Summary
여기에서 우리는 C57BL에 있는 bleomycin의 내적 주입에 의하여 폐 상해의 유도다음 전체 탯줄에서 장악된 정맥 주입된 인간 중간엽 기질 세포의 항섬유성 활성을 조사하는 효과적인 방법을 제시합니다. /6 마우스. 이 프로토콜은 다른 치료제의 전임상 시험으로 쉽게 확장될 수 있다.
Abstract
폐 섬유증은 다른 병인학을 가진 몇몇 인간적인 폐 질병의 특징입니다. 현재 치료는 오히려 제한되기 때문에, 마우스 모형은 새로운 항섬유성 전략을 개발하기 위한 필수적인 공구가 계속됩니다. 여기서 우리는 전체 탯줄(hUC-MSC)으로부터 수득된 인간 중간엽 기질 세포의 생체 내 항섬유활성을 감쇠하는 블리오마이신 유발 폐 손상을 조사하는 효과적인 방법을 제공한다. C57BL/6 마우스는 블리오마이신(1.5 U/kg 체중)의 단일 endotracheal 주사를 받은 다음, 꼬리 정맥에 hUC-MSC(2.5 x 10 5)를 이중 으로 주입한 후, 24시간 및 7일 후에 블리오마이신 투여 후 7일 후에 투여한다. 8일, 14일 또는 21일에 희생시, 염증 및 섬유성 변화, 콜라겐 함량 및 이식된 폐 조직에서의 hUC-MSC 존재를 분석한다. 마우스 기관에 bleomycin의 주입은 광대한 폐 염증 및 섬유증으로 이끌어 내는 폐의 직접적인 표적으로 허용합니다. hUC-MSC의 이중 투여의 전신 투여는 블리오마이신 유발 폐 손상의 조기 블로닝을 초래한다. 정맥 주입 된 hUC-MSC는 마우스 폐로 일시적으로 이식되어 항 염증 및 항 섬유 활성을 발휘합니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 인간 폐 섬유증의 실험마우스 모델에서 hUC-MSC의 전임상 시험을 성공적으로 적용하였다. 그러나, 이 기술은 폐의 병리생리학에 상이한 내측질 투여 물질의 효과를 연구하고 새로운 항염증 및 항섬유성 전신 요법을 검증하기 위해 둘 다 쉽게 확장될 수 있다.
Introduction
폐 섬유증은 세포외 매트릭스 성분의 과도한 침착을 특징으로하는 진보적 인 병리학 적 과정으로, 주로 I 형 콜라겐, 폐 간질에서, 폐 기능 장애를 유발한다. 그것은 다른 병인학을 가진 몇몇 인간적인 폐 질병의 특징이고 나쁜 임상 예후 요인을 나타냅니다. 현재 치료법은 다소제한적이기 때문에 마우스 모델은 질병의 발병 및 진행에 영향을 미치는 병원성 메커니즘의 추가 조사와 새로운 항섬유성 개발을 위한 필수 도구가 되고 있습니다. 전략2,3.
현재까지, 블리오마이신의 투여는 실험적으로 유도된 폐섬유증4의 가장 일반적으로적용된 모델이다. 여러 전달 방법 (정맥 내, 복강 내, 피하 및 흡입 포함) 외에, 출혈 내 또는 안내 주사는 가장 자주 사용되는 경로로 등장했다4,5. 본 명세서에서 설명하는 방법은 기관 점막에 대한 블리오마이신의 스케일링 효과를 피하기 위해 개발되었다. 실제로, 기관을 외부화하고 작동 현미경을 통해 시각화함으로써, 상부 기도에 유출되지 않고 하부 기도로 직접 블레마이신 용액의 전체 부피의 점안을 달성 할 수있다. 필요한 외과 전문 지식과 계측을 사용할 수 있을 때, 이 방법은 아래에 보고된 바와 같이 폐 염증 및 섬유증의 안전하고 견고하며 재현 가능한 유도를 가능하게 합니다.
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Protocol
모든 동물 관리 및 실험 절차는 이탈리아 보건부(승인 n. 456/2016-PR)의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.
