Summary
Hier presenteren we een effectieve methode voor het onderzoeken van de antifibrotische activiteit van intraveneus geïnfundeerde humane mesenchymale stromale cellen verkregen uit de gehele navelstreng na de inductie van long letsel door een Endotracheale injectie van bleomycine in C57BL /6 muizen. Dit protocol kan eenvoudig worden uitgebreid tot de preklinische testen van andere therapieën.
Abstract
Pulmonale fibrose is een kenmerk van verschillende menselijke longziekten met een verschillende etiologie. Aangezien de huidige therapieën vrij beperkt zijn, blijven Muismodellen een essentieel hulpmiddel voor het ontwikkelen van nieuwe antifibrotische strategieën. Hier bieden we een effectieve methode om te onderzoeken in vivo antifibrotische activiteit van menselijke mesenchymale stromale cellen verkregen uit gehele navelstreng (Huc-msc) in verzwakkende bleomycine-geïnduceerde long letsel. C57BL/6 muizen krijgen een enkelvoudige Endotracheale injectie met bleomycine (1,5 U/kg lichaamsgewicht) gevolgd door een dubbele infusie met hUC-MSC (2,5 x 105) in de staart ader, 24 uur en 7 dagen na de toediening van bleomycine. Na opoffering op dag 8, 14 of 21 worden inflammatoire en fibrotische veranderingen, collageengehalte en hUC-MSC aanwezigheid in explanted longweefsel geanalyseerd. De injectie van bleomycine in de luchtpijp van de muis maakt de directe targeting van de longen mogelijk, wat leidt tot uitgebreide pulmonale ontsteking en fibrose. De systemische toediening van een dubbele dosis van hUC-MSC resulteert in de vroege afstomting van de bleomycine-geïnduceerde long letsel. Intraveneus geïnfundeerd hUC-MSC worden transiënt in de muis longen, waar ze hun ontstekingsremmende en antifibrotische activiteit uitoefenen. Tot slot, dit protocol is met succes toegepast voor de preklinische testen van hUC-MSC in een experimenteel muismodel van menselijke pulmonale fibrose. Deze techniek kan echter gemakkelijk worden uitgebreid, zowel om het effect van verschillende endotracheally toegediende stoffen op de pathofysiologie van de longen te bestuderen als om nieuwe ontstekingsremmende en antifibrotische systemische therapieën te valideren.
Introduction
Pulmonale fibrose is een progressief pathologisch proces dat wordt gekenmerkt door de overmatige depositie van extracellulaire matrix componenten, voornamelijk type I collageen, in het Long interstitium, wat leidt tot een verminderde longfunctie. Het is het kenmerk van verschillende menselijke longziekten met een verschillende etiologie en vertegenwoordigt een slechte klinische prognostische factor. Aangezien de huidige therapieën vrij beperkt zijn1, Muismodellen blijven een essentieel instrument zowel voor het verdere onderzoek van de pathogene mechanismen beïnvloeden het ontstaan en de progressie van de ziekte en voor de ontwikkeling van nieuwe antifibrotische strategieën2,3.
Tot op heden is de toediening van bleomycine het meest toegepaste model van experimenteel geïnduceerde pulmonale fibrose4. Naast meerdere methoden (waaronder intraveneuze, intraperitoneale, subcutane en inhalationele), zijn intratracheale of Endotracheale injecties van bleomycine ontstaan als de meest gebruikte routes4,5. De methode die we hierin beschrijven is ontwikkeld om het scalaire effect van bleomycine op het tracheale slijmvlies te voorkomen. In feite is het door het exterioriseren van de luchtpijp en het visualiseren ervan door middel van een operatiemicroscoop het mogelijk om de indrukking van het gehele volume bleomycine oplossing rechtstreeks in de lagere luchtweg te bereiken zonder morsen in de bovenste luchtweg. Wanneer de vereiste chirurgische expertise en instrumentatie beschikbaar zijn, zorgt deze methode voor de veilige, robuuste en reproduceerbare inductie van longontsteking en fibrose, zoals hieronder gerapporteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierenverzorging en experimentele procedures werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van volksgezondheid (vergunning n. 456/2016-PR) en uitgevoerd volgens de verklaring van de Verdragen van Helsinki.
