Summary
यहां, हम एक गैर विनाशकारी नमूना प्रक्रिया का उपयोग कर, फूल खिलने से पुष्प खुशबू volatiles इकट्ठा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
कई फूल परिवारों की सुगंध का नमूना लिया गया है और volatiles का विश्लेषण किया गया है । सुगंध बनाने वाले यौगिकों को जानना उन फूलों के संरक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है जो खतरे में हैं या खतरे में हैं। क्योंकि परागणकों को आकर्षित करने के लिए पुष्प सुगंध महत्वपूर्ण है, इस विधि का उपयोग परागण को बेहतर ढंग से समझने या बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। हम पुष्प सुगंध वोलेटाइल्स इकट्ठा करने के लिए पोर्टेबल चारकोल एयर फिल्टर और वैक्यूम का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसका विश्लेषण जीसी-एमएस द्वारा किया जाता है। इस विधि का उपयोग करके, सुगंध वोलेटाइल्स को एक मशीन के साथ गैर-विनाशकारी विधि का उपयोग करके नमूना लिया जा सकता है जिसे आसानी से ले जाया जाता है। यह पद्धति एक तेजी से नमूना प्रक्रिया का उपयोग करती है, नमूना समय को 2-3 घंटे से लगभग 10 मिनट तक काटती है। जीसी-एमएस का उपयोग करके, प्रामाणिक मानकों के आधार पर सुगंध यौगिकों को व्यक्तिगत रूप से पहचाना जा सकता है। सामग्री सेटअप से लेकर डेटा आउटपुट एकत्र करने तक सुगंध और नियंत्रण डेटा एकत्र करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चरणों को प्रस्तुत किया जाता है।
Introduction
फूल आम तौर पर परागणकों को आकर्षित करने के लिए उपयोग की जाने वाले सुगंध का उत्पादन करते हैं। ये सुगंध कई रासायनिक यौगिकों से बनी होती हैं , जो एक साथ पुष्प मिश्रण1,2,3के रूप में कार्य करती हैं । इन सुगंध के बिना, फूल परागणकों का उपयोग करके अपनी आनुवंशिक जानकारी पर पारित होने की संभावना कम होगी। पुष्प खुशबू कई फूल संयंत्र परिवारों में प्रलेखित किया गया है, ऑर्किडेसी के साथ अधिक आम परिवारों में से एक जा रहा है4का अध्ययन किया । परागण में पुष्प सुगंध की भूमिका को समझने के लिए, दिन के विभिन्न समयों पर फूलों से उत्सर्जित किए जा रहे रासायनिक यौगिकों को इकट्ठा करने और विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है और कई दिनों के दौरान सप्ताहों के दौरान फूल खिलता खुला होता है, क्योंकि सुगंध समय के साथ भिन्न हो सकती है5।
हीथ और मानुकेन6द्वारा इस प्रकार के नमूने के लिए एक प्रारंभिक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था । उनके नमूने के तरीकों का लक्ष्य नमूना (जैसे, पौधों, कीड़ों) का अध्ययन किया जा रहा है पर तनाव को कम करना था। इससे पहले के कागजात में प्रलेखित किया गया था कि सुगंध एकत्र करने के लिए खिलने वाले फूलों को हटाने जैसे पौधे के लिए विनाशकारी प्रक्रियाओं की आवश्यकता थी। कैनसिनो और डैपर7,8 द्वारा हाल ही में पुष्प खुशबूप्रकाशनों नेइसी तरह के तरीकों का उपयोग किया। इस अध्ययन ने फूलों को कांच के कक्षों में