1. 생쥐
- 그들을 구입 한 후, 쥐에 대 한 적응 을 허용 적어도 7 주사 전에 일.
참고: 마우스는 병원균이 없는 조건하에서 동물 시설에 보관되었고, 12시간 의 빛/어두운 주기에서 일정한 온도및 습도 하에서 유지되었고, 물과 표준 펠릿 식품에 무료로 접근할 수 있었다. - 여성 C57BL/6 마우스를 사용 하 고 그들에 게 주입 12 받는 이 16 나이의 주.
2. 블로마이신의 엔도트라클 주사
- 블로마이신 제제
주의: 전 세계적으로 조화된 화학물질 분류 및 라벨링(GHS)에 기초하여, 블로마이신은 GHS08 건강 위험으로 분류됩니다.- 화학 후드 아래에 블로마이신을 준비하십시오.
- 원하는 작업 농도 (0.05 U / 100 μL)를 얻으려면 30 mL의 멸균 식염수에서 동결 성 블로 마이신 황산염 15 U를 다시 일시 중단하십시오.
- 응고 형성을 피하기 위해 튜브를 반전시켜 샘플을 조심스럽게 혼합합니다.
- 튜브에 재서스펜션 날짜로 적절하게 라벨을 부착하고 4°C에 보관하고 24시간 이내에 그 함량을 사용하십시오.
- 증점 전에, 실온에 블레오마이신 용액을 평형화한다.
참고: 이 실험에서, 1.5 U/kg의 단일 복용량의 bleomycin의 체중 C57BL/6 마우스에서 폐 부상을 유도 하는 데 사용 되었다. 그럼에도 불구하고, 각 마우스 균주는 블로마이신6,7에다른 감도를 갖는다. bleomycin의 적정은 실험에 사용되는 마우스 균주에서 최적의 용량을 결정하기 위해 수행되어야한다.
- 마 취
- 멸균 식염수 9mL와 절대 에탄올 1mL(20 mg/mL의 작동 농도)에서 0.2 g의 2,2,2-트리브로모에탄올을 용해시켜 마취를 준비합니다.
- 응고 형성을 피하기 위해 튜브를 반전시켜 철저히 섞습니다.
- 준비 날짜와 함께 튜브에 제대로 라벨을 붙인 다음 어둠 속에서 4 °C에 보관하고 3 일 이내에 사용하십시오.
- 1 mL 주사기와 26G 바늘을 사용하여 마우스 당 트리브로모에탄올 용액 250 μL (최종 투여 량 200 mg/kg 체중)으로 마우스를 마취시.
참고 :이 복용량으로, 마우스는 적어도 20 분 동안 의식이 없습니다. 필요한 경우 수의사와 상의하여 마우스 반응에 따라 복용량을 조정하십시오. - 마우스 호흡을 모니터링합니다. 호흡 속도는 약간 느려집니다. 몇 분 후, 페달 반사의 부족을 확인하기 위해 마우스 발 중 하나를 꼬집어.
- 내인성 주사
- 모든 절차 동안 무균 상태를 유지하십시오. 멸균 수술 기구 및 재료를 사용하고, 멸균 장갑을 착용하고, 멸균되지 않은 표면과의 접촉을 피하십시오.
- 외과 용 플랫폼에 그것의 뒤의 마취된 마우스를 아래로 눕고 외과 테이프 스트립으로 그것의 다리를 섬세하게 고정해서 제자리에 붙습니다.
참고: 마우스 다리를 부드럽게 테이핑하는 것은 마우스가 회전하는 동안 수술 플랫폼에서 미끄러지는 것을 피하는 것이 좋습니다(단계 2.3.10). - 마우스를 가열매트 위에 놓고 개입 내내 직장 온도를 37°C에서 안정적으로 유지합니다. 직장 프로브로 직장 온도를 측정합니다.
- 자궁 경부 부위 아래에 치과 용 면 롤과 같은 "베개"를 배치하여 마우스 목을 부드럽게 과도하게 확장합니다.
- 면도날로 목을 부드럽게 면도합니다.
- 알코올로 수술 부위에서 머리카락을 제거하고 1 % 포비도 요오드 용액으로 마우스 피부를 여러 번 소독하십시오.
