Summary
Qui, presentiamo un protocollo per raccogliere la fragranza floreale volatile dai fiori in fiore, utilizzando una procedura di campionamento non distruttivo.
Abstract
Sono state campionate le fragranze di molte famiglie di fiori e sono stati analizzati i volatili. Conoscere i composti che compongono le fragranze può essere un passo importante per la conservazione dei fiori che sono minacciati o in via di estinzione. Poiché la fragranza floreale è fondamentale per attirare gli impollinatori, questo metodo potrebbe essere utilizzato per comprendere meglio o addirittura migliorare l'impollinazione. Vi presentiamo un protocollo utilizzando un filtro ad aria a carbone portatile e un vuoto per raccogliere le sostanze volatili delle fragranze floreali, che vengono poi analizzate da un GC-MS. Utilizzando questo metodo, i volatili delle fragranze possono essere campionati utilizzando un metodo non distruttivo con una macchina che viene facilmente trasportata. Questa metodologia utilizza una procedura di campionamento rapido, riducendo il tempo di campionamento da 2-3 ore a circa 10 minuti. Utilizzando GC-MS, i composti della fragranza possono essere identificati singolarmente, sulla base di standard autentici. Vengono presentati i passaggi utilizzati per la raccolta dei dati relativi alle fragranze e al controllo, dall'impostazione del materiale alla raccolta dell'output dei dati.
Introduction
I fiori producono tipicamente una fragranza utilizzata per attirare gli impollinatori. Queste fragranze sono costituite da molti composti chimici che agiscono tutti insieme come una miscela floreale1,2,3. Senza queste fragranze, i fiori sarebbero meno propensi a trasmettere le loro informazioni genetiche utilizzando impollinatori. La fragranza floreale è stata documentata in molte famiglie di piante da fiore, con Orchidaceae che è una delle famiglie più comuni studiate4. Per comprendere il ruolo della fragranza floreale nell'impollinazione, è importante raccogliere e analizzare in modo non distruttivo i composti chimici emessi dai fiori in diversi momenti della giornata e durante i diversi giorni o settimane le fioriture dei fiori sono aperte, in quanto la fragranza può variare nel tempo5 .
Un protocollo precoce per questo tipo di campionamento è stato sviluppato da Heath e Manukian6. L'obiettivo dei loro metodi di campionamento era quello di ridurre lo stress sul campione (ad esempio, piante, insetti) studiato. I documenti precedenti documentavano che erano necessarie procedure distruttive per la pianta, come la rimozione dei fiori in fiore al fine di raccogliere la fragranza. Più recenti pubblicazioni di fragranze floreali di Cancino e Damon7,8 utilizzato metodi simili. Questo studio mise i fiori in camere di vetro e passò l'aria purificata su di loro; poi composti profumati dalla camera sono stati assorbiti su adsorbenti polimerici porose in pipette Pasteur chiare. Le fragranze sono state raccolte per almeno due ore durante questo studio. Sadler et al.9 ha effettuato studi sulle fragranze floreali su un'orchidea epifita nel sud della Florida, proprio come lo studio originale10. Anche in questo caso, questo studio ha richiesto che i fiori siano campionati per oltre due ore per raccogliere le sostanze volatili della fragranza, con profumo raccolto sull'adsorbente polimerico poroso. Il documento qui presenta un metodo non distruttivo che consente un campionamento molto più veloce, della durata di soli 10 minuti. Inoltre, invece di utilizzare una camera di vetro forno borse da forno, che consentono un movimento più flessibile della camera e ridurre le probabilità di danni ai fiori. Questi sacchetti sono disponibili in diverse dimensioni permettendo la possibilità di selezionare la dimensione del sacchetto che si adatta facilmente singoli campioni senza danneggiare il campione o il materiale circostante. L'adsorbente utilizzato in questo studio è stato Tenax Porous Polymer Adsorbent. Questo è diverso da Porapak, perché il campione può essere riscaldato sulla colonna GC-MS per l'analisi, eliminando l'uso di un solvente chimico.