डाल दिया और उनके ऊपर शुद्ध हवा पारित की; फिर कक्ष से सुगंध यौगिकों को स्पष्ट पाश्चर पिपेट में असुरक्षित बहुलक एडोरबेंट्स पर अवशोषित किया गया था। सुगंध इस अध्ययन के दौरान कम से कम दो घंटे के लिए एकत्र किए गए थे। सैलर एट अल9 दक्षिण फ्लोरिडा में एक एपिफाइटिक आर्किड पर पुष्प खुशबू अध्ययन किया, बहुत मूल अध्ययन10की तरह । फिर, इस अध्ययन के लिए फूलों की आवश्यकता के लिए दो घंटे से अधिक के लिए नमूना के लिए खुशबू volatiles इकट्ठा, खुशबू के साथ असुरक्षित बहुलक adsorbent पर एकत्र । यहां कागज एक गैर विनाशकारी विधि है कि बहुत जल्दी नमूना के लिए अनुमति देता है, केवल 10 मिनट तक चलने प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, ग्लास चैंबर ओवन बेकिंग बैग का उपयोग करने के बजाय उपयोग किया जाता है, जो कक्ष के अधिक लचीले आंदोलन के लिए अनुमति देता है और फूलों को नुकसान की संभावना को कम करता है। ये बैग कई आकारों में आते हैं जो बैग के आकार का चयन करने का विकल्प देते हैं जो नमूने या आसपास की सामग्री को नुकसान पहुंचाए बिना आसानी से व्यक्तिगत नमूनों को फिट कर देगा। इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला एडोबेंट टेनेक्स असुरक्षित बहुलक एसोर्बेंट था। यह Porapak से अलग है, क्योंकि नमूना थर्मल विश्लेषण के लिए जीसी-एमएस कॉलम पर desorbed किया जा सकता है, एक रासायनिक विलायक के उपयोग को नष्ट करने ।
इस अध्ययन में विधियां फूलों द्वारा उत्पादित सुगंध वोलेटाइल्स का नमूना लेने का एक तरीका प्रदान करती हैं और इसका उपयोग अन्य नमूनों से भी, जैसे कीट फेरोमोन, या मशरूम वोलेटाइल्स के नमूने के लिए किया जा सकता है। सैंपलिंग के लिए कम समय का मतलब है कि सैंपल पर कम तनाव होता है और कम समय में कई सैंपल इकट्ठा करने की क्षमता होती है। उदाहरण के लिए, सैलर एट अल9में, फूल रात में केवल सुगंधित था, इसलिए हर रात केवल दो या तीन नमूने एकत्र किए जा सकते थे। यहां विधि के साथ एक ही फूल से 15-20 मिनट के अंतराल पर पूरी रात नमूने लिए जा सकते थे। इसके अतिरिक्त, कांच कक्षों के बजाय बैग का उपयोग करके, हेडस्पेस को लुप्तप्राय या धमकी दी गई पौधों की प्रजातियों पर सीटू संग्रह के लिए क्षेत्र में नमूने के लिए आसान निलंबित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग करके, हम जमीन से 1.5 से 2 मीटर ऊपर फूलों का नमूना लेने में सक्षम थे। ये विधियां प्रयोगशाला और क्षेत्र में सुगंध संग्रह के लिए अविश्वसनीय रूप से उपयोगी हैं, और शोधकर्ताओं को एक नमूना तकनीक प्रदान करती है जो नमूने के लिए तेज और गैर-विनाशकारी है।
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Protocol
नोट: इत्र या सुगंधित लोशन और उत्पादों को इनमें से किसी भी प्रक्रिया के दौरान नहीं पहना जाना चाहिए।
1. फूल चयन