- 한 쌍의 해부학 적 집게로 피부를 꼬집고 마우스 스테르노하이드 근육에 대응하여 짧은 절개를하고 링 처리 된 곡선 무딘 가위를 사용하십시오.
참고 : 피부의 절개는 길이가 약 0.5cm입니다. 제거된 해당 스킨 피스는 너무 작아서 마우스 목에 장력이 없습니다. - 면 봉으로 출혈을 멈추십시오.
- 무딘 해부에 의해 기관을 외부화하고 지방 및 기타 조직에서 부드럽게 청소하십시오.
- 수술 플랫폼을 회전하여 머리로 작업자를 향해 마우스를 방향을 지정합니다.
참고 : 이 위치는 주입 중에 작업자가 주사기를 각도로 하여 기관의 자연스러운 경로를 폐로 바로 따라갈 수 있게 합니다. - 수술 현미경 아래에 마우스를 놓아 기관시각화를 돕습니다. 조명을 조정하고 배율(1에서 1.2 사이), 초점 및 선명도를 설정합니다. 기관은 백색 반투명 관으로 쉽게 구별 될 수 있으며 기관 고리는 명확하게 볼 수 있습니다.
- 블로마이신 용액을 부드럽게 파이펫팅하여 혼합하고, 100 μL을 25G 바늘로 0.5 mL 주사기에 흡인하여 거품 형성을 피합니다.
- 일단 기관을 명확하게 시각화하면 바늘 끝으로 30 ° 각도로 조심스럽게 구멍을 뚫습니다(그림1A).
- 100 μL의 블로마이신 또는 멸균 식염수(차량 제어)를 기관 내강내체에 직접 주입합니다. 전체 볼륨이 바늘 아래로 이동 할 때까지 몇 초 기다렸다, 다음 기관에서 제거.
- 바늘이 기관에 올바르게 삽입될 때 발생하는 무호흡증의 몇 초를 관찰하여 마우스가 액체의 전체 부피를 즉시 흡입할 수 있도록 합니다.
- 마우스가 액체를 흡입하지 않는 경우, 조심스럽게 호흡을 모니터링하고 바늘 위치를 조정합니다. 마우스가 호흡을 멈추면 즉시 바늘을 제거하고 마우스가 다시 삽입하기 전에 정상적으로 호흡을 재개할 수 있도록 하십시오.
- 주사 기와 바늘을 주사기와 바늘을 안전하게 폐기하십시오.
- 피하 근막과 피부 상처를 5-0 흡수 성 봉합사로 닫습니다.
참고 : 완전히 재흡수되지 않은 경우 수술 후 7-10 일 동안 봉합사를 제거하십시오.
- 동물 회복
- 주입된 마우스를 가열 패드 의 측면에 놓고 복구하십시오.
- 마우스 호흡을 모니터링하고 움직이기 시작하고 흉골 의식으로 완전한 의식을 되찾을 때까지 마우스를 관찰하십시오.
- 마우스상태가 양호한 것으로 확인되면 원래 케이지로 되돌아갑니다. 완전히 회복될 때까지 다른 동물의 회사에 반환하지 마십시오.
- 장기간 진통을 보장하고 개입 후 통증을 피하기 위해 피하 부프레노르핀 (최종 투여 량 0.05 mg / kg 체중)을 마우스마다 12 h 포스트 endotracheal 주사로 투여하십시오.
- 블레마이신의 내구 주사 후 24 시간 동안 마우스를 검사하고 하루에 두 번 그렇게하십시오. 호흡 곤란, 체중 감소, 행동 이상 및 이환의 흔적에 대 한 마우스를 모니터링 합니다.
3. 인간 탯줄 중간엽 기질 세포의 꼬리 정맥 주입
- 세포 준비
참고: 인간 탯줄로부터 중간엽 기질 세포의 격리, 특성화 및 배양은 이전에8,9,10에기술되어 왔다. hUC-MSC는 무균적으로 조작되고 주입되어야 합니다. 따라서 멸균 후드 아래의 모든 단계를 수행하십시오.- hUC-MSC를 75cm2 배양 플라스크에서 초기 통로(1-3 최대)로 확장합니다.