I metodi in questo studio forniscono un modo per campionare rapidamente le sostanze volatili delle fragranze prodotte dai fiori e potrebbero essere utilizzati anche per campionare sostanze volatili da altri esemplari, come feromoni di insetti o volatili di funghi. Il tempo ridotto per il campionamento significa che c'è meno stress sul campione e la capacità di raccogliere molti campioni in un breve periodo di tempo. Ad esempio, in Sadler et al.9, il fiore era solo profumato di notte, quindi solo due o tre campioni potevano essere raccolti ogni notte. Con il metodo qui, i campioni potrebbero essere prelevati tutta la notte a intervalli di 15-20 minuti dallo stesso fiore. Inoltre, utilizzando sacchetti al posto delle camere di vetro, lo spazio della testa può essere sospeso più facilmente per il campionamento sul campo per la raccolta in situ su specie vegetali in via di estinzione o minacciate. Utilizzando il metodo qui presentato, siamo stati in grado di assaggiare i fiori a 1,5 a 2 metri da terra. Questi metodi sono incredibilmente utili per la raccolta di fragranze in laboratorio e sul campo e forniscono ai ricercatori una tecnica di campionamento che è veloce e non distruttiva per il campione.
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Protocol
NOTA: I profumi o le lozioni profumate e i prodotti non devono essere indossati durante nessuna di queste procedure.
1. Selezione dei fiori
NOTA: I fiori utilizzati possono essere naturalmente in crescita nell'ambiente o tenuti in condizioni ambientali artificiali. Temperatura, umidità e livello di luce durante la raccolta possono variare in base alle specie di fiori specifici utilizzate e al tipo di dati raccolti. Ad esempio, i dati sono stati raccolti durante il giorno e di notte per lo stesso fiore per determinare se la fragranza varia nel tempo del giorno e raccolti sia da in situ che da fiori in serra.
- Selezionare un fiore inizialmente non aperto, per standardizzare il tempo di raccolta dei campioni. Questo controlla per una fragranza che cambia fiori nel tempo.
- A seconda della durata del tempo di fioritura, se possibile, attendere almeno 24 ore dopo la fioritura per raccogliere il campione, impostando un'ora standard per tutti i campioni.
- Se ci sono più fiori in fiore su una pianta, segnare quello che verrà utilizzato con nastro di segnalazione o qualcosa di simile per garantire il campionamento ripetuto dello stesso fiore.
2. Preparazione del materiale
- Utilizzare sacchetti da forno (circa 40,5 cm e 44,5 cm) e tubi PTFE ondulati.
- Inizialmente, far bollire i sacchetti del forno in acqua per 30 min per rimuovere i composti di plastica residui. Per asciugare, cuocere in forno a 175 gradi centigradi.
- Una volta asciugati i sacchetti, aggiungere un'unione di paratie in polipropilene ad ogni angolo dell'estremità chiusa dei sacchetti del forno. Questi accessori consentono il collegamento dei tubi per spingere l'aria filtrata a carbone e tirare la fragranza fuori dallo spazio della testa.
- Sciacquare tutte le borse e i tubi con il 75% di etanolo. Lasciare asciugare entrambe le ore dopo il risciacquo.
- Dopo che i sacchetti del forno si sono asciugati, cuocere sacchetti e tubi in forno a fuoco basso, circa 74-85 gradi centigradi per 30 minuti.
3. Raccolta volatile
NOTA: durante questo processo devono essere indossati guanti sterili in neoprene, poiché il contatto con il sacchetto o le cartucce filtranti può contaminare i campioni.
- Coprire il fiore selezionato con un sacchetto per forno al forno al forno. Stringi il sacchetto saldamente con una cravatta a cerniera di plastica sotto il fiore per evitare il flusso d'aria indesiderato nel sacchetto.
- Attaccare un tubo dalla presa d'aria dell'attrezzatura di raccolta e collegarlo a una delle unioni di paratia sulla borsa del forno.
- Nell'altra unione delle paratie, attaccare una cartuccia di filtro di vetro contenente adsorbenti polimerici potri.
- Attaccare un secondo tubo all'apparecchiatura di raccolta sull'ingresso a vuoto. Collegare l'estremità del secondo tubo sulla cartuccia del filtro di raccolta volatile in vetro.