1. muizen
- Laat de muizen na de aanschaf gedurende ten minste 7 dagen vóór de injectie acclimeren.
Opmerking: muizen werden ondergebracht in de dieren faciliteit onder pathogeen-vrije omstandigheden, werden gehandhaafd onder constante temperatuur en vochtigheid op een licht/donkere cyclus van 12 uur, en kregen gratis toegang tot water en standaard pellet voedsel. - Gebruik vrouwelijke C57BL/6 muizen en Injecteer ze op 12 tot 16 weken oud.
2. Endotracheale injectie van bleomycine
- Bleomycine preparaat
Let op: op basis van het wereldwijd geharmoniseerde systeem voor de indeling en etikettering van chemicaliën (GHS) wordt bleomycine geclassificeerd als een GHS08 gevaar voor de gezondheid.- Bereid bleomycine onder een chemische kap.
- Om de gewenste werkconcentratie te verkrijgen (0,05 U/100 μL), hervat U 15 U van gelyofiliseerd bleomycine sulfaat in 30 mL steriele zoutoplossing.
- Meng het monster voorzichtig door de buis om stolselvorming te voorkomen.
- Label de buis met de datum van de resuspensie, bewaar deze op 4 °C en gebruik de inhoud binnen 24 uur.
- Voorafgaand aan de instillatie wordt de bleomycine oplossing op kamertemperatuur
Opmerking: in dit experiment werd een enkelvoudige dosis van 1,5 U/kg lichaamsgewicht van bleomycine gebruikt voor het opwekken van long letsel bij C57BL/6 muizen. Niettemin heeft elke muis stam een andere gevoeligheid voor bleomycine6,7. Titratie van bleomycine moet worden uitgevoerd om de optimale dosis te bepalen in de voor de experimenten gebruikte muis stam.
- Anesthesie
- Bereid anesthesie door het oplossen van 0,2 g van 2, 2, 2-tribromoethanol in 9 mL steriele zoutoplossing en 1 mL absolute ethanol (bij een werkconcentratie van 20 mg/mL).
- Meng grondig door de buis te inverteren om stolselvorming te voorkomen.
- Goed labelen van de buis met de datum van bereiding, opslaan op 4 ° c in duisternis, en gebruik het binnen 3 dagen.
- Anesthetiseer de muizen met een intraperitoneale injectie van 250 μL tribromoethanol oplossing (bij een eind dosis van 200 mg/kg lichaamsgewicht) per muis, met behulp van een 1 mL spuit en een 26 G naald.
Opmerking: bij deze dosis zijn de muizen ten minste 20 minuten bewusteloos. Indien nodig, pas de dosering volgens de muisreactie, in overleg met de dierenarts. - Controleer de ademhaling van de muis. De ademhalingssnelheid zal lichtjes vertragen. Beweeg na een paar minuten een van de muis voetjes om het gebrek aan pedaal reflex te controleren.
- Endotracheale injectie
- Gedurende de hele procedure aseptische condities te handhaven. Gebruik steriele chirurgische instrumenten en materialen, draagster iele handschoenen en Vermijd contact met een niet-steriel oppervlak.
- Ga de verdoken muis op zijn rug op een chirurgisch platform liggen en houd hem op zijn plaats door de poten subtiel vast te zetten met chirurgische tape stroken.
Opmerking: het is raadzaam om de muis poten voorzichtig te tapen om te voorkomen dat de muis wegglijdt van het chirurgische platform tijdens de rotatie (stap 2.3.10). - Plaats de muis op de verwarmde mat om de rectale temperatuur stabiel te houden bij 37 °C gedurende de gehele ingreep. Meet de rectale temperatuur door een rectale sonde.
- Voorzichtig hyperextend de muis nek door het plaatsen van een "kussen", bijvoorbeeld, een tandheelkundige katoen roll, onder de cervicale regio.
- Scheer de keel zachtjes met een scheermesje.
- Verwijder het haar uit het chirurgische gebied met alcohol en Desinfecteer de huid van de muis meerdere malen met 1% Povidon-jodiumoplossing.
