunn av muligheten den gir nøyaktig visualisere og kvantifisere flyter over et stort spatiotemporal spekter. Men krever gjennomføringen vanligvis bruk av dyre og spesialiserte instrumentering, som begrenser nytteverdien bredere. Videre innen bioteknologi, i vitro flyt visualisering studier er også ofte videre begrenset av de høye kostnadene ved kommersielt Hentet vev phantoms som recapitulate ønsket anatomiske strukturer, spesielt for de som span mesoscale regimet (dvs., submillimeter i millimeter lengde skaleringer). Her presenterer vi en forenklet eksperimentelle protokoll utviklet for å håndtere disse begrensningene, de viktigste elementene som inneholder 1) en relativt rimelig metode for fabrikasjon mesoscale vev fantomer 3D utskrift og silikon støping, og 2) en åpen kildekode image bearbeiding ramme som reduserer etterspørsel på instrumenter for å måle mesoscale renn (dvs, hastigheter opp til ti millimeter/sekund). Samlet senker dette barrieren til oppføring på nonexperts, ved å utnytte ressursene som allerede mange bioteknologi forskere. Vi demonstratethe anvendelse av denne protokollen innen rammen av nevrovaskulære flyt karakterisering; men er det forventet å være relevante til et bredere utvalg av mesoscale programmer i bioteknologi og utover.
Introduction
PIV er mye brukt i eksperimentell væske mekanikk for flyt visualisering og kvantitative undersøkelser av jevne bevegelser som varierer i lengde skala fra atmosfærisk microcirculatory renn1,2,3. Mens spesifikk av gjennomføringen kan variere så vidt som sin programmer, er et aspekt felles for nesten alle PIV studier bruk av video tenkelig tracer partikler seeded innen arbeider væsken, etterfulgt av en pair-wise analyse av påfølgende rammer trekke ut ønsket flyt. Vanligvis gjøres dette ved første subdividing hvert bilde i mindre regioner kalt avhør windows. Av tilfeldig plasseringen av spredt partikler inneholder hver avhør-vinduet en unik fordeling av pixel intensiteter. Hvis vinduet størrelse og data oppkjøpet prisen blir valgt riktig, kan cross-korrelasjon av intensitet signalet i hvert vindu brukes til å beregne gjennomsnittlig forskyvning i regionen. Til slutt, gitt at forstørrelsen og bildefrekvens er kjent eksperimentelle parametere, en øyeblikkelig hastighet vektor feltet kan lett beregnes.
En stor fordel med PIV over ett-punkts måling teknikker er dens evne til å tilordne vektorfelt over et to - eller tre - dimensjonale domene. Hemodynamic programmer, spesielt har dratt nytte av denne funksjonen, siden det gir en grundig undersøkelse av lokale renn, som er kjent for å spille en betydelig rolle i vaskulær sykdom eller remodeling (f.eks, atherosclerosis, angiogenese) 4 , 5 , 6. Dette er også sant for vurdering av nevrovaskulære flyter, og samspillet av med endovascular enheter (f.eksflyt avledere stents, intrasaccular spoler), siden relevante lengde-vekter i slike programmer kan går over ofte én eller flere størrelsesordener (f.eksfra mikrometer å millimeter) og enheten geometri og plassering kan betydelig påvirke det lokale væske mekanikk7.
De fleste grupper gjennomføre PIV-baserte hemodynamic studier har stolt på eksperimentell set-ups som nærmere etterligner noen av tidligste undersøkelser stent innflytelse på vaskulær flyt7,8. Vanligvis disse inkluderer en) pulserende lasere og høyhastighets kameraer, å fange høy hastighet renn; b) synkroniseringsenheter, for å hindre aliasing mellom puls frekvensen av laser og kameraet oppkjøpet Rammehastigheten; c) sylindriske optikk, å danne et lys ark, og dermed redusere bakgrunnen fluorescens fra tracer partikler over og under forhør flyet; d) i tilfelle av kommersielle nøkkelferdige systemer, proprietær programvarepakker å utføre cross-korrelasjon-analyser. Men mens noen programmer krever ytelse og/eller allsidighet kollektivt by av disse komponentene, mange andre ikke. Videre de høye kostnadene av kommersielt Hentet vev phantoms som recapitulate ønsket vaskulære strukturer kan også bevise begrense for mange i vitro studier, spesielt for fantomer med har denne broen mesoscale regimet (> 500 USD / Phantom). Her rapporterer vi utviklingen av en forenklet protokoll for implementering PIV for i vitro visualisering nevrovaskulære flyter, som vanligvis ligger begge romlig og timelig mesoscale regimet (dvs.lengde skalaer spenner fra submillimeter til millimeter og hastigheter opptil ti millimeter/sekund). Protokollen søker å utnytte ressursene som allerede mange bioteknologi forskere, således nedsetter barrieren til oppføring for nonexperts.