नोट: इस्तेमाल फूल या तो स्वाभाविक रूप से पर्यावरण में बढ़ रहा है या कृत्रिम पर्यावरण की स्थिति में रखा जा सकता है । संग्रह के दौरान तापमान, आर्द्रता और प्रकाश स्तर उपयोग की जाने वाली विशिष्ट फूल प्रजातियों के आधार पर भिन्न हो सकता है, और किस प्रकार का डेटा एकत्र किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, डेटा दिन के दौरान और रात में एक ही फूल के लिए एकत्र किया गया है निर्धारित करने के लिए अगर खुशबू दिन के समय के साथ बदलता है, और दोनों सीटू और ग्रीनहाउस फूलों में से एकत्र की ।
- नमूना संग्रह समय को मानकीकृत करने के लिए, शुरू में खोले गए फूल का चयन करें। यह समय के साथ सुगंध बदलने वाले फूल के लिए नियंत्रित करता है।
- खिलने के समय की अवधि के आधार पर, यदि संभव हो, तो नमूना एकत्र करने के लिए खिलने के बाद कम से कम 24 घंटे इंतजार करें, सभी नमूनों के लिए एक मानक समय निर्धारित करें।
- यदि एक पौधे पर कई खिलने वाले फूल हैं, तो उस व्यक्ति को चिह्नित करें जिसका उपयोग हरी झंडी दिखाने वाले टेप या उसी फूल के बार-बार नमूने सुनिश्चित करने के समान कुछ के साथ किया जाएगा।
2. सामग्री तैयार करना
- ओवन बैग (लगभग 40.5 सेमी × 44.5 सेमी) और नालीदार पीटीएफई ट्यूबिंग का उपयोग करें।
- प्रारंभ में, अवशिष्ट प्लास्टिक यौगिकों को हटाने के लिए ~ 30 मिन के लिए पानी में ओवन बैग उबालें। सूखने के लिए, 175 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सेंकना।
- एक बार बैग सूख जाने के बाद, ओवन बैग के बंद छोर के प्रत्येक कोने में पॉलीप्रोपाइलीन बल्कहेड यूनियन जोड़ें। ये अनुलग्नक ट्यूबों के कनेक्शन को चारकोल फ़िल्टर हवा में धकेलने और खुशबू को हेडस्पेस से बाहर खींचने की अनुमति देते हैं।
- 75% इथेनॉल के साथ सभी बैग और ट्यूब कुल्ला। दोनों हवा को कंटिंग करने के बाद सूखने दें।
- ओवन बैग सूख जाने के बाद, कम गर्मी में ओवन में बैग और ट्यूब सेंकना, 30 मिन के लिए लगभग 74-85 डिग्री सेल्सियस।
3. अस्थिर संग्रह
नोट: बाँझ neoprene दस्ताने इस प्रक्रिया में पहना जाना चाहिए, के रूप में बैग या फिल्टर कारतूस से संपर्क नमूनों दूषित कर सकते हैं ।
- चयनित फूल को बेक्ड ओवन बैग से ढक दें। बैग में अवांछित एयरफ्लो को रोकने के लिए फूल के नीचे प्लास्टिक ज़िप टाई के साथ एक साथ बैग को कसकर चिंच करें।
- संग्रह उपकरण के एयर आउटलेट से एक ट्यूब संलग्न करें और इसे ओवन बैग पर बल्कहेड यूनियनों में से एक से जोड़ें।
- अन्य बल्कहेड यूनियन पर, असुरक्षित बहुलक एसोरबेंट वाले ग्लास फिल्टर कारतूस संलग्न करें।
- वैक्यूम इनपुट पर संग्रह उपकरण के लिए एक दूसरी ट्यूब संलग्न करें। ग्लास अस्थिर संग्रह फिल्टर कारतूस पर दूसरी ट्यूब के अंत कनेक्ट करें।
- ~ 0.05 एल/मिन पर सेट एक ही समय में एयर पंप और वैक्यूम दोनों को चालू करें। फूल के चारों ओर हेडस्पेस हवा से भर जाएगा, लेकिन अति-सपाट नहीं हो जाएगा। सिस्टम फिल्टर के माध्यम से बैग से हवा खींच जाएगा, पुष्प volatiles फँसाने ।
- मशीन को 10 मिन के लिए चलाने की अनुमति दें और फिर एयर पंप और वैक्यूम दोनों को बंद कर दें।
