Summary
Burada, C57BL yılında bleomisin endotrakeal enjeksiyonu ile akciğer yaralanması indüksiyonu sonrasında tüm göbek kordonundan elde edilen intravenöz infeksiyon insan mezenkimal stromal hücrelerin Antifibrotik aktivitesini araştırmak için etkili bir yöntem sunuyoruz. /6 fare. Bu protokol, diğer terapinin preklinik testine kolayca uzatılabilir.
Abstract
Pulmoner fibrozis çeşitli insan akciğer hastalıklarının farklı etiyolojisinde bir damgasını taşımaktadır. Mevcut tedaviler oldukça sınırlı olduğundan, fare modelleri yeni Antifibrotik stratejiler geliştirmek için temel bir araç olmaya devam ediyor. Burada, bleomisin kaynaklı akciğer yaralanmasını zayıflatarak, tüm göbek kordonunda (hUC-MSC) elde edilen insan mezenkimal stromal hücrelerin in vivo Antifibrotik aktivitesini araştırmak için etkili bir yöntem sağlıyoruz. C57BL/6 fareler bleomisin tek bir endotrakeal enjeksiyon almak (1,5 U/kg vücut ağırlığı) bir çift infüzyon takip HUC-msc (2,5 x 105) kuyruk ven içine, 24 h ve 7 gün sonra bleomisin yönetim. 8, 14 veya 21 gün içinde kurban edildikten sonra, enflamatuar ve fibrotik değişiklikler, kollajen içeriği ve açıklayıcı akciğer dokusunda hUC-MSC varlığı analiz edilir. Fare trakea içine bleomisin enjeksiyonu akciğerlerin doğrudan hedefleme sağlar, geniş pulmoner inflamasyon ve fibrozis yol. Bir çift doz HUC-msc sistemik yönetimi bleomisin kaynaklı akciğer yaralanması erken köreltme sonuçlanır. İntravenöz olarak kullanılan hUC-MSC, Anti-inflamatuar ve Antifibrotik aktivitesini yapan fare ciğerlerine kesintisiz olarak engrefindir. Sonuç olarak, bu protokol, insan pulmoner fibrozis deneysel bir fare modeli hUC-MSC preklinik test için başarıyla uygulandı. Ancak, bu teknik, akciğerlerin patofizyolojisi üzerinde farklı endotrakheally uygulanan maddelerin etkisini incelemek ve yeni anti-inflamatuar ve Antifibrotik sistemik tedaviler doğrulamak için hem de kolayca uzatılabilir.
Introduction
Pulmoner fibrozis, akciğer interstisyumunda, karaciğer fonksiyonuna yol açan, ağırlıklı olarak tip ı kollajen olan, ekstrellüler matris bileşenlerinin aşırı birikmesiyle karakterize Progressive bir patolojik süreçtir. Farklı etiyolojide çeşitli insan akciğer hastalıklarının damgasını taştı ve kötü bir klinik prognostik faktörü temsil eder. Mevcut tedaviler oldukça sınırlı olduğundan1, fare modelleri, hastalığın başlangıcını ve ilerlemesini etkileyen ve yeni Antifibrotik gelişimi için patojenik mekanizmaların daha fazla incelenmesi için hem de önemli bir araç olmaya devam ediyor Stratejiler2,3.
Bugüne kadar, bleomisin yönetimi deneysel olarak indüklenen pulmoner fibrozis en sık uygulanan model olmuştur4. Birden fazla teslim yöntemlerinin (intravenöz, intraperitoneal, subkutan ve inhalasyon dahil) yanında, bleomisin intratrakeal veya endotrakeal enjeksiyonları en sık kullanılan rotalar olarak ortaya çıkmıştır4,5. Burada tarif ettiğimiz Yöntem, bleomisin trakeal mukoza üzerindeki haşlama etkisini önlemek için geliştirilmiştir. Aslında, trakea exteriorizing ve bir işletim mikroskop aracılığıyla görselleştirerek, üst hava yolu herhangi bir dökülme olmadan doğrudan alt havayolu içine bleomisin çözeltisi tüm hacminin instilasyon elde etmek mümkündür. Gerekli cerrahi uzmanlık ve enstrümantasyon mevcut olduğunda, bu yöntem, aşağıda bildirilen gibi, akciğer iltihabı ve fibrozis güvenli, sağlam ve tekrarlanabilir indüksiyon için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Italyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (yetkilendirme n. 456/2016-PR) ve Helsinki beyannamesi kurallarına göre gerçekleştirildi.