참고 : hUC-MSC는 마우스로 주입 당일 70 % 유동해야합니다. - 실온에서 멸균 인산완충식염수(PBS)를 10mL로 세척합니다.
- 트립신 2 mL를 추가하고 분리를 시작할 때까지 약 1 분 동안 37 °C에서 세포를 배양하십시오.
- 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 hUC-MSC 완전한 배지의 8 mL를 추가하여 트립신을 중화.
- 10 분 동안 350 x g에서 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.
- 멸균 식염수로 펠릿을 다시 일시 중단하고 뷔르커 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액을 마우스당 멸균 식염수의 200 μL에서 2.5 x 105의 최종 농도로 희석시킴으로써 주입을 위한 세포 현탁액을 준비한다. 모든 마우스를 주입하기에 충분한 부피가 있는지 확인하기 위해 과잉 세포 현탁액을 준비하십시오.
- 주입 하기 전에 얼음에 세포를 유지 합니다. 섹션 3.3에 설명된 대로 몇 시간 내에 주입하십시오.
- hUC-MSC를 75cm2 배양 플라스크에서 초기 통로(1-3 최대)로 확장합니다.
- 마 취
참고: 주사 중에 마우스 꼬리 정맥이 손상될 위험을 최소화하기 위해 마우스가 움직이지 않아야 합니다. 따라서 마취는 간단한 마우스 억제보다 선호되고있다.- 유도 챔버에서 4 % 이소플루란 흡입에 의해 마우스를 마취.
- 마우스 호흡을 모니터링합니다. 호흡 속도는 약간 느려집니다. 몇 분 후, 마우스 발 중 하나를 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다.
- 꼬리 정맥 주입
- 무의식이 확인되면, 무균 hUC-MSC 정맥 주입을위한 멸균 후드 아래에 마우스를 놓습니다.
- 1.5 % 이소플루란의 연속 흐름과 얼굴 마스크를 통해 실험 전반에 걸쳐 전신 마취를 유지.
- 혈관 확장을 촉진하고 쉽게 주입할 수 있도록 마우스 꼬리를 따뜻한 물에 2분 간 담가 둡니다.
- 셀이 덩어리를 형성하지 않도록 부드럽게 파이펫팅하여 셀 현탁액을 혼합합니다. 26G 바늘로 1 mL 주사기에 200 μL을 흡기, 거품 형성을 피하십시오.
- 마우스 꼬리를 끝까지 잡고 부드럽게 펴십시오.
- 마우스 꼬리의 측면 정맥을 찾습니다. 메스로 부드럽게 긁어 70 % 에탄올로 닦아.
참고 : 꼬리를 부드럽게 긁어 내어 머리카락을 제거하여 주사 부위를 부드럽고 깨끗하게 만듭니다. - 꼬리의 말단 부분에서 시작하여 바늘을 15° 각도로 정맥에 삽입하고 hUC-MSC 또는 멸균 식염수(차량 제어)의 200μL을 천천히 주입합니다(그림 1B).
- 저항없이 사치의 부족에 의해 정맥을 입력 하는 액체에 의해 성공적인 정 맥 주입을 모니터링 합니다. 전체 볼륨이 바늘 아래로 이동 할 때까지 몇 초 기다립니다, 다음 정맥에서 제거.
- 출혈을 방지하려면 멸균 거즈로 상처 부위에 잠시 압력을 가하십시오.
- 주입 후 주사기와 바늘을 안전하게 폐기하십시오.
- 동물 회복
- 주입된 마우스를 가열 패드의 측면에 놓고 복구합니다.
- 마우스 호흡을 모니터링하고 움직이기 시작하고 흉골 의식으로 완전한 의식을 되찾을 때까지 마우스를 관찰하십시오.
- 마우스상태가 양호한 것으로 확인되면 원래 케이지로 되돌아갑니다. 완전히 회복될 때까지 다른 동물의 회사에 반환하지 마십시오.
- 꼬리 정맥 주입 후 24 시간 동안 마우스를 검사하고 격일로 건강 상태를 모니터링하고 고통이나 병리학적 징후를 조기에 감지하십시오.