- Knijp de huid met een paar anatomische pincet en maak een korte incisie in correspondentie van de muis sternohyoid spier, met behulp van een paar ring-behandeld, gebogen Blunt schaar.
Opmerking: de incisie van de huid is ongeveer 0,5 cm lang. Het bijbehorende huid stuk dat wordt verwijderd is zo klein dat het geen spanning in de muis nek zal creëren. - Stop het bloeden met wattenstaafjes.
- Exterioriseer de luchtpijp door botte dissectie, zachtjes schoonmaken van vet en andere weefsels.
- Draai het chirurgische platform om de muis te oriënteren met zijn hoofdrichting de operator.
Opmerking: Dankzij deze positie kan de bediener tijdens de injectie de spuit in de hoek plaatsen zodat deze het natuurlijke pad van de luchtpijp rechtstreeks naar de longen volgt. - Plaats de muis onder een operatiemicroscoop om te helpen bij de visualisatie van de luchtpijp. Pas de belichting aan en stel de vergroting (tussen 1 en 1,2), scherpstelling en scherpte in. De luchtpijp kan gemakkelijk worden onderscheiden als een witte doorzichtige buis, en de tracheale ringen zijn duidelijk zichtbaar.
- Meng de bleomycineoplossing door zachtjes te pipetteren en zuig 100 μL in een spuit van 0,5 mL met een naald van 25 G, waardoor de vorming van de bubbels wordt vermeden.
- Zodra de luchtpijp in duidelijk gevisualiseerd, voorzichtig doorboren met de naaldpunt onder een hoek van 30 ° (Figuur 1a).
- Langzaam 100 μL bleomycine of steriele zoutoplossing (controle van het voertuig) in het lumen van de luchtpijp inboezemen. Wacht een paar seconden totdat het hele volume de naald naar beneden trekt en verwijder het vervolgens van de luchtpijp.
- Observeer een paar seconden van Apneu, die optreedt wanneer de naald correct in de luchtpijp wordt ingebracht, zodat de muis het volledige volume van de vloeistof onmiddellijk inademt.
- Als de muis de vloeistof niet inademt, controleer dan zorgvuldig de ademhaling en pas de naaldpositie aan. Als de muis stopt met ademhalen, verwijdert u onmiddellijk de naald en laat u de muis de ademhaling normaal hervatten voordat u deze opnieuw plaatst.
- Gooi de spuit en naald na de injectie veilig weg.
- Sluit de subcutane fascia en de huid wond met een 5-0 absorbabel hechtdraad.
Opmerking: wanneer niet volledig opnieuw geabsorbeerd, verwijderen hechtingen 7-10 dagen na de operatie.
- Dierlijk herstel
- Plaats de geïnjecteerde muis op zijn zijkant op een verwarmingskussen voor herstel.
- Bewaak de muis ademhaling en observeer de muis totdat deze begint te bewegen en herwint borstbeen ligpositie en volledig bewustzijn.
- Zodra is bevestigd dat de muis in goede staat, terug te keren naar de oorspronkelijke kooi. Niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld.
- Om langdurige analgesie te garanderen en eventuele residuele post-Interventionele pijn te voorkomen, dient subcutaan buprenorfine (bij een uiteindelijke dosis van 0,05 mg/kg lichaamsgewicht) te worden toegediend aan de muis om de 12 uur na Endotracheale injectie.
- Onderzoek de muizen gedurende 24 uur na de Endotracheale injectie met bleomycine en doe dit twee keer per dag. Controleer de muizen op ademnood, gewichtsverlies, afwijkingen van het gedrag en voor elk teken van morbiditeit.
3. staart ader infusie van humane navelstreng mesenchymale stromale cellen
- Voorbereiding van de cel
Opmerking: de isolatie, karakterisering en teelt van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng is eerder beschreven8,9,10. hUC-MSC moet aseptisch worden gemanipuleerd en geïnfundeerd; Voer daarom alle stappen uit onder een steriele kap.- Breid de hUC-MSC uit in maatkolven van 75 cm2 tot vroege passages (1 – 3 maximaal).