1. fareler
- Onları satın aldıktan sonra, fareler en az 7 gün enjeksiyon önce gelmesini izin.
Not: fareler, patojen içermeyen koşullar altında hayvan tesisinde yer aldı, 12 h ışık/karanlık döngüsünde sabit sıcaklık ve nem altında tutulur ve su ve standart Pelet gıda ücretsiz erişim verildi. - Kadın C57BL/6 fareler kullanın ve 12 ila 16 hafta yaş onları enjekte.
2. bleomisin endotrakeal enjeksiyon
- Bleomisin hazırlanması
DIKKAT: kimyasalların sınıflandırılması ve etiketlenmesi ile ilgili küresel harmonize sisteme dayanarak (GHS), bleomisin GHS08 sağlık tehlikesi olarak sınıflandırılır.- Bir kimyasal kaput altında bleomisin hazırlayın.
- İstenilen çalışma konsantrasyonunu elde etmek için (0,05 u/100 μL), 30 ml steril tuz içinde likofilize bleomisin sülfat 15 u pelletini.
- Pıhtısı oluşumunu önlemek için tüpü tersine çevirerek numuneyi dikkatlice karıştırın.
- Tüpü Resuspension tarihi ile düzgün bir şekilde etiketleyin, 4 °C ' de saklayın ve içeriği 24 saat içinde kullanın.
- İnstilasyon öncesinde, bleomisin solüsyonu oda sıcaklığına dengele.
Not: Bu denemede, C57BL/6 farelerde akciğer yaralanmasına yol açması için tek doz 1,5 U/kg vücut ağırlığını kullandı. Yine de, her fare gerinim bleomisin için farklı bir duyarlılık vardır5/6. Deney için kullanılan fare gerinim en uygun doz belirlemek için bleomisin titrasyon yapılmalıdır.
- Anestezi
- 2, 2, 2-tribromoetanol 9 mL steril tuz ve 1 mL mutlak etanol (20 mg/mL çalışma konsantrasyonunda) 0,2 g çözünerek anestezi hazırlayın.
- Pıhtı oluşumunu önlemek için tüpün tersine çevirme ile iyice karıştırın.
- Tüpü hazırlık tarihi ile düzgün bir şekilde etiketleyin, karanlıkta 4 °C ' de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
- Bir intraperitoneal enjeksiyon ile fareler anestezize 250 μL tribromoetanol çözeltisi (son doz 200 mg/kg vücut ağırlığı) fare başına, 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanarak.
Not: Bu doz Ile, fareler en az 20 dakika bilinçsiz. Gerektiğinde, veteriner ile danışarak, fare yanıtı göre doz ayarlayın. - Fare nefes monitör. Solunum hızı biraz yavaşlatır. Birkaç dakika sonra, pedal refleks eksikliği kontrol etmek için fare ayakları bir çimdik.
- Endotrakeal enjeksiyon
- Tüm prosedür sırasında aseptik koşulları koruyun. Steril Cerrahi aletler ve malzemeler kullanın, steril eldiven giyin ve steril olmayan yüzeylerle temastan kaçının.
- Anestezi yapan fareyi bir cerrahi platformda arkasına uzan ve bacaklarını cerrahi bant şeritleri ile incelikle sabitleyerek yerine koyun.
Not: fare bacaklarının nazik bantlama fare rotasyon sırasında cerrahi platformdan uzağa kayar önlemek için tavsiye edilir (adım 2.3.10). - Rektal sıcaklığını 37 °C ' de kararlı tutmak için fareyi ısıtmalı mat üzerine yerleştirin. Bir rektal prob ile rektal sıcaklığı ölçün.
- Yavaşça, örneğin, servikal bölgenin altında bir diş pamuk rulo, bir "yastık" yerleştirerek fare boyun hyperextend.
- Yavaşça bir jilet ile boğaz tıraş.
- Alkol ile cerrahi alandan saç çıkarın ve 1% povidone-iyot solüsyonu ile birkaç kez fare cildi dezenfekte.