4. 장기 이식 및 조직 처리
- 주사용 마취제를 과다 복용하여 8일, 14일 또는21일 후에 마우스를 블리오마이신 투여 후 희생(도 1C).
- 기관및 폐를 절제하고 즉시 얼음 차가운 PBS에서 세척하십시오.
- 액체 질소에 오른쪽 폐를 스냅 동결하고 후속 분자 분석10을위해 -80 °C에 저장합니다.
- 왼쪽 폐를 4 % 파라 포름 알데히드로 팽창시키고 24 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린 용액으로 고정하십시오. 그런 다음 등급이 매겨진 알코올 시리즈에서 탈수하고 자일렌으로 지우고 파라핀10에포함시다.
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Representative Results
폐 손상은 멸균 식염수 100 μL에서 1.5 U/kg의 황산염의 단일 내막주포로 유도되었다. 대조군 동물은 동일한 양의 식염수의 내막 주사제 주사를 받았다. hUC-MSC(2.5 x 105 에서 멸균 식염수 200 μL)의 2샷을 마우스 꼬리 정맥에 주입하였고, 24시간 및 7일 후에 블리오마이신 투여 후 7일 동안 주입하였다. 대조군 동물은 동일한 양의 멸균 식염수를 정맥 주사를 받았다. 마우스는 블리오마이신 투여 후 8일, 14일 및 21일에 폐 이식및 조직 처리를 위해 희생하였다(도 1).
우리는 마우스 기관에 bleomycin의 직접적인 점안이 광범위한 염증, 진행성 섬유증 및 그들의 일반적인 건축의 왜곡의 결과로 폐에 급속한 확산을 허용했다는 것을, 이전 연구 결과와 일관되게 설명했습니다 11. 폐 조직병리학적 변화는 헤마톡실린-에오신(H&E) 및 피크로시리우스 적색염색(10)에의해 평가되었고, 섬유증은 하이드록시프롤린 함량 및 콜라겐 침착증가에 의해 확인되었다(도 2). 조직의 염증성 변화는 헤마톡실린-에오신 염색 폐 절편10에서관찰된 기관지, 기관지 및 혈관 주위의 염증성 침윤에 기초한 조직학적 채점 시스템에 의해 평가되었다. bleomycin 주입 에 이어, 폐 섹션의 Ashcroft 점수는 점진적으로 8일째에 평균 값 1.5에서 14일째에 4.5, 21일10일째에6.5의 평균 값으로 증가했습니다. 마우스 꼬리 정맥으로 hUC-MSC의 이중 주입은 크게 감소 된 블리오 마이신 유도 폐 손상을 감쇠, 상당한 감소와 함께, 완전한 압제하지 는 않지만, 염증성 침투와 각 시점에서 섬유증의 정도 모두 ( 그림2). 특정 항체(10)를 이용한 면역염색은 소수의 세포만 검출되었지만, 8일째부터 21일째까지 감소된 수와 함께 마우스 폐에 신속하고 효과적으로 주입된 hUC-MSC가 주입되었다는 것을 보여주었다(도 3). 이전에보고된 12,이러한 데이터는 장기간 보호 효과에도 불구하고 부상 부위에서 세포의 급속한 탈구를 제안합니다. hUC-MSC의 면역히스토화학(IHC) 염색은 식염수 처리된 샘플에서도 수행되었지만, hUC-MSC를 유치하는 염증성 초점의 부재를 감안할 때 세포는 검출될 수 없었다.