नोट: फूल प्रजातियों है कि उत्पादन/खुशबू की एक छोटी राशि उत्सर्जन के लिए समय की एक लंबी अवधि के लिए नमूना की आवश्यकता हो सकती है । - ट्यूब और ग्लास फिल्टर कारतूस को अलग करें। फिल्टर को स्क्रू-ऑन कैप के साथ कांच की शीशी में रखें। एक बार टोपी चालन है, PTFE पाइप धागा टेप के साथ शीशी सील ।
- एक फ्रीजर में स्टोर के नमूनों जब तक जीसी-एमएस का उपयोग कर विश्लेषण किया ।
- एक नियंत्रण के रूप में एक खाली हवा का नमूना इकट्ठा करने के लिए, एक खाली ओवन बैग के साथ इस बार, एक साफ ओवन बैग और ग्लास फिल्टर के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं। यह एकत्र किए गए किसी भी पृष्ठभूमि के अस्थिर ों की पहचान करने की अनुमति देता है।
नोट: दोहरा नमूना संग्रह लगभग एक ही समय में हर दिन किया जाना चाहिए, के रूप में कुछ फूल एक दिन के दौरान अलग खुशबू के स्तर का उत्पादन ।
4. जीसी-एमएस
- फ्रीजर से ग्लास फिल्टर कारतूस निकालें और इंजेक्टर बंदरगाह में एक जीसी-एमएस में जगह है।
- हीलियम गैस (दर: 1.2 mL/min) के प्रवाह के भीतर 8 मिनट के लिए थर्मल संग्रह जाल (TCT) में गर्म करके एसोरतुला से असुरक्षित बहुलक एसोरतुला पर एकत्र किए गए हेडस्पेस वोलेटाइल ्सजारी करें।
- -130 डिग्री सेल्सियस पर टीसीटी कोल्ड ट्रैप यूनिट में डिसोर्बेड यौगिकों को इकट्ठा करें। कोल्ड ट्रैप तापमान जीसी-एमएस कार्यक्रम द्वारा विनियमित किया जाता है।
- फ्लैश हीट टीसीटी कोल्ड ट्रैप यूनिट को गैस क्रोमेटोग्राफ के केशिका कॉलम में यौगिकों को इंजेक्ट करने के लिए, जिससे टीसीटी कोल्ड ट्रैप यूनिट कनेक्ट थी। टीसीटी के लिए विधि -20 डिग्री सेल्सियस से शुरू होती है और 150 डिग्री सेल्सियस पर समाप्त होती है।
- कार्यक्रम जीसी-एमएस 40 डिग्री सेल्सियस से बढ़कर 280 डिग्री सेल्सियस पर 15 डिग्री सेल्सियस/मिन पर, 5 मिन पकड़ के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर।
5. डेटा विश्लेषण
- पहचान के लिए, नमूने के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की तुलना बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा पुस्तकालयों (एनआईएसटी और रासायनिक पारिस्थितिकी विभाग, गोटेबोर्ग विश्वविद्यालय, स्वीडन11)के साथ-साथ अस्थिरों के अवधारण समय को प्रामाणिक यौगिक मानकों12के समय से करें।
- आम पुनर्घटित चोटियों की पहचान करने के लिए एकत्र किए गए बोल्डरके क्रोमेटोग्राम की तुलना करें।
- चोटी के वोलेटाइल्स की पहचान करने के बाद, यह निर्धारित करने के लिए Pherobase (अर्धरसायन और फेरोमोन का ऑनलाइन डेटाबेस) का उपयोग करें कि क्या उन्हें पहले पुष्प सुगंध10में वर्णित किया गया है।
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Representative Results