Opmerking: de hUC-MSC moet 70% Confluent Health zijn op de dag van hun infusie in muizen. - Was de cellen met 10 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
- Voeg 2 mL trypsine toe en inincuberen de cellen bij 37 °C gedurende ongeveer 1 minuut, totdat ze beginnen te ontkoppelen.
- Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 8 mL hUC-MSC compleet medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat.
- Verzamel de cellen door centrifugeren bij 350 x g gedurende 10 minuten.
- Rebreng de pellet in steriele zoutoplossing en Tel de cellen met een Bürker kamer. Bereid de celsuspensie voor infusie door de cellen tot een eindconcentratie van 2,5 x 105 in 200 μL steriele zoutoplossing per muis te verdunen. Bereid een overtollige celsuspensie om ervoor te zorgen dat er voldoende volume is voor het infusie van alle muizen.
- Bewaar de cellen vóór de infusie op ijs. Binnen enkele uren, zoals beschreven in paragraaf 3,3.
- Breid de hUC-MSC uit in maatkolven van 75 cm2 tot vroege passages (1 – 3 maximaal).
- Anesthesie
Opmerking: om het risico van beschadiging van de muis staart ader tijdens de injectie te minimaliseren, mag de muis niet bewegen. Daarom heeft anesthesie de voorkeur boven eenvoudige muis fixatie.- Anesthetiseer de muizen met 4% Isofluraan inademing in een inductie kamer.
- Controleer de ademhaling van de muis. De ademhalingssnelheid zal lichtjes vertragen. Na een paar minuten, knijp je een van de muis voetjes om te controleren op goede anesthetisering.
- Staart ader infusie
- Zodra bewusteloosheid is bevestigd, plaatst u de muis onder een steriele kap voor de aseptische hUC-MSC intraveneuze infusie.
- Behoud algemene anesthesie gedurende het experiment via een gezichtsmasker met een continue stroom van 1,5% isoflurane.
- Ter bevordering van vasodilatatie en zorgen voor een gemakkelijkere injectie, weken de muis staart in warm water voor 2 min.
- Meng de celsuspensie door zachtjes te pipetteren om ervoor te zorgen dat de cellen geen klonters vormen. Aspirate 200 μL in een spuit van 1 mL met een naald van 26 G, waardoor de vorming van de bubbels wordt vermeden.
- Houd de muis staart bij de tip en strek deze voorzichtig recht.
- Zoek de laterale ader van de staart van de muis; schraf het voorzichtig met een scalpel en veeg het af met 70% ethanol.
Opmerking: het zachtjes schrapen van de staart wordt uitgevoerd om het haar te verwijderen, waardoor de injectieplaats gladder en schoner wordt. - Vanaf het distale gedeelte van de staart, steek de naald in de ader in een hoek van 15 ° en breng langzaam 200 μL hUC-MSC of steriele zoutoplossing (voertuigcontrole) (Figuur 1b) aan.
- Bewaak de geslaagde intraveneuze infusie door de vloeistof die de ader binnendringt zonder resistentie en door een gebrek aan extravasatie. Wacht een paar seconden totdat het hele volume de naald naar beneden trekt en verwijder het vervolgens uit de ader.
- Om bloedingen te voorkomen, druk kort op de invoer wond met een steriel gaas.
- Gooi de spuit en de naald na de infusie veilig weg.
- Dierlijk herstel
- Plaats de geïnfundeerde muis op zijn zijkant op een verwarmingskussen voor herstel.
- Bewaak de muis ademhaling en observeer de muis totdat deze begint te bewegen en herwint borstbeen ligpositie en volledig bewustzijn.
- Zodra is bevestigd dat de muis in goede staat, terug te keren naar de oorspronkelijke kooi. Niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld.
- Onderzoek de muizen gedurende 24 uur na de infusie van de staart ader en om de dag om hun gezondheidstoestand te bewaken en het leed of pathologische teken vroegtijdig op te sporen.
4. de verwerking van orgaan installaties en weefsels
- Offer de muizen op dag 8, 14 of 21 na de toediening van bleomycine (figuur 1c) door overdosering van injecteerbaar anestheticum.
- Accijns de luchtpijp en de longen en spoel ze onmiddellijk in ijskoude PBS.
