Summary
Aqui nós apresentamos um método eficaz para investigar a atividade antifibróticos de pilhas stromal mesenquimais humanas infundidas intravenosamente obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro que segue a indução de ferimento de pulmão por uma injeção endotraqueal da bleomicina em C57Bl /6 ratos. Este protocolo pode facilmente ser estendido ao teste pré-clínico de outras terapêuticas.
Abstract
A fibrose pulmonar é uma marca registrada de várias doenças pulmonares humanas com uma etiologia diferente. Como as terapias atuais são bastante limitadas, os modelos de mouse continuam a ser uma ferramenta essencial para o desenvolvimento de novas estratégias antifibróticas. Aqui nós fornecemos um método eficaz para investigar in vivo a atividade antifibróticos de pilhas stromal mesenquimais humanas obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro (HUC-msc) em atenuar ferimento Bleomycin-induzido do pulmão. C57BL/6 camundongos recebem uma única injeção endotraqueal de bleomicina (1,5 U/kg de peso corporal) seguida por uma dupla infusão de hUC-MSC (2,5 x 105) na veia cauda, 24 h e 7 dias após a administração de bleomicina. Em cima do sacrifício nos dias 8, 14, ou 21, as mudanças inflamatórios e fibrótica, o índice do colagénio, e a presença de HUC-msc no tecido de pulmão explantados são analisadas. A injeção de bleomicina na traqueia do camundongo permite a segmentação direta dos pulmões, levando a uma extensa inflamação pulmonar e fibrose. A administração sistemática de uma dose dobro de HUC-MSC conduz ao embotamento adiantado da lesão de pulmão Bleomycin-induzida. Intravenosamente infundido hUC-MSC são transientemente enenxertados nos pulmões do rato, onde exercem a sua atividade anti-inflamatória e antifibrótica. Em conclusão, este protocolo foi aplicado com sucesso para o teste pré-clínico de hUC-MSC em um modelo experimental do rato da fibrose pulmonaa humana. No entanto, essa técnica pode ser facilmente estendida tanto para estudar o efeito de diferentes substâncias endotraquemalmente administradas na fisiopatologia dos pulmões quanto para validar novas terapias sistêmicas anti-inflamatórias e antifibróticas.
Introduction
A fibrose pulmonar é um processo patológico progressivo caracterizado pela deposição excessiva de componentes da matriz extracelular, principalmente colágeno tipo I, no interstício pulmonar, levando a comprometimento da função pulmonar. É a indicação de diversas doenças de pulmão humanas com uma etiologia diferente e representa um fator prognóstico clínico pobre. Desde que as terapias atuais são rather limitadas1, os modelos do rato continuam a ser uma ferramenta essencial para a investigação mais adicional dos mecanismos patogénicos que influenciam o início e a progressão da doença e para desenvolver o antifibróticos novo estratégias2,3.
Até o momento, a administração de bleomicina tem sido o modelo mais comumente aplicado de fibrose pulmonar induzida experimentalmente4. Ao lado de múltiplos métodos de entrega (incluindo intravenoso, intraperitoneal, subcutâneo e inalatório), injeções intratraqueal ou endotraqueal de bleomicina emergiram como as rotas mais freqüentemente utilizadas4,5. O método que descrevemos neste documento foi desenvolvido para evitar o efeito escaldamento da bleomicina na mucosa traqueal. De fato, exteriorizando a traquéia e visualizando-o através de um microscópio de operação, é possível alcançar a instilação de todo o volume de solução de bleomicina diretamente na via aérea inferior, sem derrames nas vias aéreas superiores. Quando a perícia cirúrgica exigida e a instrumentação estão disponíveis, este método permite a indução segura, robusta, e reprodutível da inflamação e da fibrose do pulmão, como relatado abaixo.
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Protocol
Todos os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Ministério da saúde italiano (autorização n. 456/2016-PR) e realizados de acordo com as convenções da declaração de Helsínquia.