Det første elementet i denne protokollen innebærer bruk av en investering støping teknikk å aktivere huset fabrikasjon av gjennomsiktig, polydimethylsiloxane (PDMS)-basert vev fantomer fra 3-D-trykt oppofrende former. Ved å utnytte den økende tilgjengeligheten av 3D-skrivere de siste årene, spesielt de i delte/multi-End-User fasiliteter (f.eks, institusjonelle fasiliteter eller offentlig makerspaces), denne metoden reduserer kostnadene betydelig (f.eks< 100 USD/phantom i tilfellet her), mens en rask behandlingstid til fabrikasjon av et bredt utvalg av design og geometri. I den gjeldende protokollen, en smeltet deponering modellering systemet brukes med akrylonitril butadien styren (ABS) som byggematerialet og den utskrevne delen fungerer som en oppofrende mold for påfølgende phantom støping. Vår erfaring har vist at ABS er godt egnet til slik bruk siden det er løselig i vanlige løsemidler (f.eks, aceton), og det har nok styrke og stivhet å opprettholde mold integritet etter fjerning av støtte materiale (f.eks, til hindre deformasjon eller brudd av diminutiv mold). I gjeldende protokollen, er mold integritet ytterligere sikret med solid trykte modeller, selv om dette kommer på bekostning av økt oppløsning tid. Bruk av hul modeller kan også være mulig i noen tilfeller, å forbedre løsemiddel tilgang og dermed redusere oppløsningen. Imidlertid nøye vurdere effekt dette kan ha på mold integritet. Til slutt, mens fantomer fabrikkert her er basert på idealiserte representasjoner av nevrovaskulære strukturer generert ved hjelp av en vanlig programvarepakke for dataassistert konstruksjon (CAD), protokollen er forventet å være mottakelig for fabrikasjon av mer komplekse , pasient-spesifikke geometrier også (f.eks via bruk av modell filer generert av konvertering av kliniske bildebehandling data til den. STL-filformatet som brukes av de fleste 3D-skrivere). Ytterligere detaljer om phantom fabrikasjon prosessen er gitt i § 2 i protokollen.
Det andre elementet i protokollen innebærer bruk av en åpen-kildekode plug-in for ImageJ å utføre cross-korrelasjon analyser9. Dette er kombinert med implementering av en enkel statistisk terskelverdi ordningen (dvs., intensitet capping)10 å forbedre bildet signal før kryss-sammenheng, samt en postcorrelation vektor validering ordningen, den normaliserte Median test (NMT), å eliminere falske vektorer gjennom en sammenligning av sine nærmeste naboer11. Kollektivt, kan å være dyktig til å bruke utstyr som vanligvis finnes i mange bioteknologi laboratorier, dermed eliminere behovet for oppkjøpet av mange av de kostbare komponentene av typiske PIV systemer (f.eks, pulsed laser, Synkroniseringsenheten, sylindriske optikk og proprietær programvare). Ytterligere detaljer angående videosamlingen, bildebehandling og analyse er gitt i avsnitt 5 og 6 av protokollen.