- Anatomik forseps bir çift ile cilt çimdik ve fare sternohyoid kas yazışmalarda kısa kesi yapmak, halka işlenmiş bir çift kullanarak, kavisli künt makas.
Not: cildin kesi yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda. Çıkarılan karşılık gelen cilt parçası o kadar küçük ki fare boynunda hiçbir gerginlik yaratacak. - Pamuk yün çubukları ile kanamayı durdurun.
- Hafifçe yağ ve diğer dokulardan Temizleme, künt diseksiyonu ile trakea exteriorize.
- Fareyi operatöre doğru yönlendirmek için cerrahi platformu döndürün.
Not: Bu pozisyon operatör, enjeksiyon sırasında, böylece akciğer düz trakea doğal yolunu takip şırınga açı sağlar. - Trakea görselleştirme ile yardımcı olmak için bir işletim mikroskop altında fareyi yerleştirin. Aydınlatması ayarlayın ve büyütme (1 ile 1,2 arasında), odak ve netlik ayarlayın. Trakea, beyaz bir yarı saydam tüp olarak kolayca ayırt edilebilir ve trakeal halkalar açıkça görülebilir.
- Bleomisin çözümünü hafifçe pipetleme ile karıştırın ve 100 μL 'yi 25 G iğne ile 0,5 mL şırıngaya takın ve kabarcık oluşumunu önleme.
- Trakea açıkça görüntülendikten sonra, 30 ° ' lik bir açıyla iğne ucu ile dikkatlice delinmesi (Şekil 1a).
- Yavaşça 100 μL bleomisin veya steril tuz (araç kontrolü) doğrudan trakea lümen içine aşılamak. Tüm hacim iğne aşağı kadar birkaç saniye bekleyin ve sonra trakea çıkarın.
- İğne doğru trakea içine böylece fare hemen sıvı tüm hacminin nefes olacak yerleştirilir oluşur apne, birkaç saniye gözlemlemek.
- Fare sıvı teneffüs değilse, dikkatle nefes izlemek ve iğne konumunu ayarlayın. Fare nefes almayı durdurursa, hemen iğneyi çıkarın ve fareyi yeniden takmadan önce normal olarak nefes almaya devam etmesini sağlar.
- Enjeksiyonu yaptıktan sonra şırınga ve iğneyi güvenle atın.
- 5-0 emilebilen sütür ile subkutan fasya ve deri yara kapatın.
Not: tamamen reabsorbe değil, dikiş 7-10 gün sonrası cerrahi çıkarın.
- Hayvan kurtarma
- Kurtarma için bir Isıtma pad üzerinde yan üzerine enjekte fare yerleştirin.
- Fare nefes monitör ve hareket başlar ve sternal vurgulanmakla ve tam bilinç kavuşur kadar fareyi gözlemlemek.
- Bir kez o fare iyi durumda olduğunu teyit edilir, orijinal kafes geri dönün. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete iade etmeyin.
- Uzun süreli analjezi sağlamak ve herhangi bir kalıntı sonrası girişimsel ağrıyı önlemek için, subkutan buprenorfik yönetmek (son doz 0,05 mg/kg vücut ağırlığı) her 12 h sonrası endotrakeal enjeksiyon.
- Bleomisin endotrakeal enjeksiyon sonra 24 h için fareler inceleyin ve günde iki kez bunu. Solunum sıkıntısı, kilo kaybı, davranış anomalileri ve herhangi bir morbidite belirtisi için fareler izleyin.
3. insan göbek kordon mezenkimal stromal hücrelerin kuyruk ven infüzyon
- Hücre hazırlığı
Not: insan göbek kordonunda mezenkimal stromal hücrelerin yalıtım, karakterizasyonu ve ekimi daha önce8,9,10olarak tanımlanmıştır. HUC-msc aseptik manipüle ve infemeli olmalıdır; Bu nedenle, steril bir başlık altında tüm adımları gerçekleştirin.- 75 cm2 kültüründe HUC-msc ' i genişletmek için erken geçişler (1 – 3 maksimum).
Not: hUC-MSC, farelere infüzyon gününde% 70 konfluent olmalıdır. - Hücreleri oda sıcaklığında 10 mL steril fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın.
- 2 mL tripsin ekleyin ve hücreleri 37 °C ' de yaklaşık 1 dakika boyunca inküyeyin, onlar ayrılmaya başlayana kadar.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 8 mL hUC-MSC komple orta ekleyerek tripsin nötralize.