- Snap-Vries de juiste longen in vloeibare stikstof en bewaar ze bij-80 °C voor een daaropvolgende moleculaire analyse10.
- Blaas de linker longen op met 4% Paraformaldehyde en fixeer ze in 10% neutraal gebufferde formaline oplossing voor 24 uur; dehydraat ze vervolgens in gesorteerde alcohol Series, wis ze in xyleen en sluit ze in bij paraffine10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Long letsel werd veroorzaakt door een enkelvoudige Endotracheale injectie van 1,5 e/kg lichaamsgewicht van bleomycine sulfaat in 100 μL steriele zoutoplossing. Controledieren kregen een Endotracheale injectie van een gelijk volume zoutoplossing. Twee schoten van hUC-MSC (2,5 x 105 in 200 μL steriele zoutoplossing) werden geïnfundeerd in de staart ader van de muis, 24 uur en 7 dagen na de toediening van bleomycine. Controledieren kregen een intraveneuze infusie van een gelijk volume steriele zoutoplossing. Muizen werden op dag 8, 14 en 21 na de toediening van bleomycine geofferd voor de verwerking van Long explanten en weefsels (Figuur 1).
We hebben aangetoond dat een directe instillatie van bleomycine in de luchtpijp van de muis een snelle diffusie naar de longen mogelijk heeft, resulterend in uitgebreide ontsteking, progressieve fibrose en een verstoring van hun normale architectuur, consistent met eerdere studies 11. Long histopathologische veranderingen werden beoordeeld door hematoxyline-eosine (H & E) en picrosirius rode kleuring10, en fibrose werd bevestigd door een verhoogd hydroxyprolingehalte en collageen depositie (Figuur 2). Inflammatoire veranderingen in weefsel werden beoordeeld door een histologisch scorings systeem op basis van de inflammatoire infiltratie rond bronchiolen, bronchiën en bloedvaten, en interstitiële pneumonie waargenomen in hematoxyline-eosine gekleurd Long secties10. Na de Bleomycine injectie nam de Ascroft-Score van Long secties geleidelijk toe van een gemiddelde waarde van 1,5 op dag 8 tot een gemiddelde waarde van 4,5 op dag 14 en van 6,5 op dag 2110. De dubbele infusie van hUC-MSC in de staart ader van de muis grotendeels verzwakte bleomycine-geïnduceerde long letsel, met aanzienlijke vermindering, hoewel niet volledige intrekking, van zowel de inflammatoire infiltratie en de omvang van fibrose op elk tijdstip ( Figuur 2). Immuunkleuring met specifieke antilichamen10 toonde aan dat Huc-MSC snel en effectief de muis longen bereikte, hoewel slechts een paar cellen werden gedetecteerd, met een afname van het aantal van dag 8 tot dag 21 (Figuur 3). Zoals eerder gemeld12, deze gegevens suggereren een snelle dislocatie van de cellen van de plaats van letsel, ondanks hun langdurige beschermende effect. Immunohistochemie (IHC) kleuring van hUC-MSC werd uitgevoerd, ook in de zout behandelde monsters, maar geen cel kon worden gedetecteerd, gezien de afwezigheid van inflammatoire Foci aantrekken van hUC-MSC.