Figur 1 illustrerer PIV-oppsett som brukes i denne protokollen, som avhenger fluorescens mikroskop utstyrt med et høyhastighets kamera for bildebehandling, og en ekstern, kontinuerlig hvitt lys kilde (dvs., metall metallhalid lampe) for gjennom objektive volumetrisk belysning. En variabel-trinns gear pumpe brukes å innføre resirkulerende flyten av en gjennomsiktig narr blod løsning gjennom nevrovaskulære vev fantomer. Løsningen består av en 60: 40 blanding av deionisert (DI) vann og glyserol, som er en vanlig erstatning for blod i hemodynamic studier12,13,14, skyldes en) den samme tetthet og viskositet (dvs. 1,080 kg/m3 og 3,5 cP vs 1050 kg/m3 og 3-5 cP for blod)15,16; b) sin åpenhet i det synlige området; c) det lignende brytningsindeks som PDMS (1,38 vs 1.42 for PDMS)17,18,19,20, som minimerer optisk forvrengning; d) enkel som ikke-newtonsk atferd kan innføres, eventuelt via tillegg av xanthane21. Til slutt, fluorescerende polystyren perler brukes som tracer partikler (10.3 µm i diameter, 480 nm/501 nm eksitasjon/utslipp). Mens nøytralt oppe perler er ønskelig, kan sourcing tracer partikler med optimal væske mekaniske egenskaper (f.eks, tetthet, størrelse, sammensetning) og utslipp bølgelengde være utfordrende. For eksempel, er perler brukt her litt mindre tett enn glyserol løsningen (1050 kg/m3 vs 1,080 kg/m3). Men etter effekten, derav, er ubetydelig, gitt at varigheten av en typisk eksperiment er langt kortere enn tidsskalaen tilknyttet oppdrift effekter (dvs., 5 min og 20 min, henholdsvis). Ytterligere er detaljer om mock blod løsning formulering og i vitro sirkulasjonssystemet opplegget gitt i avsnitt 3 og 4 av protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ABS-baserte oppofrende Mold fabrikasjon
- Utforme en omvendt modell av ønsket vev phantom bruker CAD-programvare.
- Skrive ut modellen med en 3D-skriver med ABS som byggematerialet.
2. PDMS-baserte vaskulær Phantom fabrikasjon
-
Miksing
- Bland PDMS prepolymer base og herding agent i en 10:1-forhold (av vekt); en 66 g blanding gir tilstrekkelig materiell til fabrikasjon av fantomer med volumer opptil 50 cm3.
- Sett blandingen i et vakuum desiccator for 60 min å degas og minimere boble entrapment. Bruke sykliske pressurization/depressurization for å forenkle boble brudd.
-
Støping
- Montere trykte ABS mold på et glass lysbilde bruker molding putty for å forsegle grensesnittet.
- Nøye hell PDMS blandingen i formen under forsøk på å minimere boble entrapment. Langvarig bobler kan være manuelt utløst bruker en nål.
- Kur kastet phantom ved romtemperatur (25 ° C) for minst 24 timer.
Merk: Ved høyere temperaturer-denne prosessen kan være akselerert22.
-
Demolding
- Oppløse ABS av submerging phantom i aceton og sonicating i minst 15 min, bruker krefter opp til 70 W.
FORSIKTIG: Aceton har en høy Damptrykk ved romtemperatur og en lav flammepunktet. Derfor alltid arbeide under avtrekksvifte og fra potensielle antennelseskilder. Bruke riktig personlig verneutstyr (f.eks, vernebriller eller ansikt skjold, laboratoriefrakk, aceton-motstandsdyktige hansker). - Rense phantom med isopropyl alkohol og da DI vann for å fjerne løsemiddel rester.
Merk: PDMS sveller ved eksponering til aceton; imidlertid avtar hevelse når phantom er skylt og tørket tilstrekkelig23.
- Oppløse ABS av submerging phantom i aceton og sonicating i minst 15 min, bruker krefter opp til 70 W.
-
Bekreftelse av phantom gjengivelse bruker optisk mikroskopi
- Bruker en optisk mikroskop med et tilkoblet kamera og fange programvare, lage en avbildning av en viktig funksjon i phantom under en forstørrelse som maksimerer funksjonen i synsfeltet.
- Ta et bilde av en riktig kalibrering reticle på samme forstørrelse.
- Laste inn både bilder i ImageJ ved å dra dem til verktøylinjen.
- Klikk på kalibrering reticle bildet å aktivere den og velg linjeverktøyet . Ved hjelp av musen, tegne langs en funksjon i en kjent distanse og velg analyser > Angi skala menyen ImageJ.