- 350 x g 'de 10 dakika santrifüjleme ile hücreleri toplayın.
- Steril tuz içinde Pelet resuspend ve bir BüRkEr odası kullanarak hücreleri saymak. Hücre süspansiyonu, hücreleri seyreltilerek infüzyon için hazırlamak 2,5 x 105 ' te 200 μL 'de fare başına steril tuz ile son konsantrasyona kadar. Tüm farelerin bulaşması için yeterli hacim olduğundan emin olmak için aşırı hücre süspansiyonu hazırlayın.
- İnfüzyon öncesi buz üzerinde hücreleri tutun. 3,3 bölümünde açıklandığı gibi birkaç saat içinde infkullanım.
- 75 cm2 kültüründe HUC-msc ' i genişletmek için erken geçişler (1 – 3 maksimum).
- Anestezi
Not: fare kuyruk ven enjeksiyon sırasında zarar riskini en aza indirmek için fare hareket olmamalıdır. Bu nedenle anestezi basit fare kısıtlaması üzerinden tercih edilmiştir.- Bir indüksiyon odasında% 4 isofluran inhalasyonu ile fareler anestezize.
- Fare nefes monitör. Solunum hızı biraz yavaşlatır. Birkaç dakika sonra, doğru anestezizasyon kontrol etmek için fare feet bir çimdik.
- Kuyruk ven infüzyon
- Bilinç kaybı doğrulandı sonra, aseptik hUC-MSC intravenöz infüzyon için steril bir kaput altında fareyi yerleştirin.
- Sürekli akış% 1,5 Isoflurane ile bir yüz maskesi ile deney boyunca genel anestezi koruyun.
- Vazodilatasyon teşvik ve daha kolay bir enjeksiyon için izin, 2 dakika ılık suda fare kuyruğu emmek.
- Hücrelerin kümeleri oluşturmayın emin olmak için hafifçe pipetleme tarafından hücre süspansiyon karıştırın. 200 μL 'yi 26 G iğneli 1 mL şırıngaya asarak kabarcık oluşumunu önleme.
- Fare kuyruğu ucu ile tutun ve hafifçe düzeltin.
- Fare kuyruğu lateral ven bulun; nazikçe bir neşter ile kazımak ve 70% etanol ile silin.
Not: yavaşça kuyruk kazıma saç kaldırmak için yapılır, enjeksiyon site daha pürüzsüz ve temiz hale. - Kuyruğun distal kısmından başlayarak, iğne 15 ° açıyla ven içine yerleştirin ve yavaşça 200 μL hUC-MSC veya steril tuz (araç kontrolü) (Şekil 1B) infkullanım.
- Direnç olmadan ve ekstrasasyon eksikliği ile ven giren sıvı tarafından başarılı intravenöz infüzyon izleyin. Tüm hacim iğne aşağı gider kadar birkaç saniye bekleyin ve sonra damar çıkarın.
- Kanama önlemek için, kısaca steril bir gazlı bez ile Giriş yarasına baskı uygulayın.
- İnfüzyon sonrası şırınga ve iğneyi güvenle atın.
- Hayvan kurtarma
- Kurtarma için bir Isıtma pad üzerinde yan üzerine infaştı fareyi yerleştirin.
- Fare nefes monitör ve hareket başlar ve sternal vurgulanmakla ve tam bilinç kavuşur kadar fareyi gözlemlemek.
- Bir kez o fare iyi durumda olduğunu teyit edilir, orijinal kafes geri dönün. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete iade etmeyin.
- Kuyruk ven infüzyon ve her gün sonra 24 h için fareler inceleyin, sağlık durumlarını izlemek ve herhangi bir acı veya patolojik işareti erken tespit etmek.
4. organ eksplant ve doku işleme
- Gün 8, 14 veya 21 bleomisin yönetimi (Şekil 1C) enjekte edilebilir anestezik aşırı doz ile sonra fareler feda.
- Trakea ve akciğerleri çıkarın ve hemen buz gibi PBS onları yıkayın.
- Sağ akciğerleri sıvı nitrojenlerde çırpın ve sonraki moleküler analiz için-80 °C ' de saklayın.