1. os ratos
- Depois de comprá-los, permitir que os camundongos para aclimatar por pelo menos 7 dias antes da injeção.
Nota: camundongos foram alojados na instalação animal condições livres de patógenos, foram mantidos temperatura constante e umidade em um ciclo de luz/escuro de 12 h, e receberam acesso livre à água e alimentos padrão da pelota. - Use camundongos C57BL/6 fêmeas e injete-os em 12 a 16 semanas de idade.
2. injeção endotraqueal de bleomicina
- Preparação da bleomicina
Atenção: com base no sistema globalmente harmonizado de classificação e rotulagem de produtos químicos (GHS), a bleomicina é classificada como um risco para a saúde GHS08.- Prepare a bleomicina um capuz químico.
- Para obter a concentração de trabalho desejada (0, 5 U/100 μL), Ressuspender 15 U de sulfato de bleomicina liofilizado em 30 mL de soro fisiológico estéril.
- Misture cuidadosamente a amostra invertendo o tubo para evitar a formação de coágulos.
- Rotule corretamente o tubo com a data do Resuspension, armazene-o em 4 ° c, e use seu índice dentro de 24 h.
- Antes da instilação, equilibram a solução de bleomicina para a temperatura ambiente.
Nota: neste experimento, foi utilizada uma dose única de 1,5 U/kg de peso corporal de bleomicina para induzir lesão pulmonar em camundongos C57BL/6. No entanto, cada cepa do rato tem uma sensibilidade diferente à bleomicina6,7. A titulação da bleomicina deve ser realizada para determinar a dose ideal na cepa do mouse usada para os experimentos.
- Anestesia
- Prepare a anestesia dissolvendo 0,2 g de 2, 2, 2-tribromoetanol em 9 mL de soro fisiológico estéril e 1 mL de etanol absoluto (a uma concentração de trabalho de 20 mg/mL).
- Misture completamente invertendo o tubo para evitar a formação de coágulos.
- Rotule corretamente o tubo com a data da preparação, armazene-o em 4 ° c na escuridão, e use-o dentro de 3 dias.
- Anestesie os camundongos com uma injeção intraperitoneal de 250 μL de solução de tribromoetanol (com uma dose final de 200 mg/kg de peso corporal) por rato, utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G.
Nota: com esta dose, os ratinhos estão inconscientes durante pelo menos 20 min. Quando necessário, ajuste a dosagem de acordo com a resposta do mouse, em consulta com o veterinário. - Monitore a respiração do mouse. A taxa de respiração vai abrandar ligeiramente. Depois de alguns minutos, aperte um dos pés do mouse para verificar a falta de reflexo do pedal.
- Injeção endotraqueal
- Manter condições assépticas durante todo o procedimento. Use instrumentos cirúrgicos estéreis e materiais, usar luvas estéreis e evitar o contato com qualquer superfície não-estéril.
- Deite-se o mouse anestesiado em suas costas em uma plataforma cirúrgica e segurá-lo no lugar delicadamente fixando suas pernas com tiras de fita cirúrgica.
Nota: a gravação suave das pernas do rato é recomendada para evitar que o rato deslize para fora da plataforma cirúrgica durante a sua rotação (passo 2.3.10). - Coloque o mouse sobre esteira aquecida para manter a temperatura retal estável a 37 ° c durante toda a intervenção. Medir a temperatura retal por uma sonda retal.
- Gentilmente hyperextend o pescoço do mouse, colocando um travesseiro, por exemplo, um rolo de algodão dental, sua região cervical.
- Raspar suavemente a garganta com uma lâmina de barbear.
- Remova o cabelo da área cirúrgica com álcool e desinfete a pele do rato diversas vezes com solução do Povidone-Iodo de 1%.
- Belisque a pele com um par de fórceps anatômicos e faça uma incisão curta na correspondência do músculo esterno do rato, usando um par de tesouras Blunt anel-tratadas, curvadas.