- Accendere sia la pompa dell'aria che il vuoto allo stesso tempo fissati a 0,05 l/min. Lo spazio sulla testa intorno al fiore si riempirà di aria, ma non diventerà eccessivamente gonfiato. Il sistema estrarrà l'aria dalla borsa attraverso il filtro, intrappolando i volatili floreali.
- Lasciare la macchina a funzionare per 10 min e quindi spegnere sia la pompa dell'aria che il vuoto.
NOTA: Potrebbe essere necessario campionare le specie floreali che producono/emettono una quantità minore di profumo per un periodo di tempo più lungo. - Smontare i tubi e la cartuccia del filtro di vetro. Mettere il filtro in una fiala di vetro con un tappo a vite. Una volta acceso il tappo, sigillare la fiala con il nastro adesivo del tubo PTFE.
- Conservare i campioni in un congelatore fino a quando non vengono analizzati utilizzando GC-MS.
- Ripetere questo processo con un sacchetto da forno pulito e un filtro di vetro, questa volta con un sacchetto vuoto, per raccogliere un campione di aria bianca come controllo. In questo modo è possibile identificare eventuali volatili in background raccolti.
NOTA: La raccolta di campioni ripetuti deve essere eseguita approssimativamente alla stessa ora ogni giorno, poiché alcuni fiori producono diversi livelli di fragranza nel corso di una giornata.
4. GC-MS
- Rimuovere la cartuccia del filtro di vetro dal congelatore e metterla in un GC-MS nella porta dell'iniettore.
- Rilascio delle sostanze volatili dello spazio di testa raccolti su polimeri porosi adsorbente dall'adsorbente riscaldando nella trappola di raccolta termica (TCT) a 220 s per 8 min all'interno di un flusso di gas elio (tasso: 1,2 mL/min).
- Raccogliere i composti desorbed nell'unità trappola a freddo TCT a -130 gradi centigradi. La temperatura della trappola a freddo è regolata dal programma GC-MS.
- Flash riscalda l'unità trappola fredda TCT per iniettare i composti nella colonna capillare del cromatografo a gas a cui era collegata l'unità trappola a freddo TCT. Il metodo per il TCT inizia a -20 gradi centigradi e termina a 150 gradi centigradi.
- Programmare il GC-MS per salire da 40 a 280 gradi centigradi a 15 gradi centigradi, con una tenuta di 5 min a 40 gradi centigradi.
5. Analisi dei dati
- Per l'identificazione, confrontare gli spettri di massa del campione con quelli delle librerie di spettri di massa (NIST e Department of Chemical Ecology, Università di Goteborg, Svezia11), così come i tempi di ritenzione delle sostanze volatili ai tempi di autentici standard composti12.
- Confrontare i cromatogrammi delle sostanze volatili raccolte per identificare picchi ricorrenti comuni.
- Dopo aver identificato i volatili di picco, utilizzare Pherobase (database online di semiochimici e feromoni) per determinare se sono stati precedentemente descritti in fragranze floreali10.
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Representative Results
I dati rappresentativi del GC-MS sono mostrati come un cromatogramma nella figura 1. Oltre al cromatogramma, viene fornito anche un file di dati dei risultati (Supplementary File 1). Questo file di dati fornisce il tempo di conservazione per ogni picco (RT) e un'identificazione di quale composto è tale picco (Libreria/ID). I picchi tra le 10:00 e le 15:00 minuti sono volatili floreali, a causa del peso molecolare dei composti10. I numeri al di sopra dei picchi indicano i tempi di conservazione dei composti identificati a cui viene fatto riferimento al file di dati dei risultati (Supplementary File 1). Ottenendo il cromatogramma e il file di dati per ogni campione di fragranza, i composti possono essere confrontati e possono essere identificati quelli che si stanno ripetendo per ogni campione di fiori. Le raccolte possono essere identificate da questo documento nella categoria "Sample", denominata per rappresentare il fiore campionato, e l'ora e la data della raccolta (ad esempio: UF1 8AM 03/16/15). La pagina 1 di questo documento mostra anche l'identificazione di composti specifici identificati dal campione (LibraryID), il cui tempo di conservazione massimo dalla Figura 1 il composto corrisponde a (Pk ) e la percentuale della fragranza totale che ogni volatile comprende (Area %). Tutti i volatili raccolti elencati sotto "Libreria/ID" possono essere referenziati in Pherobase per determinare se hanno descritto in precedenza in una fragranza floreale. Ad esempio, nel file supplementare 1, #21 composto, con un tempo di ritenzione (RT) di 10.311 è stato identificato come benzaldeide. Nei campioni futuri, se la benzaldeide è presente, può essere referenziata su Pherobase per determinare se si tratta di un composto floreale probabile per il fiore. Nella Figura 2, la benzaldeide è stata perquisita su Pherobase. Una volta selezionato un composto, la pagina mostra un elenco di tutte le specie di fiori, organizzate per famiglia di piante, da cui è stato identificato quel composto di fragranze. Nell'angolo in basso a destra della figura 2 è presente un piccolo sottoinsieme delle specie di orchidee (Orchidaceae) da cui è stata determinata la benzaldeide di essere presente nella fragranza floreale.