Merk: I vinduet Angi skala feltet avstanden i piksler bør være forhåndsutfylt med lengden på tegnet linjen i enheter av piksler. - Angi lengden på funksjonen i feltet Kjent avstandog sin enhet i feltet Enhet i lengde. Kontroller boksen Global for å bruke denne kalibreringsfaktoren alle åpne bilder.
- Aktivere bildet av phantom kritiske funksjonen og bruk linjeverktøyet til å tegne en linje langs en funksjon av interesse. ImageJ menyen, velg analyser > mål (eller trykk Ctrl + M) til å måle lengden på linjen.
- Sammenligne forventet verdi mot verdien i kolonnen merket lengde i resultatvinduet for å bekrefte phantom gjengivelse.
3. håne blod løsning formulering
- Bland DI vann og glyserol i 60: 40 forholdet (volumprosent).
Merk: Et 100 mL volum er tilstrekkelig for i vitro sirkulasjonssystemet beskrevet her. - Legge 1 mL 2,5% w/v fluorescerende polystyren perle løsning (dvs., tracer partikler) til narr blod løsningen.
- Homogenize blandingen på en magnetic røre plate på 400 rpm for 10 min.
4. in Vitro sirkulasjonssystemet oppsett
-
Pumpe oppsett
- Bruk en wire stripper verktøyet for å kutte av DC-end pluggen fra AC-til-DC kortet strømkilden.
- Fjerne belegget av strømmen og bakken ledninger og koble dem til inndataterminal av pulse width modulation (PWM) spenningsregulator.
- Koble strøm og bakken ledningene fra pumpens DC motor til utgang terminalen av spenningsregulator PWM.
Merk: PWM'S seven segment display utganger driftssyklus (0% - 100%) brukes for å oppnå en variabel spenning til den DC motoren.
-
Pumpe kalibrering
- Forberede 200 mL narr blod løsning (se avsnitt 3).
- Plassere rør fra pumpen inntaket begeret holder narr blod løsningen.
- Plasser slangen uttaket pumpen til en tom kanne.
- Velg et ønsket plikt syklus angitt tidspunkt (0% - 100%). Trykk på , og starter en tidtaker.
- Opphøre stopuret når pumpen har overført hele volumet av uekte blod løsning. Bruk denne tiden til å beregne volumetriske flow rate.
- Gjenta trinn 4.2.1 - 4.2.5 for minst fem forskjellige plikt syklus sett poeng å etablere en minste kvadrater regresjon kurve.
Merk: Minimum tre Repliker poeng per plikt syklus settpunkt anbefales. Dette forholdet kan brukes til å relatere ønsket infusjonshastigheten til den nødvendige PWM driftssyklus.
5. video samling
-
Bildet kalibrering
- Finn kalibrering forholdet for video avbilding (se avsnitt 2).
-
Apparatet oppsett
- Plass PDMS phantom på scenen av fluorescens mikroskopet.
- Phantom tilkobles utstyr pumpen og introdusere narr blod løsningen.
Merk: Hvis prefill modellen med etanol å lette full wetting; deretter tømme og fylle den med uekte blod løsningen. Dette kan være spesielt fordelaktig for modeller med mindre fartøyer og/eller blind funksjoner. - Sette pumpen motor kontrolleren for ønsket infusjonshastigheten basert på kalibreringskurven pumpen.
- Kjøre pumpen for 1-5 minutter før å sikre stabil forhold.
- Slå på ekstern lampen å belyse synsfelt. Velg en passende filter basert på eksitasjon Bølgelengden av fluorescerende perler.
- Justere tenkelig fokalplanet til fartøyet midtplanet.
Merk: Dette kan oppnås ved hjelp av en brennvidde som maksimerer fotografert fartøyet tverrsnittet (f.eksved fantomer med sirkulære fartøy tverrsnitt); og/eller indeksering av en fantom funksjon utformet for å lette identifikasjon av fartøyet midtplanet.
-
Videoinnspilling
- Velg parameterne videoopptak å optimalisere signal-til-støy-forhold (SNR). Nøkkelparameterne inkluderer eksponeringstid, bildefrekvens, og få.