Nota: a incisão da pele é de cerca de 0,5 cm de comprimento. A parte correspondente da pele que é removida é tão pequena que não criará nenhuma tensão no pescoço do rato. - Pare o sangramento com varas de lã de algodão.
- Exteriorize a traquéia por dissecção sem corte, gentilmente limpá-lo de gordura e outros tecidos.
- Gire a plataforma cirúrgica para orientar o mouse com a cabeça em direção ao operador.
Nota: esta posição permite que o operador, durante a injecção, para o ângulo da seringa de modo que segue o caminho natural da traquéia em linha reta para os pulmões. - Coloque o mouse um microscópio de operação para ajudar com a visualização da traquéia. Ajuste a iluminação e defina a ampliação (entre 1 e 1,2), foco e nitidez. A traquéia pode ser facilmente distinguida como um tubo translúcido branco, e os anéis traqueais são claramente visíveis.
- Misture a solução de bleomicina introduzindo suavemente a pipetagem e Aspire 100 μL para uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 25 G, evitando a formação de bolhas.
- Uma vez que a traquéia em visualizado claramente, perfurá-lo com cuidado com a ponta da agulha em um ângulo de 30 ° (Figura 1a).
- Lentamente incutir 100 μl de bleomicina ou soro fisiológico estéril (controle do veículo) diretamente no lúmen da traquéia. Aguarde alguns segundos até que todo o volume viaja para baixo da agulha e, em seguida, removê-lo da traquéia.
- Observe alguns segundos de apneia, que ocorre quando a agulha é inserida corretamente na traquéia para que o mouse inspire imediatamente todo o volume do líquido.
- Se o rato não inalar o líquido, monitorize cuidadosamente a sua respiração e ajuste a posição da agulha. Se o mouse parar de respirar, remova imediatamente a agulha e deixe o mouse retomar a respiração normalmente antes de reinseri-lo.
- Elimine com segurança a seringa e a agulha após a injecção.
- Feche a fáscia subcutânea e a ferida cutânea com uma sutura 5-0 absorvível.
Nota: quando não completamente reabsorvido, retire as suturas 7-10 dias após a cirurgia.
- Recuperação de animais
- Coloc o rato injetado em seu lado em uma almofada de aquecimento para a recuperação.
- Monitore o rato respirando e observe o rato até que comece mover-se e recupere o decúbito esternal e a consciência cheia.
- Uma vez que é confirmado que o mouse está em boas condições, devolvê-lo para a gaiola original. Não devolvê-lo à empresa de outros animais até que tenha recuperado totalmente.
- Para garantir a analgesia prolongada e evitar qualquer dor pós-intervencionista residual, administrar por via subcutânea buprenorfina (em uma dose final de 0, 5 mg/kg de peso corporal) para o mouse a cada 12 h post injeção endotraqueal.
- Examine os camundongos por 24 h após a injeção endotraqueal de bleomicina e fazê-lo duas vezes por dia. Monitore os camundongos para desconforto respiratório, perda de peso, anormalidades do comportamento e para qualquer sinal de morbidade.
3. infusão da veia de cauda de pilhas stromal mesenquimais do cabo de cordão umbilical humano
- Preparação de células
Nota: a isolação, a caracterização, e o cultivo de pilhas stromal mesenquimais do cordão umbilical humano foram descritos previamente8,9,10. hUC-MSC deve ser manipulado e infundido assepticamente; Portanto, executar todas as etapas um capuz estéril.- Expandir o hUC-MSC em 75 cm2 frascos de cultura para passagens iniciais (1 – 3 máximo).
Nota: o hUC-MSC deve ser 70% confluente no dia da sua infusão em camundongos. - Lave as células com 10 mL de soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) à temperatura ambiente.
- Adicionar 2 mL de tripsina e incubar as células a 37 ° c durante cerca de 1 min, até que comecem a desanexação.