도 1: 실험 프로토콜의 개략적. (a) 마우스는 폐 손상을 유도하기 위해 1.5 U/kg의 체중인 1.5 U/kg의 주사(0일째)를 단일 내구치료(e.t.)를 받았다. (B) 전체 탯줄(hUC-MSC)으로부터 수득된 2.5 x 105인간 중간엽 기질 세포를 2.5 x 10의 이중 정맥 내(i.v.) 주입한 후 24시간(1일째) 및 7일째(7일째)를 수행하였다. (C) 주사의 타임 라인과 희생의 순간이 여기에 표시됩니다. 마우스 그룹은 블리오마이신 투여 후 8일, 14일 및 21일에 희생되었다(즉, 24시간, 7일, 및 제2 hUC-MSC 주입 후 14일). 이 그림은 모론치니 외에서 수정되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: hUC-MSC는 블로마이신-유도폐 염증 및 섬유증을 하향 조절한다. (A와 B) 대표적인 현미경 이미지(H&E)의 헤마톡시린-에오신(H&E) 및 C57BL/6 마우스로부터 수득된 폐 절편의 피로시리우스 적색 염색, 멸균 식염수(saline) 또는 블리오마이신(bleomycin)의 내후 주입 후 21일, 후자는 또한 hUC-MSC (bleomycin +hUC-MSC) 또는 멸균 식염수 (블레마이신 + 식염수)의 정맥 주입에 이어. 식염수 대조군은 정상적인 폐 구조를 입증했다. 광범위한 염증성 침윤제는 폐 구조의 심한 왜곡과 섬유성 초점의 형성과 함께, bleomycin 손상 후 21 일 관찰되었다. Bleomycin 유도된 변경은 hUC-MSC 처리에 의해 현저하게 감쇠되었지만 식염수에 의해 서두르지 않았습니다. (C) 전술한 치료를 받은 C57BL/6 마우스의 폐에서 8일, 14일 및 21일의 하이드록시프롤린 함량. 결과는 평균 ± SD(n=8군)이며, 엔도트라클로클 식염수 처리 마우스로부터 수득된 값의 백분율로 나타내고 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01, 블로마이신 처리 마우스에 비해. (D) 상기 치료를 받은 C57BL/6 마우스로부터 8일, 14일 및 21일에서 수득된 전체 폐 mRNA에서 마우스 Col1A1 발현 수준. 결과는 평균 ± SD(그룹당 n=5)이며, 삼중항에서 수행된 3개의 독립적인 실험을 대표한다. *P < 0.05, **P < 0.01, 블로마이신 처리 마우스에 비해. 이 그림은 모론치니 외에서 수정되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 폐 조직에서 hUC-MSC의 검출. (A 및 B)C57BL/6 마우스에서 수득된 폐 단면의 항 HLA-1 항체로 면역염색을 하는 대표적인 현미경 이미지(각각 200x 및 400x 배율)가 정맥내 로 이어진다. hUC-MSC. 빨간색 화살표는 양성 염색hUC-MSC를 나타냅니다. (C) 인간 GAPDH는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 평가된 전체 mRNA에서 배양된 hUC-MSC로부터 추출된 주입(주입된 hUC-MSC) 또는 폐 조직으로부터 8일, 14일, 21일 동안 C57BL/6 마우스의 엔도트라클로를 수신 블로마이신이어서 정맥 hUC-MSC(블로마이신+hUC-MSC)가 뒤따랐다. 결과는 평균 ± SD(그룹당 n=5)이며, 삼중항에서 수행된 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 참고로, 이러한 실험 프로토콜에서 인간 GAPDH 전사체의 공급원은 정맥 내 주입된 hUC-MSC에 의해 독점적으로 제공될 수 있다. 이 그림은 모론치니 외에서 수정되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
엔도트라클 투여는 외인성 물질을 폐로 전달하기 위한 우선경로이다. 몇 년 이후, 기관에 bleomycin의 직접 주입은 널리 폐 섬유증을 유도하기 위해 사용되어왔다13, 최근, 더 진보, 비 침습적 기술은이 달성하기 위해 개발되었다14,15 ,16.