जीसी-एमएस से प्रतिनिधि डेटा चित्रा 1में एक क्रोमेटोग्राम के रूप में दिखाया गया है । क्रोमेटोग्राम के अलावा, परिणामों की एक डेटा फाइल भी प्रदान की गई है(पूरक फ़ाइल 1)। यह डेटा फ़ाइल प्रत्येक चोटी (आरटी) के लिए प्रतिधारण समय प्रदान करती है, और उस चोटी (लाइब्रेरी/आईडी) किस यौगिक की पहचान करती है। 10:00 और 15:00 मिनट के बीच चोटियों पुष्प volatiles हैं, यौगिकों10के आणविक वजन के कारण । चोटियों के ऊपर की संख्या पहचानकिए गए यौगिकों के प्रतिधारण समय को दर्शाती है जिन्हें परिणामों की डेटा फ़ाइल(अनुपूरक फ़ाइल 1)संदर्भित किया जाता है। प्रत्येक खुशबू नमूने के लिए क्रोमेटोग्राम और डेटा फ़ाइल प्राप्त करके, यौगिकों की तुलना की जा सकती है और प्रत्येक फूल के नमूने के लिए पुनर्घटित होने वाले लोगों की पहचान की जा सकती है। संग्रह श्रेणी "नमूना" के तहत इस दस्तावेज़ से पहचाना जा सकता है, नमूना फूल का प्रतिनिधित्व करने के लिए नामित, और समय और संग्रह की तारीख (उदाहरण: UF1 8AM 03/16/15) । इस दस्तावेज़ के पृष्ठ 1 भी नमूना (LibraryID) से पहचान की विशिष्ट यौगिकों की पहचान से पता चलता है, जो चित्रा 1 से पीक प्रतिधारण समय (पीके #) से मेल खाती है, और कुल खुशबू का प्रतिशत है कि प्रत्येक अस्थिर शामिल (क्षेत्र%)। "लाइब्रेरी/आईडी" के तहत सूचीबद्ध सभी एकत्र किए गए वोलेटाइल्स को Pherobase में संदर्भित किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या उन्होंने पहले पुष्प सुगंध में वर्णित किया है । उदाहरण के लिए, अनुपूरक फाइल 1,यौगिक #21 में, 10.311 के प्रतिधारण समय (आरटी) के साथ बेंडालडिहाइड के रूप में पहचानकी गई है। भविष्य के नमूनों में, यदि बेंजाल्डिहाइड मौजूद है, तो इसे फ्लोरोबेस पर संदर्भित किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि यह फूल के लिए संभावित पुष्प यौगिक है या नहीं। फिगर 2में, बेंजाल्डिहाइड को हीरोबेस पर खोजा गया था। एक बार एक यौगिक का चयन किया गया है, पृष्ठ सभी फूल प्रजातियों की एक सूची से पता चलता है, संयंत्र परिवार द्वारा आयोजित, जिसमें से है कि खुशबू यौगिक की पहचान की गई है । चित्रा 2 के नीचे दाएं कोने में हाइलाइट ऑर्किड प्रजातियों (ऑर्किडेसी) का एक छोटा सा सबसेट है जिसमें से बेंजाल्डिहाइड को पुष्प सुगंध में मौजूद होना निर्धारित किया गया है।
चित्रा 1: जीसी-एमएस अस्थिर पीक परिणाम । ग्राफिकल परिणाम पुष्प खुशबू नमूना के चरम volatiles दिखा। चोटियों के ऊपर की संख्या सभी एकत्र अस्थिर यौगिकों की एक सूची के अनुरूप है, विशिष्ट अस्थिर करने के लिए चोटी की पहचान । 10:00 और 15:00 मिनट के बीच चोटियों सबसे एक पुष्प खुशबू से volatiles होने की संभावना है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: Pherobase उदाहरण परिणाम। एक खुशबू यौगिक के लिए एक Pherobase खोज से परिणामों का एक उदाहरण। इस आंकड़े में बेंजाल्डिहाइड की तलाश की गई थी, और परिणाम उन सभी फूलप्रजातियों की सूची दिखाते हैं जिनसे इस खुशबू की पहचान की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक फ़ाइल 1: परिणाम डेटा। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।
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Discussion