- Neutralize a tripsina adicionando 8 mL de meio completo de hUC-MSC contendo 10% de soro bovino fetal (FBS).
- Coletar as células por centrifugação em 350 x g por 10 min.
- Suspender a pelota em soro fisiológico estéril e contar as células usando uma câmara de Bürker. Prepare a suspensão da célula para perfusão diluindo as células para uma concentração final de 2,5 x 105 em 200 μL de soro fisiológico estéril por rato. Prepare uma suspensão de excesso de células para garantir que haja volume suficiente para a infusão de todos os camundongos.
- Mantenha as células no gelo antes da infusão. Inutilização dentro de algumas horas, conforme descrito na seção 3,3.
- Expandir o hUC-MSC em 75 cm2 frascos de cultura para passagens iniciais (1 – 3 máximo).
- Anestesia
Nota: a fim de minimizar o risco de danificar a veia da cauda do rato durante a injecção, o rato não deve mover-se. Conseqüentemente a anestesia foi preferida sobre a contenção simples do rato.- Anestesie os camundongos por inalação de isoflurano a 4% em uma câmara de indução.
- Monitore a respiração do mouse. A taxa de respiração vai abrandar ligeiramente. Depois de alguns minutos, aperte um dos pés do mouse para verificar a anestesia adequada.
- Infusão da veia de cauda
- Uma vez que a inconsciência foi confirmada, coloc o rato uma capa estéril para a infusão intravenosa asséptica de hUC-MSC.
- Manter a anestesia geral durante todo o experimento através de uma máscara facial com um fluxo contínuo de 1,5% isoflurano.
- Para promover a vasodilatação e permitir uma injeção mais fácil, mergulhe a cauda do mouse em água morna por 2 min.
- Misture a suspensão da célula introduzindo suavemente a pipetagem para se certificar de que as células não formam aglomeração. Aspirar 200 μL para uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G, evitando a formação de bolhas.
- Segure a cauda do mouse pela ponta e endireite-a suavemente.
- Localize a veia lateral da cauda do mouse; delicadamente raspe-o com um bisturi e limpe-o com 70% de etanol.
Nota: delicadamente raspagem da cauda é realizada para remover o cabelo, tornando o local de injeção mais suave e mais limpo. - A partir da porção distal da cauda, inserir a agulha na veia em um ângulo de 15 ° e inutilizar lentamente 200 μL de hUC-MSC ou soro fisiológico estéril (controle do veículo) (Figura 1b).
- Monitore a infusão intravenosa bem sucedida pelo líquido que entra na veia sem resistência e por uma falta do extravasação. Aguarde alguns segundos até que todo o volume Viaje pela agulha e, em seguida, retire-o da veia.
- Para evitar hemorragias, aplique brevemente pressão na ferida de entrada com uma gaze estéril.
- Elimine com segurança a seringa e a agulha após a perfusão.
- Recuperação de animais
- Coloc o rato infundido em seu lado em uma almofada de aquecimento para a recuperação.
- Monitore o rato respirando e observe o rato até que comece mover-se e recupere o decúbito esternal e a consciência cheia.
- Uma vez que é confirmado que o mouse está em boas condições, devolvê-lo para a gaiola original. Não devolvê-lo à empresa de outros animais até que tenha recuperado totalmente.
- Examine os camundongos para 24 h após a infusão da veia cauda e todos os dias, para monitorar o seu estado de saúde e detectar qualquer sofrimento ou sinal patológico precoce.
4. processo do explante e do tecido do órgão
- Sacrifique os camundongos nos dias 8, 14 ou 21 após a administração de bleomicina (Figura 1C) por overdose de anestésico injetável.
- Extirpar a traquéia e os pulmões e lave-os imediatamente na PBS gelada.
- Encaixe-congele os pulmões direito no nitrogênio líquido e armazene-os em-80 ° c para uma análise molecular subseqüente10.