Merk: I denne protokollen bruker vi en bildefrekvens på 2000 fps og en gevinst på 1.0. Parameterne kan imidlertid variere basert på programmet (se drøftingen for mer informasjon). - Samle videoen og lagre den i AVI-format.
- Velg parameterne videoopptak å optimalisere signal-til-støy-forhold (SNR). Nøkkelparameterne inkluderer eksponeringstid, bildefrekvens, og få.
-
Phantom opprydding
- Hvis perle-stikkende er observert etter et eksperiment, sonicate phantom i en vandig såpevann med krefter opp til 70 W.
6. image bearbeiding og dataanalyse
-
Bilde forbehandling
- Dra den lagrede AVI-filen til vinduet ImageJ importere den. Merk merket konvertere til gråtoner.
- ImageJ menyen, velg analyser > generere histogrammet (eller trykk Ctrl + H) til å generere et histogram for bildet pixel intensiteter. Ta note av midlere og standardavvik for ubehandlede bildet.
Merk: På høy bildefrekvens, det er ikke uvanlig for distribusjon kan bli skråstilt sterkt mot null (dvs., ingen signal). - ImageJ menyen, velg bilde > Juster > lysstyrke og kontrast (eller trykk Skift + Ctrl + H) å bruke filtere lysstyrke/kontrast.
- På menyen lysstyrke og kontrast trykk Angi å definere bilde grensene. Angi minimumsverdien middelverdien pluss ett standardavvik og maksimumsverdien skal den maksimale intensiteten av bildet (begge basert på statistikken innhentet i trinn 6.1.2).
Merk: Dette vanligvis eliminerer alle, men de 10% av pixel intensiteten. Antall standardavvik kan variere avhengig av ønsket fordeling av pixel intensiteten. En egendefinert makro-skript for å utføre intensiteten capping operasjonen tilbys i Tilleggsresultater materialer. - ImageJ menyen, velg prosessen > støy > flekkfjerning å redusere mettet pikselantallet.
Merk: Operasjonen er grunn av økt potensialet for pixel metning som oppstår under optimalisering av lysstyrke og kontrast, som kan produsere falske vektorer under påfølgende kryss-sammenheng. - ImageJ menyen, velg prosessen > filtre > Gaussian Blur med en radius på 1,5 å redusere gjenstander som oppstår fra sporadisk fjerning av opplyst piksler i 3 x 3 nabolaget av den tidligere despeckling operasjon.
- Klikk på Polygon -verktøyet, og klikk på bildet for å skissere regionen rundt (ROI).
- ImageJ menyen, velg Rediger > Fjern utenfor fjerne sensor støy på steder der ingen signal er forventet (f.eksområder utenfor fartøyet veggen grensen), som kan redusere de samlede SNR.
-
PIV beregning
Merk: Denne delen av protokollen bruker en tredjeparts PIV plug-in for ImageJ, som avhenger Gaussian topp-utrustning å aktivere en vurdering av forskyvning med underpiksel nøyaktighet.- ImageJ menyen, velg Plugins > makroer > kjøre... og naviger til makroen lagrede Utdypende kode 2. ijjm til kryss-relatere etterfølgende bildet parene.
Merk: Makroen fortsetter som følger. 1) en cross-sammenheng i feltet intensiteten i påfølgende bilder utføres først for å finne lokale forskyvning av advected tracer partikler (dvs., det første bildet par består av første og andre bilder, den andre par består av det andre og tredje bilder, etc.). 2) en totrinns multipass evaluering utføres deretter i innledende og avsluttende avhør vindusstørrelser 256 x 256 piksler og 128 x 128 piksler, henholdsvis. Til slutt, 3) makroen utfører en timelig gjennomsnitt for ytterligere å redusere fremkomsten av falske vektorer.
- ImageJ menyen, velg Plugins > makroer > kjøre... og naviger til makroen lagrede Utdypende kode 2. ijjm til kryss-relatere etterfølgende bildet parene.
-
Normalisert median test (NMT)
- ImageJ menyen, velg Plugins > makroer > kjøre... og naviger til makroen lagrede Utdypende kode 3. ijjm å godkjenne den hastighet felt via normalisert median testen.