- Sol akciğerleri% 4 paraformaldehit ile şişirin ve 24 h için% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi içinde düzeltin; daha sonra, kademeli alkol serisi onları susuz, ksile onları temizlemek ve parafin10embed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akciğer hasarı, 100 μL steril tuz içinde bleomisin sülfat 1,5 U/kg vücut ağırlığı tek bir endotrakeal enjeksiyon ile indüklenmiş. Kontrol hayvanları, eşit hacimli bir serum endotrakeal enjeksiyon aldı. HUC-MSC iki çekim (2,5 x 105 ın 200 μL steril tuz) fare kuyruğu ven içine infemeli, 24 h ve 7 gün bleomisin yönetim sonra. Kontrol hayvanları eşit hacimli steril serum intravenöz infüzyon aldı. Fareler akciğer eksplant ve doku işleme için gün 8, 14 ve 21 bleomisin yönetim sonra feda edildi (Şekil 1).
Biz, fare trakea içine bleomisin doğrudan bir instilasyon akciğerlere hızlı difüzyon aşağı izin gösterdi, geniş inflamasyon sonuçlanan, Progressive fibrozis, ve normal mimarisi bir bozulma, sürekli olarak önceki çalışmalar ile 11. akciğer histopatolojik değişiklikler hematoksislin-Eosin (H & E) ve picrosirius kırmızı boyama10ile değerlendirildi ve fibrozis artmış hidroksiprolin içeriği ve kollajen birikimi ile doğrulandı (Şekil 2). Bronşiler, bronşlar ve kan damarlarının etrafında inflamatuar infiltrasyona dayalı bir histolojik Puanlama sistemi ile dokuda inflamatuar değişiklikler değerlendirildi ve hematoksinin-eozsin lekelenmiş akciğer bölümlerinde görülen interstisyel pnömoni10. Bleomisin enjeksiyonu sonrasında, akciğer bölümlerindeki Ashcroft puanı, 1,5 ortalama değeri ile 8 gün 14 ve 6,5 gün 2110' da 4,5 ortalama değerine kadar artmıştır. HUC-MSC ' i fare kuyruğu damarına çift infüzyon büyük ölçüde zayıflatılmış bleomisin-indüklenen akciğer hasarı, önemli azalma, her ne kadar tam olarak düşürülmesi, her iki inflamatuar infiltrasyon ve fibrozis ölçüde her zaman noktasında ( Şekil 2). Spesifik antikorlar ile immünostik10 ortaya çıktı HUC-msc hızla ve etkili bir şekilde fare akciğerleri ulaştı, sadece birkaç hücre tespit edildi rağmen, günden itibaren azalan bir sayı ile 8 gün 21 (Şekil 3). Daha önce bildirilen12, bu veriler, uzun süreli koruyucu etkiye rağmen, yaralanma sitesinden hücrelerin hızlı bir şekilde çıkığı önerir. HUC-MSC ' i k i immunohistokimya (ıHC) boyama, ayrıca tuzlu tedavi örneklerinde de yapıldı, ancak hUC-MSC ' i çeken inflamatuar odaklanma yokluğunda hiçbir hücre tespit edilemedi.
Şekil 1: deneysel protokolün şematik. (A) fareler akciğer yaralanmasını (gün 0) teşvik etmek için bleomisin 1,5 U/kg vücut ağırlığını tek bir endotrakeal (e.t.) enjeksiyonu aldı. (B) tüm göbek kordonundan (HUC-msc) elde edilen 2,5 x 105 insan mesenkimal stromal hücrelerin çift intravenöz (IV) infüzyon, bleomisin yönetiminden sonra 24 saat (1 gün) ve 7 gün (7 gün) yapılmıştır. (C) burada bir zaman çizelgesi ile kurban edilen enjeksiyonlar ve anlar gösterilir. Fareler grupları gün 8, 14 ve 21 bleomisin yönetim sonra feda edildi (yani, 24 saat, 7 gün, ve 14 gün sonra ikinci HUC-msc infüzyon, sırasıyla). Bu rakam Moroncini ve Al'dan değiştirildi. 10. lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için.