- Inflar os pulmões esquerdos com paraformaldeído a 4% e corrigi-los em solução de formalina com tampão neutro a 10% por 24 h; em seguida, desidratá-los em séries de álcool classificados, limpe-os em xileno, e inseri-los em parafina10.
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Representative Results
A lesão pulmonar foi induzida por uma única injeção endotraqueal de 1,5 U/kg de peso corporal de sulfato de bleomicina em 100 μL de soro fisiológico estéril. Os animais de controle receberam uma injeção endotraqueal de um volume igual de soro fisiológico. Dois tiros de hUC-MSC (2,5 x 105 em 200 μL de soro fisiológico estéril) foram infundidos na veia da cauda do camundongo, 24 h e 7 dias após a administração da bleomicina. Os animais de controlo receberam uma perfusão intravenosa de um volume igual de soro fisiológico estéril. Os camundongos foram sacrificados para o explante pulmonar e o processamento tecidual nos dias 8, 14 e 21 após a administração da bleomicina (Figura 1).
Nós demonstramos que uma instilação direta da bleomicina na traquéia do rato permitiu uma difusão rápida para baixo aos pulmões, tendo por resultado a inflamação extensiva, a fibrose progressiva, e uma distorção de sua arquitetura normal, consistentemente com estudos anteriores 11. as alterações histopatológicas do pulmão foram avaliadas por hematoxilina-eosina (H & e) e coloração vermelha de picrosirius10, e a fibrose foi confirmada por um aumento do conteúdo de hidroxiprolina e deposição de colágeno (Figura 2). As alterações inflamatórias no tecido foram avaliadas por um sistema de escore histológico baseado na infiltração inflamatória em torno de bronquíolos, brônquios e vasos sanguíneos, e pneumonia intersticial observada em seções pulmonares coradas de hematoxilina-eosina10. Após a injeção de bleomicina, o escore de Ashcroft de seções pulmonares aumentou progressivamente de um valor médio de 1,5 no dia 8 para um valor médio de 4,5 no dia 14 e de 6,5 no dia 2110. A dupla infusão de hUC-MSC na veia da cauda do camundongo atenuou em grande parte a lesão pulmonar induzida por bleomicina, com redução significativa, embora não completa, tanto da infiltração inflamatória quanto da extensão da fibrose em cada ponto de tempo ( Figura 2). A imunocoloração com anticorpos específicos10 mostrou que o HUC-MSC infundido ràpida e eficazmente alcangou os pulmões do rato, embora somente algumas pilhas fossem detectadas, com um número de diminuição do dia 8 ao dia 21 (Figura 3). Como relatado previamente12, estes dados sugerem uma deslocação rápida das pilhas do local da lesão, apesar de seu efeito protetor prolongado. A mancha de Immunohistochemistry (IHC) de hUC-MSC foi executada, também nas amostras Saline-tratadas, mas nenhuma pilha podia ser detectada, dada a ausência de focos inflamatórios que atraem hUC-MSC.