Figuur 1: schematische voorstelling van het experimentele protocol. A) muizen kregen een enkelvoudige Endotracheale (e.t.) injectie van 1,5 U/kg lichaamsgewicht bleomycine voor het opwekken van long letsel (dag 0). B) een dubbele intraveneuze (i.v.) infusie van 2,5 x 105 humane mesenchymale stromale cellen, verkregen uit een hele navelstreng (Huc-msc), werd 24 uur (dag 1) en 7 dagen (dag 7) na de toediening van bleomycine uitgevoerd. (C) hier wordt een tijdlijn van de injecties en momenten van opoffering getoond. Muizen groepen werden geofferd op dag 8, 14 en 21 na de toediening van bleomycine (d.w.z. 24 uur, 7 dagen en 14 dagen na de tweede infusie met hUC-MSC). Dit cijfer is gewijzigd van Moroncini et al. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: hUC-MSC downreguleren bleomycine-geïnduceerde longontsteking en fibrose. (A en B) Representatieve microscopische beelden (10x vergroting) van hematoxyline-eosine (H & E) en picrosirius rode kleuring van Long secties verkregen uit C57BL/6 muizen, 21 dagen na de Endotracheale injectie van steriele zoutoplossing (zoutoplossing) of bleomycine (bleomycine), de laatste ook gevolgd door een intraveneuze infusie van hUC-MSC (bleomycine + hUC-MSC) of steriele zoutoplossing (bleomycine + zoutoplossing). De zout regelaars toonden een normale Long architectuur aan. Wijdverbreide inflammatoire infiltraten werden waargenomen 21 dagen na de bleomycine letsel, met een ernstige verstoring van de Long architectuur en de vorming van fibrotische Foci. Bleomycine-geïnduceerde veranderingen werden aanzienlijk verzwakt door de behandeling met hUC-MSC, maar niet door zoutoplossing. C) hydroxyproline-gehalte op de dagen 8, 14 en 21 in de LONGEN van C57BL/6 muizen die de bovengenoemde behandelingen ontvingen. De resultaten zijn het gemiddelde ± SD (n = 8 per groep), uitgedrukt als een percentage van de waarde verkregen uit Endotracheale met zoutoplossing behandelde muizen en zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. *P < 0,05, * *p < 0,01, vergeleken met bleomycine behandelde muizen. D) muis Col1A1 uitdrukkings niveaus in gehele Long mRNA verkregen op dag 8, 14 en 21 van C57BL/6 muizen die de bovengenoemde behandelingen ontvingen. De resultaten zijn de gemiddelde ± SD (n = 5 per groep) en zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievis. *P < 0,05, * *p < 0,01, vergeleken met bleomycine behandelde muizen. Dit cijfer is gewijzigd van Moroncini et al. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: detectie van hUC-msc in longweefsel. (A en B) representatieve microscopische beelden (vergroting van respectievelijk 200x en 400x) van immunokleuring met anti-HLA-1 antilichaam van Long secties verkregen uit C57BL/6 muizen die Endotracheale bleomycine ontvangen, gevolgd door intraveneuze hUC-MSC. De rode pijlen geven de positieve-gekleurde hUC-MSC aan. C) menselijke gapdh beoordeeld door kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie (PCR) test in gehele mRNA geëxtraheerd uit gekweekte Huc-MSC voorafgaand aan infusie (geïnfundeerd Huc-msc) of uit longweefsel op dag 8, 14, en 21 van C57BL/6 muizen die Endotracheale Bleomycine gevolgd door intraveneuze hUC-MSC (bleomycine + hUC-MSC). De resultaten zijn de gemiddelde ± SD (n = 5 per groep) en zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievis. Van nota, de bron van menselijke GAPDH transcriptie in dit experimentele protocol kan uitsluitend worden verstrekt door de intraveneus geïnfundeerd hUC-MSC. Dit cijfer is gewijzigd van Moroncini et al. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotracheale toediening is de voorkeursroute voor het leveren van exogene agentia in de longen. Sinds enkele jaren is de directe injectie van bleomycine in de luchtpijp op grote schaal gebruikt voor het opwekken van pulmonale fibrose13 en recentelijk zijn er geavanceerdere, niet-invasieve technieken ontwikkeld om deze14,15 ,16.