Şekil 2: hUC-msc bleomisin kaynaklı akciğer iltihabı ve fibrozis aşağı düzenler. (A ve B) C57BL/6 fareden elde edilen akciğer kısımlarında, steril tuz (tuz) veya bleomisin (bleomisin) endotrakeal enjeksiyonu sonrasında 21 gün sonra alınan hematoksinlin-eozin (H & E) ve picrosirius kırmızı boyama temsili mikroskobik görüntüler (10X büyütme), İkincisi de hUC-MSC intravenöz infüzyon tarafından takip (bleomisin + hUC-MSC) veya steril tuz (bleomisin + tuzlu). Tuz kontrolleri normal akciğer mimarisi gösterdi. Yaygın inflamatuar infiltrasyonlar, akciğer mimarisinin ciddi bir bozulma ve fibrotik odaklanma oluşumu ile bleomisin yaralanmasından sonra 21 gün gözlemlenmiştir. Bleomisin kaynaklı değişiklikler hUC-MSC tedavisi tarafından önemli ölçüde zayıflatıldı, ancak tuz ile değil. (C) hidroksiprolin içeriği gün 8, 14, ve 21 AKCIĞERLERINDE C57BL/6 fareler yukarıda bahsedilen tedaviler aldı. Sonuçlar, endotrakeal tuzlu tedavi edilen farelerden elde edilen değerin yüzdesi olarak ifade edilen ve üç bağımsız deneylerin temsilcisi olan ortalama ± SD (grup başınan = 8) ' dir. *P < 0,05, * *p < 0,01, bleomisin-tedavi fareler ile karşılaştırıldığında. (D) fare Col1A1 ifade seviyeleri tüm akciğer mRNA gün 8, 14 ve 21 dan C57BL/6 fareler gelen yukarıda belirtilen tedaviler alınan elde. Sonuçlar ortalama ± SD (grup başınan = 5) ve triplicate ile gerçekleştirilen üç bağımsız deneylerin temsilcisidir. *P < 0,05, * *p < 0,01, bleomisin-tedavi fareler ile karşılaştırıldığında. Bu rakam Moroncini ve Al 'dan değiştirildi . 10. lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için.
Şekil 3: akciğer dokusunda hUC-msc algılanması. (A ve B) temsili mikroskobik görüntüler (200x ve 400x büyütme, SıRASıYLA) Anti-HLA-1 antikor akciğer bölümleri ile IMMÜNOSTATUVAR C57BL/6 fareler endotrakeal bleomisin alma elde intravenöz takip hUC-MSC. Kırmızı oklar pozitif lekeli hUC-MSC ' i gösterir. (C) Insan gapdh niceliksel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirildi (PCR) tam mRNA içinde infüzyon önce kültürlü HUC-msc çıkarılan (infüze HUC-msc) veya akciğer dokusu gün 8, 14 ve 21 C57BL/6 fare endotrakeal alma bleomisin ardından intravenöz hUC-MSC (bleomisin + hUC-MSC). Sonuçlar ortalama ± SD (grup başınan = 5) ve triplicate ile gerçekleştirilen üç bağımsız deneylerin temsilcisidir. Not, bu deneysel protokolde insan GAPDH transkript kaynağı sadece intravenöz infaşlı hUC-MSC tarafından sağlanabilir. Bu rakam Moroncini ve Al 'dan değiştirildi . 10. lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotrakeal yönetim, eksojen ajanlar akciğerlere teslim etmek için tercihli bir yol. Birkaç yıl sonra, trakea içine bleomisin doğrudan enjeksiyon yaygın pulmoner fibrozis teşvik etmek için kullanılan olmuştur13 ve, son zamanlarda, daha gelişmiş, noninvaziv teknikler bu başarmak için geliştirilen14,15 ,16.