Figura 1: esquema do protocolo experimental. (A) camundongos receberam uma única injeção endotraqueal (e.t.) de 1,5 U/kg de peso corporal de bleomicina para induzir lesão pulmonar (dia 0). (B) uma infusão intravenosa dobro (i.v.) de 2,5 x 105 pilhas stromal mesenquimais humanas obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro (HUC-msc) foi executada 24 h (dia 1) e 7 dias (dia 7) após a administração do bleomicina. (C) um cronograma das injeções e momentos de sacrifício é mostrado aqui. Os grupos de camundongos foram sacrificados nos dias 8, 14 e 21 após a administração de bleomicina (i.e., 24 h, 7 dias e 14 dias após a segunda infusão de hUC-MSC, respectivamente). Este número foi modificado de Moroncini et al. 10. please estalam aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o hUC-MSC downregula a inflamação e a fibrose pulmonar induzida por bleomicina. (A e B) Imagens microscópicas representativas (ampliação de 10x) de hematoxilina-eosina (H & E) e coloração vermelha de picrosirius de seções pulmonares obtidas de camundongos C57BL/6, 21 dias após a injeção endotraqueal de soro fisiológico estéril (soro fisiológico) ou bleomicina (bleomicina), a o último seguiu também por uma infusão intravenosa de hUC-MSC (Bleomycin + hUC-MSC) ou de soro fisiológico estéril (Bleomycin + Saline). Os controles salinos demonstraram uma arquitetura pulmonar normal. Os infiltrados inflamatórios difundidos foram observados 21 dias após a lesão do bleomicina, com uma distorção severa da arquitetura do pulmão e a formação de focos fibrótica. As alterações induzidas por bleomicina foram significativamente atenuadas pelo tratamento com hUC-MSC, mas não por soro fisiológico. (C) conteúdo de hidroxiprolina nos dias 8, 14 e 21 nos pulmões de camundongos C57Bl/6 que receberam os tratamentos supracitados. Os resultados são a média ± DP (n = 8 por grupo), expressa em percentagem do valor obtido a partir de camundongos tratados com soro fisiológico endotraqueal e são representativas de três experimentos independentes. *P < 0, 5, * *p < 0, 1, comparado com camundongos tratados com bleomicina. (D) os níveis de expressão do mouse Col1A1 em mRNA pulmonar total obtidos nos dias 8, 14 e 21 dos camundongos C57Bl/6 que receberam os tratamentos acima mencionados. Os resultados são a média ± DP (n = 5 por grupo) e são representativos de três experimentos independentes realizados em triplicado. *P < 0, 5, * *p < 0, 1, comparado com camundongos tratados com bleomicina. Este número foi modificado de Moroncini et al. 10. please estalam aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: detecção de hUC-msc no tecido pulmonar. (A e B) imagens microscópicas representativas (ampliação de 200x e 400X, respectivamente) de imunocoloração com anticorpo anti-HLA-1 de seções pulmonares obtidas de camundongos C57Bl/6 recebendo bleomicina endotraqueal seguida de hUC-MSC. As setas vermelhas indicam hUC-MSC com coloração positiva. (C) GAPDH humano avaliado pelo ensaio quantitativo em tempo real da reacção em cadeia do polymerase (PCR) no mRNA inteiro extraído do HUC-MSC cultivado antes da infusão (HUC-MSC infundido) ou do tecido pulmonar nos dias 8, 14, e 21 de C57Bl/6 ratos que recebem endotraqueal bleomicina seguido pelo HUC-MSC intravenoso (bleomicina + HUC-msc). Os resultados são a média ± DP (n = 5 por grupo) e são representativos de três experimentos independentes realizados em triplicado. Da nota, a fonte de transcrição humana de GAPDH neste protocolo experimental pode ser fornecida exclusivamente pelo hUC-MSC intravenosamente infundido. Este número foi modificado de Moroncini et al. 10. please estalam aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A administração endotraqueal é a via preferencial para a entrega de agentes exógenos nos pulmões. Desde há vários anos, a injeção direta de bleomicina na traquéia tem sido amplamente utilizada para induzir a fibrose pulmonar13 e, recentemente, técnicas mais avançadas e não invasivas têm sido desenvolvidas para realizar esta14,15 ,16.