Figura 1: Risultati di picco volatili GC-MS. Risultati grafici che mostrano il picco volatile del campione di fragranze floreali. I numeri al di sopra dei picchi corrispondono a un elenco di tutti i composti volatili raccolti, identificando il picco alla volatile specifica. I picchi tra le 10:00 e le 15:00 minuti sono più probabili essere volatili da una fragranza floreale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: risultati dell'esempio Pherobase. Un esempio di risultati da una ricerca Pherobase per un composto di fragranze. In questa figura è stata cercata la Benzaldeide e i risultati mostrano un elenco di tutte le specie di fiori da cui è stata identificata questa fragranza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Dati dei risultati. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Anche se questa tecnica è incredibilmente preziosa per la sua velocità di campionamento e portabilità, una limitazione è usarla per le specie epifite, o per quelle che crescono sugli alberi e non da terra. Nello studio originale10, uno dei fiori campionati era epifita. Poiché la macchina è troppo pesante per essere appesa liberamente, per il campionamento deve essere fatta una base stabile ed elevata. Inoltre, la macchina può essere collegata a una presa elettrica o a una batteria alimentata, quindi se c'è un campionamento prolungato sul campo, ci deve essere una fonte di alimentazione per caricare le batterie quando la macchina non è in uso.
I metodi qui consentono un campionamento in situ non distruttivo, con campionamento ripetuto rapido e un tempo di campionamento molto più rapido. Mentre alcuni studi sulle fragranze floreali richiedono che la fragranza venga raccolta per 2-3 ore per un campione, il metodo presentato è in grado di raccogliere accuratamente i volatili in circa 10 min grazie al materiale di raccolta (adsorbento polimerico poroso) utilizzato nel vetro filtro.
Questi metodi di raccolta forniscono un modo per campionare rapidamente e in modo sicuro la fragranza prodotta dai fiori, senza distruggere o danneggiare il fiore. Con così tanti fiori, soprattutto quelli della famiglia Orchidaceae, essendo classificati come minacciati o in via di estinzione, analizzando le fragranze che stanno producendo in modo non distruttivo è fondamentale come il lavoro viene condotto per comprendere la loro biologia dell'impollinazione. Le informazioni ottenute da questi studi potrebbero potenzialmente essere utilizzate per aumentare l'impollinazione utilizzando miscele sintetiche basate su sostanze chimiche di picco trovate per attirare più impollinatori in aree con orchidee in fiore.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
USDA-ARS Research Project numero 6036-22000-028-00D. L'uso di marchi commerciali, ditta o di società in questa pubblicazione è per le informazioni e la convenienza del lettore. Tale utilizzo non costituisce un'approvazione ufficiale o un'approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti o del Servizio di Ricerca per l'Agricoltura di qualsiasi prodotto o servizio, ad esclusione di altri che possono essere adatti. Inoltre, il Dipartimento di Biologia dell'Università della Florida-Lewis e la borsa di studio Varina Vaughn in Orchid Biology (2017), e una borsa di ricerca di laurea dell'Università della Florida (2014-2018) ha fornito finanziamenti. Ringraziamo anche Cindy Bennington della Stetson University per la pianta di orchidea utilizzata durante le riprese di questo video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