Merk: Makroen fortsetter som følger. 1) hver vektor i en øyeblikkelig vektor-feltet sammenlignes først sine åtte nærmeste naboer til å beregne medianverdien. 2) rekke gjenværende feil beregnes som differansen mellom hver nærliggende vektor og beregnede medianen. 3) forskjellen mellom vektoren under etterforskning og nærliggende vektor medianverdien er deretter normalisert av medianen for resterende. 4) Dette er deretter sammenlignet med en terskelverdi (vanligvis 0,2 piksler), som kan varieres basert på en priori kunnskap om støy under bilde oppkjøpet. Til slutt, 5) et timelige gjennomsnitt av alle godkjente øyeblikkelig vektorfelt utføres for å produsere en sammensatt feltet som dette har vist seg å øke vektor feltet kvalitet24.
- ImageJ menyen, velg Plugins > makroer > kjøre... og naviger til makroen lagrede Utdypende kode 3. ijjm å godkjenne den hastighet felt via normalisert median testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser PDMS vev phantom fabrikasjon prosessen. Fantomer designet her er ment for studier av flyt i idealiserte wide-necked, saccular, intrakranielt aneurismer, samt proksimale branching perforator arterier. Viktig ekstra design inkluderer 1) en felles reservoaret som alle fartøy avløp i å sikre ubeheftet væske egress fra phantom - ellers slippverktøy formasjon kan oppstå på mindre fartøy utsalgssteder; 2) en boble felle, å lette boble fjerning; 3) en ytre hulrom vegg, å sikre parallellitet fartøy med horisontalplanet og en nøyaktig definisjon av de siste phantom skive høyde, lengde og bredde; 4) bruken av en 21 G sprøyte nål skaft (820 µm nominell ytre diameter) for støping av arteria perforator, på grunn av våre skriverens manglende evne til å definere funksjoner med tilstrekkelig gjengivelse. Trofast gjengivelse av alle utformingsfunksjoner observeres under.
Representant resultatene av PIV-baserte flyt karakteristikk utført ved hjelp av gjeldende protokollen presenteres i Figur 3 og Figur 4. Disse studiene ble utført med phantom innløp strømningshastigheter på 100 mL/min, oppkjøp datahastighet på 2000 fps, og en timelig gjennomsnitt over spenn 0,05 s. Figur 3 viser representant rammer innenfor arteria perforator før og etter intensitet capping, samt tilsvarende overflaten tomter intensitetsverdiene 8-bit pixel. Begge viser at intensitet capping øker peak definisjonen ovenfor støy gulvet (dvs., øker SNR), som er avgjørende for å sikre nøyaktighet når du utfører etterfølgende kryss-sammenheng. Figur 4 viser effekten av intensitet capping og NMT operasjoner på hastighet vektor feltet. Markert forbedring i feltet ensartethet er observert, dermed ytterligere understreker viktigheten av å maksimere SNR for å minimere data frafall.
Figur 1 : Partikkel bilde velocimetry oppsett. Tillit til en åpen kildekode bildeanalyse og en forhåndspåloggings/postprosessering ramme reduserer etterspørsel på instrumenter for å måle mesoscale flyter, dermed eliminere behovet for mange dyre komponentene i typisk PIV systemer (f.ekspulserende laser, samtidighet, sylindriske optikk, eller proprietær programvare). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : PDMS-baserte vev phantom fabrikasjon prosessen. Bildene illustrerer (en) en CAD-modell av nevrovaskulære phantom mold, (b) trykt ABS mold etter fjerning av støtte materialet, (c) støping og herding av PDMS i ABS mold, (d) delvis oppløsning av ABS mold materiale og (e) til ferdigutfylte PDMS phantom, med innfelt viser de endelige dimensjonene av kritiske funksjoner og regionen (ROI) interesse arteria perforator hvor PIV målingene ble gjort. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Effekten av intensiteten capping operasjon på bildet SNR. Disse skjermbildene viser representant rammer og den tilsvarende pikselen intensitet overflaten tomter i perforator arterien, (en og b) før og (c og d) etter at intensiteten capping operasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Effekter av intensitet capping og NMT operasjoner på hastighet vektor felt. Disse panelene illustrere representant øyeblikkelig hastighet vektor feltet i arteria perforator avledet fra (en) ubehandlet bildedata, (b) intensitet snødekte data, og (c) intensitet snødekte data + NMT postprosessering . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Effekten av avhør vindu størrelse på sammenheng kvalitet. Optimal vindu størrelse forekommer når verdien til null-normalisert korrelasjonskoeffisienten er maksimert, og standardavviket er minimert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her skisserer en forenklet metode for å utføre PIV studier for å visualisere nevrovaskulære renner fysiologisk relevante dimensjonene og flyt forhold i vitro. Dermed tjener det til å utfylle protokoller rapportert av andre som har også fokusert på å forenkle kvantifiseringen på vektorfelt, men innenfor svært forskjellige sammenhenger som krever vurdering av langt større lengde skalerer25 eller nederste priser26,27 (f.eks, atmosfæriske eller microcirculatory flyter) og dermed med stoler på ordninger som er inkompatible med gjeldende program.