O método descrito aqui fornece vários benefícios significativos sobre algumas limitações potenciais. A injeção da traquéia requer uma intervenção cirúrgica, levando consigo o potencial de complicações causadas pelo próprio procedimento, juntamente com a necessidade de sedação profunda dos animais. Portanto, é necessária uma boa preparação e prática para aperfeiçoar o procedimento. Além disso, para minimizar o sofrimento do rato, é imperativo ajustar a dose apropriada de anestésico de acordo com a tensão do rato e à resposta individual e manter uma observação rigorosa do estado animal da sedação. No entanto, observou-se uma taxa muito baixa de mortalidade e ótima recuperação animal da anestesia. A cetamina e a xilazina podem ser usadas para anestesia, bem como para tribromoetanol. No entanto, em camundongos, a dose efetiva de cetamina e xilazina está próxima da dose letal; assim, eles podem facilmente induzir uma parada respiratória. Inversamente, a dosagem do tribromoetílico pode facilmente ser ajustada e é, assim, um agente anestésico preferível. Após a injeção endotraqueal de bleomicina na traquéia, não observamos nenhum efeito adverso. Os ratos estavam livres da febre e nenhum sinal da inflamação ou da infecção foi observado em torno da traqueia e da ferida da pele. Conseqüentemente, não havia nenhuma necessidade para a profilaxia antibiótica. Além disso, o uso de um microscópio de funcionamento assegura uma confiança elevada do sucesso permitindo que o operador monitore exatamente a colocação correta da agulha na traqueia do rato antes da instilação, assim minimizando o risco de danificá-la.
A injeção endotraqueal de bleomicina resulta em uma potente resposta inflamatória e fibrótica em ambos os pulmões e pode ser vista como um método robusto para gerar modelos experimentais de camundongo de doenças pulmonares intersticiais humanas (DPI). Entretanto, como documentado previamente7, a resposta fibrótica à bleomicina nos ratos é tensão-dependente e gender-e idade-relacionado. Portanto, é fundamental para o sucesso do protocolo para encontrar a dose tolerável de bleomicina em cada ambiente experimental. Camundongos fêmeas foram utilizados neste estudo porque o principal interesse nesta pesquisa foi a doença pulmonar intersticial associada à esclerose sistêmica, que é uma doença largamente prevalente em fêmeas adultas jovens. Camundongos de três a quatro meses de idade foram escolhidos porque esta é a idade em que eles apenas entram na fase adulta (camundongos atingir a maturidade sexual em 8-12 semanas de idade)17. Assim, eles são considerados camundongos adultos jovens e são preferíveis em relação aos animais mais jovens, uma vez que a fibrose pulmonar não é comum em indivíduos muito jovens. Eles também são preferíveis em relação aos animais mais velhos, já que estudos anteriores18 demonstraram que os camundongos idosos exibiram alterações no fenótipo do fibroblasto pulmonar, levando a uma maior suscetibilidade à desreparação e fibrose após lesão pulmonar, que pode representar um possível viés no modelo experimental aqui apresentado.
A infusão da veia da cauda é uma maneira simples, de confiança, e não invasora para assegurar a entrega rápida e eficaz das drogas à circulação sanguínea. Pode facilmente ser executado com equipamento médico simples, treinamento manual curto, e custos reduzidos.
O protocolo experimental descrito aqui, modificado dos estudos previamente publicados19,20,21, existe de uma infusão intravenosa dobro de 2,5 x 105 HUC-msc para realçar o Engraftment da pilha no rato pulmões e seu efeito terapêutico. Na verdade, uma vez que o procedimento é não traumático, pode ser repetido no mesmo animal, mas um período de 7 dias entre duas injeções consecutivas é recomendado, para permitir a reparação de eventuais feridas Vasal. Além disso, utilizou-se a inalação de isoflurano para anestesiar os camundongos C57BL/6 durante o procedimento, para evitar lesão da veia cauda em caso de movimentos bruscos de animais.
Em conclusão, este protocolo foi aplicado com sucesso para induzir eficientemente a fibrose pulmonaa em ratos C57BL/6 e para validar o efeito antifibrtic in vivo de HUC-msc. Este método também pode ser utilizado para administrar medicamentos ou agentes que não sejam a bleomicina nas vias aéreas, a fim de gerar diferentes modelos experimentais de doença pulmonar.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção RF-2011-02352331 de Ministero italiano della Salute (para Armando Gabrielli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
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