여기에 설명된 메서드는 몇 가지 잠재적제한 사항에 대해 몇 가지 의미 있는 이점을 제공합니다. 기관을 주입하려면 수술 적 개입이 필요하며, 깊은 동물 진정의 필요성과 함께 절차 자체로 인한 합병증의 가능성을 지니고 있습니다. 따라서 절차를 완벽하게 하기 위한 좋은 준비와 연습이 필요합니다. 게다가, 마우스 고통을 최소화하기 위해, 마우스 균주에 따라 마취제의 적절한 용량을 설정하고 개별 반응과 동물 진정 상태의 엄격한 관찰을 유지하는 것이 필수적이다. 그럼에도 불구하고, 우리는 마취에서 사망률과 최적의 동물 회복의 매우 낮은 비율을 관찰했다. 케타민과 자일라진은 트리브로모에탄올뿐만 아니라 마취에도 사용할 수 있습니다. 그러나, 마우스에서, 케타민과 자일라진의 유효 용량은 치명적인 복용량에 가깝습니다; 따라서, 그들은 쉽게 호흡 정지를 유도 할 수 있습니다. 반대로, 트리브로모에탄올 투약은 용이하게 조절될 수 있고, 따라서, 바람직한 마취제이다. 기관에 bleomycin의 endotracheal 주입 에 이어, 우리는 어떤 부작용을 관찰하지 않았다. 마우스는 발열이 없었고 기관 및 피부 상처 주변에서 염증이나 감염의 흔적이 관찰되지 않았다. 따라서 항생제 예방이 필요하지 않았습니다. 또한, 작동 현미경을 사용하면 작업자가 점안 전에 바늘을 마우스 기관에 정확하게 배치할 수 있으므로 손상 위험을 최소화할 수 있으므로 성공의 신뢰도가 높습니다.
bleomycin의 endotracheal 주입은 폐 둘 다에 있는 강력한 선동적이고 섬유성 반응을 초래하고 인간 간질성 폐 병의 실험적인 마우스 모형을 생성하는 강력한 방법으로 볼 수 있습니다 (ILD). 그러나, 이전에문서화된7, 마우스에서 의 한 블로마이신에 대한 섬유성 반응은 균주 의존성 및 성별-및 연령과 관련이 있다. 따라서, 모든 실험 환경에서 블리오마이신의 견딜 수 있는 용량을 찾는 것이 프로토콜의 성공에 매우 중요하다. 이 연구에 있어서 주된 관심사는 전신 경화증과 관련된 간질성 폐질환이었기 때문에 암컷 마우스가 이 연구에서 사용되었는데, 이는 젊은 성인 여성에게 서식하는 질환이다. 3-4개월된 생쥐는 성인 단계에 진입하는 연령(생쥐가 8-12주에 성숙도에 도달)하기 때문에선택되었다17. 따라서, 그(것)들은 젊은 성인 마우스로 여겨지고 폐 섬유증이 아주 젊은 개별에서 일반적이지 않기 때문에, 젊은 동물보다 바람직합니다. 그(것)들은 또한 이전 연구 결과18이 폐 섬유아세포 표현형에 있는 변경을 전시했다는 것을, 폐 상해 후에 파손 및 섬유증에 증가한 감수성으로 이끌어 내는 이전 연구 결과 때문에 더 오래된 동물보다 바람직합니다, 이는 여기에 제시된 실험 모델에서 가능한 편향을 나타낼 수 있습니다.
꼬리 정맥 주입은 혈류량에 약물의 신속하고 효과적인 전달을 보장하기 위해 간단하고 신뢰할 수있는 비 침습적 인 방법입니다. 간단한 의료 장비, 짧은 수동 교육 및 비용 절감으로 쉽게 수행 할 수 있습니다.
여기에 기술된 실험 프로토콜은,이전에 발표된 연구 19,20,21에서수정, 마우스내로 세포 생착을 향상시키기 위하여 2.5 x 105 hUC-MSC의 이중 정맥 주입의 존재 폐와 그들의 치료 효과. 사실, 절차는 비 외상성이기 때문에 동일한 동물에서 반복 될 수 있지만 두 번의 연속 주사 사이의 7 일 의 기간이 권장되어 결국 혈관 상처의 배상을 허용합니다. 또한, 우리는 시술 중에 C57BL/6 마우스를 마취시키기 위해 이소플루란 흡입을 사용하여 갑작스런 동물 운동의 경우 꼬리 정맥 손상을 피했습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 C57BL/6 마우스에서 폐 섬유증을 효율적으로 유도하고 hUC-MSC의 생체 내 항섬유효과를 검증하기 위해 성공적으로 적용되었다. 이 방법은 또한 다른 실험적인 폐 질환 모델을 생성하기 위해, 기도내로 블로마이신 이외의 약물 또는 제제를 투여하는데 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 보조금 RF-2011-02352331 장관 이탈리아어 델라 살루트 (아르만도 가브리엘리)에서 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
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