De hier beschreven methode biedt verschillende zinvolle voordelen ten opzichte van enkele mogelijke beperkingen. Injectie van de luchtpijp vereist een chirurgische ingreep, waardoor het potentieel voor complicaties veroorzaakt door de procedure zelf, samen met de behoefte aan diepe dierlijke sedatie. Daarom zijn goede voorbereiding en praktijk bij het perfectioneren van de procedure nodig. Behalve, om het lijden van muizen te minimaliseren, is het noodzakelijk om de juiste dosis anestheticum in te stellen volgens de muis stam en de individuele respons en om een strikte observatie van de diersedatie toestand te handhaven. Niettemin, we waargenomen een zeer laag sterftecijfer en optimale dierlijke herstel van anesthesie. Ketamine en xylazine kunnen worden gebruikt voor anesthesie, evenals tribromoethanol. Bij muizen ligt de effectieve dosis ketamine en xylazine echter dicht bij de dodelijke dosis; Zo kunnen ze gemakkelijk een respiratoire arrestatie veroorzaken. Omgekeerd, tribromoethanol dosering kan gemakkelijk worden aangepast en is, dus, een voorkeur verdoving agent. Na de Endotracheale injectie van bleomycine in de luchtpijp, hebben we geen nadelige effecten observeren. De muizen waren vrij van koorts en er werden geen verschijnselen van ontsteking of infectie waargenomen rond de luchtpijp en de huid wond. Daarom was er geen behoefte aan antibiotica profylaxe. Bovendien zorgt het gebruik van een operatiemicroscoop voor een hoog betrouwbaarheids vertrouwen doordat de machinist vóór de indrukking de juiste plaatsing van de naald nauwkeurig in de luchtpijp van de muis kan controleren, waardoor het risico op beschadiging wordt geminimaliseerd.
De Endotracheale injectie van bleomycine resulteert in een krachtige inflammatoire en fibrotische respons in beide longen en kan worden gezien als een robuuste methode om experimentele Muismodellen van menselijke interstitiële longziekten (ILD) te genereren. Echter, zoals eerder gedocumenteerd7, de fibrotische reactie op bleomycine bij muizen is stam-afhankelijke en geslacht-en leeftijdsgebonden. Daarom is het van cruciaal belang voor het succes van het protocol om de toelaatbare dosis bleomycine in elke experimentele setting te vinden. Vrouwelijke muizen werden gebruikt in deze studie omdat de belangrijkste belangstelling voor dit onderzoek interstitiële longziekte was geassocieerd met systemische sclerose, wat een ziekte is die grotendeels voorkomt bij jonge volwassen vrouwtjes. Drie-tot vier maanden oude muizen werden gekozen omdat dit de leeftijd is waarop ze gewoon de volwassen fase binnengaan (muizen bereiken seksuele volwassenheid op 8-12 weken leeftijd)17. Zo worden ze beschouwd als jonge volwassen muizen en hebben ze de voorkeur boven jongere dieren, omdat longfibrose niet gebruikelijk is bij zeer jonge individuen. Ze hebben ook de voorkeur boven oudere dieren, aangezien eerdere studies18 hebben aangetoond dat leeftijd muizen veranderingen in het Long fibroblast fenotype vertoonden, wat leidde tot een verhoogde gevoeligheid voor disherstel en fibrose na long letsel, wat een mogelijke bias in het hier gepresenteerde experimentele model zou kunnen vertegenwoordigen.
Staart ader infusie is een eenvoudige, betrouwbare en niet-invasieve manier om te zorgen voor de snelle en effectieve levering van geneesmiddelen aan de bloedbaan. Het kan eenvoudig worden uitgevoerd met eenvoudige medische apparatuur, korte handmatige training en lagere kosten.
Het hier beschreven experimentele protocol, aangepast uit eerder gepubliceerde onderzoeken19,20,21, bestaat uit een dubbele intraveneuze infusie van 2,5 x 105 Huc-msc om de celengraftment in de muis te verbeteren de longen en het therapeutische effect ervan. In feite, aangezien de procedure is nontraumatic, het kan worden herhaald in hetzelfde dier, maar een periode van 7 dagen tussen twee opeenvolgende injecties wordt aanbevolen, om de reparatie van eventuele vasal wonden. Bovendien gebruikten we Isofluraan inademing om de C57BL/6 muizen te anesthetiseren tijdens de ingreep, om letsel aan de staart ader te voorkomen in geval van plotselinge verplaatsingen van dieren.
Concluderend, dit protocol is met succes toegepast voor het efficiënt induceren van pulmonale fibrose in C57BL/6 muizen en om het in vivo antifibrotische effect van huc-msc te valideren. Deze methode kan ook worden gebruikt voor het toedienen van drugs of andere agenten dan bleomycine in de luchtweg, om verschillende experimentele longziekte modellen te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie RF-2011-02352331 van Ministero Italiano della Salute (aan Armando Gabrielli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis? Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M.
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