Burada açıklanan yöntem bazı potansiyel sınırlamalar üzerinde çeşitli anlamlı faydalar sağlar. Trakea enjeksiyonu, derin hayvan sedasyon ihtiyacı ile birlikte, prosedürün neden olduğu komplikasyonlar için potansiyel taşıyan bir cerrahi müdahale gerektirir. Bu nedenle, prosedürü mükemmelleştirmek için iyi bir hazırlık ve uygulama gereklidir. Ayrıca, fare acısını en aza indirmek için, fare gerilmesi ve bireysel yanıt göre anestezik uygun doz ayarlamak için zorunludur ve hayvan sedasyon devlet titiz bir gözlem korumak için. Yine de, çok düşük bir mortalite oranı ve anesteziden optimum hayvan geri kazanımı gözlemledik. Ketamin ve xylazine anestezi, yanı sıra tribromoetanol için kullanılabilir. Ancak, fareler, ketamin ve xylazine etkili doz ölümcül dozda yakındır; Böylece, kolayca bir solunum tutuklanmasına neden olabilir. Tersine, tribromoetanol dozajı kolayca ayarlanabilir ve böylece, tercih edilen bir anestezik ajandır. Trakea içine bleomisin endotrakeal enjeksiyonu takiben, herhangi bir yan etkileri gözlemlemiyoruz. Fareler ateşten serbest ve trakea ve deri yarasının etrafında inflamasyon veya enfeksiyon belirtisi görülmemiştir. Bu nedenle, antibiyotik profilaksi için gerek yoktu. Dahası, bir işletim mikroskobu kullanımı, operatörün iğneyi doğru bir şekilde sapmadan önce fare trakeine düzgün bir şekilde izlemesini sağlayarak, böylece zarar verme riskini en aza indirerek başarının yüksek bir güveni sağlar.
Bleomisin endotrakeal enjeksiyonu her iki akciğerde de güçlü bir inflamatuar ve fibrotik tepkiye neden olur ve insan interstisyel akciğer hastalıklarının (ıLD) deneysel fare modellerini oluşturmak için sağlam bir yöntem olarak görülebilir. Ancak, daha önce belgelenen7, farelerde bleomisin fibrotik tepkisi gerinim bağımlı ve cinsiyet-ve yaş ile ilgili. Bu nedenle, her Deneysel ortamda bleomisin tolebilir dozu bulmak için protokol başarısı için önemlidir. Bu çalışmada kadın fareler kullanıldı, çünkü bu araştırmanın ana ilgisi, Genç yetişkinlerde büyük ölçüde yaygın olan sistemik skleroz ile ilişkili interstisyel akciğer hastalığıdır. Üç-dört aylık fareler seçildi, çünkü bu onlar sadece yetişkin aşaması girmek yaş (fareler cinsel olgunluk ulaşmak 8-12 yaş)17. Böylece, onlar genç yetişkin fareler olarak kabul edilir ve genç hayvanlar üzerinde tercih edilir, akciğer fibrozis çok genç bireyler yaygın değildir beri. Onlar da önceki çalışmalar beri eski hayvanlar üzerinde tercih edilir18 Yaşlı fareler akciğer fibroblast fenotip değişiklikler sergiledi göstermiştir, akciğer yaralanması sonrası tamir ve fibrozis için artan bir duyarlılık yol, hangi Burada sunulan deneysel modelde olası bir önyargı temsil edebilir.
Kuyruk ven infüzyon basit, güvenilir ve noninvaziv bir yoldur kan dolaşımına ilaçların hızlı ve etkili teslim sağlamak için. Basit tıbbi ekipmanlar, kısa manuel eğitim ve düşük maliyetler ile kolayca gerçekleştirilebilir.
Burada açıklanan Deneysel protokol, önceden yayınlanmış çalışmalar19,20,21, değiştirilmiş bir çift intravenöz infüzyon 2,5 x 105 HUC-msc fare içine hücre Engraftman geliştirmek için var Akciğerleri ve terapötik etkisi. Aslında, prosedür travmatik olmadığından, aynı hayvan içinde tekrarlanabilir, ancak iki ardışık enjeksiyonlar arasında 7 gün süre, nihai vazal yaraların reparasyonu sağlamak için tavsiye edilir. Ayrıca, ani hayvan hareketleri durumunda kuyruk ven yaralanmasını önlemek için, prosedür sırasında C57BL/6 fareler anestezize Isoflurane inhalasyon kullanılır.
Sonuç olarak, bu protokol C57BL/6 fareler içinde pulmoner fibrozis verimli bir şekilde teşvik etmek ve hUC-MSC ' i z in vivo Antifibrotik etkisini doğrulamak için başarıyla uygulandı. Bu yöntem aynı zamanda farklı deneysel akciğer hastalığı modelleri oluşturmak için, hava yolu içine bleomisin dışında uyuşturucu veya ajanlar yönetmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ministero Italiano della Salute 'den (Armando Gabrielli 'ye) bir Grant RF-2011-02352331 tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis? Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