हालांकि इस तकनीक को अपनी नमूना गति और पोर्टेबिलिटी के लिए अविश्वसनीय रूप से मूल्यवान है, एक सीमा यह एपिफाइटिक प्रजातियों के लिए उपयोग कर रहा है, या उन पेड़ों पर बढ़ रही है और जमीन से नहीं । मूल अध्ययन10में, नमूना फूलों में से एक एपिफाइटिक था। क्योंकि मशीन भी स्वतंत्र रूप से लटका भारी है, एक स्थिर, ऊंचा आधार नमूना के लिए बनाया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, मशीन या तो एक बिजली के आउटलेट या बैटरी संचालित करने के लिए खामियों को दूर किया जा सकता है, इसलिए अगर वहां लंबे समय तक क्षेत्र नमूना है, वहां एक शक्ति स्रोत के लिए बैटरी चार्ज जब मशीन का उपयोग में नहीं है होना चाहिए ।
यहां के तरीके सीटू गैर-विनाशकारी नमूने के लिए अनुमति देते हैं, जिसमें तेजी से दोहराया गया नमूना और बहुत तेज नमूना समय होता है। जबकि कुछ पुष्प सुगंध अध्ययनों के लिए सुगंध को एक नमूने के लिए 2-3 घंटे तक एकत्र करने की आवश्यकता होती है, प्रस्तुत विधि ग्लास में उपयोग की जाने वाली संग्रह सामग्री (असुरक्षित बहुलक एसोरबेंट) के कारण लगभग 10 मिन में अस्थिरों को सटीक रूप से एकत्र कर सकती है फ़िल्टर.
ये संग्रह विधियां फूलों द्वारा उत्पादित सुगंध का जल्दी और सुरक्षित रूप से नमूना करने का एक तरीका प्रदान करती हैं, फूलों को नष्ट या नुकसान पहुंचाए बिना। इतने सारे फूलों के साथ, विशेष रूप से परिवार ऑर्किडेसीमें उन लोगों को धमकी दी या लुप्तप्राय के रूप में वर्गीकृत किया जा रहा है, सुगंध का विश्लेषण करना जो वे गैर-विनाशकारी तरीके से उत्पादन कर रहे हैं, महत्वपूर्ण है क्योंकि उनके परागण जीव विज्ञान को समझने के लिए काम किया जाता है। इन अध्ययनों से प्राप्त जानकारी संभवतः खिल ऑर्किड के साथ क्षेत्रों के लिए और अधिक परागण को आकर्षित करने के लिए पाया पीक रसायनों के आधार पर सिंथेटिक मिश्रणों का उपयोग कर परागण को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।
Acknowledgments
यूएसडीए-एआरएस अनुसंधान परियोजना संख्या संख्या 6036-22000-028-00डी । इस प्रकाशन में व्यापार, फर्म या निगम के नाम का उपयोग पाठक की जानकारी और सुविधा के लिए है। इस तरह के उपयोग के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग या किसी भी उत्पाद या सेवा के कृषि अनुसंधान सेवा द्वारा एक आधिकारिक समर्थन या अनुमोदन का गठन नहीं करता है कि उपयुक्त हो सकता है दूसरों के बहिष्कार के लिए । इसके अतिरिक्त, आर्किड बायोलॉजी (2017) में फ्लोरिडा जीव विज्ञान विभाग-लुईस और वरिना वॉन फैलोशिप विश्वविद्यालय, और फ्लोरिडा विश्वविद्यालय ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप (2014-2018) ने भी धन प्रदान किया। हम इस वीडियो के फिल्मांकन के दौरान इस्तेमाल किए जाने वाले आर्किड प्लांट के लिए स्टेटसन यूनिवर्सिटी से सिंडी बेनिंगटन को भी धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
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