De viktigste hensyn for vellykket implementering av PIV ligger i minimering av flyt feltet gjenstander og maksimere bildekvaliteten. Flere trinn i vev phantom fabrikasjon prosessen er avgjørende for begge disse kriteriene. For eksempel er grundig avgassing avgjørende siden luft som er entrained innen PDMS under blanding kan føre til boble dannes i siste phantom, som kan påvirke både funksjonen gjengivelse og optisk klarhet. I tillegg minimering av overflateruhet av ABS mold er ønskelig, siden PDMS Støpeprosessen gjengir selv de mest minutt feil (f.eks, bygge linjer, overflate porene, riper), dermed resulterer i overflateruhet i siste phantom som kan redusere optisk klarhet og øke muligheten for perle akkumulering. Mens protokollen beskrevet her har vist tilstrekkelig for det gjeldende programmet, det finnes utallige rapporter i litteraturen om til å redusere slik ruhet, bør det være noe behov (f.eks, aceton damp utjevning28 eller optimalisering av lag tykkelse og del orientering forhold bygning retning)29.
Parameteren utvalget for videoopptak er også avgjørende for å sikre en høy kvalitet vektor feltet. En optimal SNR oppnås vanligvis på høyeste oppnåelige bildefrekvensen som gir tilstrekkelig perle eksponering (maksimal Rammehastigheten blir begrenset av minimum eksponeringstid). Gevinst kan brukes til å forsterke signalet, men dette øker også sensor støy. Hvis den maksimale hastigheten kan estimeres fra andre flytparametrene (f.eks, vik volumetriske flyten sats), deretter bestemmes en nedre grense for nødvendige Rammehastigheten ved hjelp følgende forhold30.
(1)
Her, fprøvetaking er kameraet oppkjøpet frekvens (Hz), v-max er maksimal forventet hastigheten (mm/s), ckalibrering er kalibrering konstant (piksler/mm) og havhør vindu er størrelsen på vinduet avhør (piksler). Imidlertid kan optimale verdier bestemmes ved hjelp av såkalte korrelasjon kvalitet beregningsmetoder, for eksempel null-normalisert korrelasjonskoeffisienten11. I denne teknikken, gjennomsnitt av komplementære signaler fra hver ramme par trekkes først og deretter normalisert av standardavviket for deres intensiteter11. Hvis en forskyvning av originale signalet eksisterer, slik at alle topper og daler, vil tid flyttet verdien av signalet være lik én. Hvis ingen forskyvning som kan justere disse signaler, vil derimot verdien være null. Denne informasjonen er inkludert i ImageJ PIV utdata for hver vektor, og det kan tegnes som et eget felt til å kontrollere om det finnes romlige effekter som bidrar til dårlig sammenheng (f.eksujevn belysning). Korrelasjonskoeffisienten kan også være gjennomsnitt over et felt som et generelt estimat av kvaliteten. Til slutt, dette antallet kan også tegnes mot forskjellige bildefrekvenser eller avhør vindusstørrelser å bestemme en optimal. Figur 5 illustrerer resultatene fra slik analyse bruker en Monte Carlo-syntetisert partikkel-feltet med forskyvninger konsekvent med våre eksperimentelt målt flyter (en vanlig teknikk for å karakterisere korrelasjon kvalitet11 ). Resultatene viser at den avhør vindu størrelse og rammen rate bør velges slik at en partikkel-feltet er erstattet av ≤ 20% av størrelsen på avhør per ramme par å maksimere korrelasjonskoeffisienten samtidig minimere sin variasjon.
Selv om protokollen beskrevet her har vist tilstrekkelig for å møte behovene til det aktive programmet, er det viktig å erkjenne sine begrensninger. For eksempel, mens kontrast ekstrautstyr via intensitet capping tilbyr enkle implementering, kan transformasjoner av hele fordelingen av pixel intensiteter forbedre de SNR ytterligere31. På samme måte, selv om sammenhengen-baserte sporing er godt etablert og har god nok oppløsning for pålitelig beregning av første orden flyt relevant for hemodynamics (f.eks, intra-aneurisme hastighet), andre teknikker kan tilby høyere romlig oppløsning (f.ekshybrid PIV/PTV, minste kvadrater matchende)32,33 , og dermed større nøyaktighet når egenskaper som er mer følsomme for hastighet feltet oppløsningen (f.eks , vegg skjæring stress, i-flyet vorticity). Mens NMT gir et middel for å forbedre hastigheten vektor feltet etter kryss-sammenheng, er det viktig å understreke at dette er bare ett av mange vektor validering teknikker som kunne brukes24,34, hver med sine egne unike fordeler og ulemper som kan gjøre bruken mer egnet for programmer utover de beskrevet her. Til slutt, mens den eksperimentelle set-up beskrevet her søker å etterligne fysiologisk relevante flyt priser og lengde skalaer for neurovasculature, ikke tiden tillater analyse av pulsatile renner. Dette er ikke en begrensning for det gjeldende programmet, siden området av Womersley tallene i mye av neurovasculature tendens til å være ≤ 1 (dvs.det er en minimal additiv effekt av flere cardiac sykluser)35, noe som tyder på at stabil er tilstrekkelig til å recapitulate diskret tidspunkt langs cardiac bølgeform der infusjonshastigheten er sammenlignbare. Men for applikasjoner der hvor Womersley er større (f.eksblodkar nærmere til hjertet), vi ser et potensial for å innføre pulsatility gjennom bruk av en Arduino, som kan brukes til å sende pumpen en tid-varierende PWM spenning bølgeform som kan etterligne et hjerte flyt profil36,37,38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å fortolle.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter delvis støtte til dette prosjektet leveres av samarbeidsprosjekter frø stipend fra Office for forskning og økonomisk utvikling ved UC Riverside.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
References
- Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211 (1), 55-76 (1997).
- Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9 (17), 2551 (2009).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
- Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73 (11), 1983-1992 (2009).
- Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23 (11), (2013).
- Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104 (4), 448-454 (2001).
- Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25 (3), 460-469 (1997).
- Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42 (2), 225-240 (2007).
- Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. , Springer. New York, NY. (2007).
- Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74 (3), 321-334 (2014).
- Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30 (6), 768-777 (2002).
- Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37 (7), 1310-1321 (2009).
- Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19 (1), 117-122 (1964).
- Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370 (1), 25-29 (1977).
- Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26 (3), 329-332 (1934).
- Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
- Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9 (12), 113762 (2014).
- Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134 (8), 084505 (2012).
- Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46 (6), 841-848 (2018).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122 (2), 285 (2000).
- Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. , (2006).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27 (5), 414-419 (1999).
- Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10 (2), 153-167 (2008).
- Kuo, C. -C., Mao, R. -C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31 (8), 1113-1118 (2016).
- Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12 (1), 014105 (2018).
- Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79 (1), 51-60 (2000).
- Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39 (32), 5978-5990 (2000).
- Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22 (3), 199-211 (1997).
- Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14 (3), 175-187 (1985).
- Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8 (12), 1493-1501 (1997).
- Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191 (1), 63-78 (1998).
- Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
- Tsai, W., Savaş, Ö Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (2), 197-201 (2010).
- Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23 (8), 1346-1351 (2002).
