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Biochemistry

GC-MS熱脱着サンプリングのためのヘッドスペース揮発性収集技術を用いたフローラルフレグランス揮発性物質の迅速な収集

doi: 10.3791/58928 Published: December 10, 2019

Summary

ここでは、非破壊サンプリング手順を用いて、花の香料揮発性物質を咲かせる花から集めるプロトコルを提示する。

Abstract

多くの花の家族の香りがサンプリングされ、揮発性が分析されています。香りを構成する化合物を知ることは、脅威にさらされたり、絶滅の危機に瀕している花を保存するための重要なステップになります。花の香りは受粉者を引き付けるために重要であるため、この方法は、より良い理解や受粉を高めるために使用することができます。私たちは、GC-MSによって分析される花の香りの揮発性物質を収集するために、ポータブル炭の空気フィルターと真空を使用してプロトコルを提示します。この方法を用いることで、香料揮発性物質を容易に輸送できる機械で非破壊法を用いてサンプリングすることができる。この方法論は、迅速なサンプリング手順を使用し、サンプリング時間を2〜3時間から約10分に短縮します。GC-MSを使用して、香料化合物は、本物の基準に基づいて個別に識別することができます。フレグランスと制御データの収集に使用する手順は、材料の設定からデータ出力の収集まで、示されています。

Introduction

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花は通常、花粉を引き付けるために使用される香りを生成します。これらの香料は、花のブレンド1、2、3として一緒に作用する多くの化学化合物で構成されています。これらの香りがなければ、花は受粉者を使用して遺伝情報を伝える可能性が低くなります。花の香りは、多くの開花植物の家族で文書化されています,オーキダ科は、研究より一般的な家族の一つである4.受粉における花の香りの役割を理解するには、花から放出される化学化合物を1日の異なる時期に非破壊的に収集して分析することが重要であり、数日から数週間の間に花が咲き乱れるのは、香りが時間の経過とともに変化する可能性があるからです。

この種のサンプリングのための初期のプロトコルは、ヒースとマヌキアン6によって開発されました.彼らのサンプリング方法の目標は、研究されている標本(例えば、植物、昆虫)に対するストレスを軽減することであった。以前の論文では、香りを収集するために咲く花を取り除くなど、植物への破壊的な手順が必要であると文書化しました。カンチーノとデイモン7、8による最近の花の香りの出版物は同様の方法を使用しました。この研究は、ガラス室に花を置き、それらの上に精製された空気を渡しました。その後、チャンバーからの香料化合物を透明なパスツールピペットで多孔質ポリマー吸着剤に吸収した。香料は、この研究の間に少なくとも2時間収集された。Sadler et al.9は、元の研究10とよく似て、南フロリダのエピフィスティック蘭に関する花の香りの研究を行いました。繰り返しになりますが、この研究では、香料の揮発性物質を収集するために2時間以上にわたって花をサンプリングする必要があり、香りは多孔質ポリマー吸着剤に集められています。ここでの論文は、より迅速なサンプリングを可能にする非破壊的な方法を提示し、わずか10分間持続する。また、ガラス室のオーブンベーキングバッグを使用する代わりに、チャンバーのより柔軟な動きを可能にし、花への損傷の可能性を低減するために使用されます。これらの袋にはいくつかのサイズがあり、サンプルまたは周囲の材料を損傷することなく、個々のサンプルに容易に適合する袋のサイズを選択するオプションを可能にする。本研究で用いた吸着剤はテナックス多孔質ポリマー吸着剤であった。これは、分析のためにサンプルをGC-MSカラムに熱的に分離できるため、化学溶剤の使用を排除できるため、ポラパックとは異なります。

本研究の方法は、花によって産生される香料揮発性物質を迅速にサンプリングする方法を提供し、昆虫フェロモンやキノコの揮発性物質など、他の標本からの揮発性物質をサンプリングするためにも使用することができる。サンプリングの時間が短縮されるということは、サンプルに対するストレスが少なく、短期間で多くのサンプルを収集する能力を意味します。例えば、Sadler et al.9では、花は夜に香りが良かったので、毎晩2~3個のサンプルしか集めてこられなかった。ここでの方法では、サンプルは、同じ花から15-20分間隔で一晩中取ることができました。さらに、ガラス室の代わりにバッグを使用することにより、ヘッドスペースは、絶滅危惧種または脅かされた植物種の現場コレクションの現場でのサンプリングのために容易に中断することができます。ここで紹介した方法を用いて、地上1.5~2メートルの花を試すことができた。これらの方法は、実験室や現場での香料の収集に非常に有用であり、サンプルに高速かつ非破壊的なサンプリング技術を研究者に提供します。

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Protocol

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注:香水や香りのローションや製品は、これらの手順の間に着用してはいけません。

1. 花の選択

注:使用される花は、自然に環境中で成長するか、人工環境条件下で維持することができます。収集中の温度、湿度、光レベルは、使用される特定の花種と収集されるデータの種類によって異なります。例えば、同じ花の日中と夜間にデータを収集し、香りが時間の経過とともに変化するかどうかを判断し、その上と温室の花の両方から収集されています。

  1. サンプル収集時間を標準化するために、最初に開封されていない花を選択します。これは、時間の経過とともに香りを変化させる花をコントロールします。
  2. 開花時間の持続時間に応じて、可能であれば、サンプルを収集するために開花後少なくとも24時間待って、すべてのサンプルの標準時間を設定します。
  3. 植物に複数の咲く花がある場合は、フラグテープまたは同じ花の繰り返しサンプリングを確保するために、フラグテープまたは何かで使用されるものにマークを付けます。

2. 材料の準備

  1. オーブン袋(約40.5cm×44.5cm)と段ボールPTFEチューブを使用してください。
  2. 最初は、残留プラスチック化合物を除去するために〜30分間水でオーブン袋を沸騰させます。乾かすには、オーブンで175°Cで焼きます。
  3. 袋が乾燥したら、オーブン袋の閉じた端の各コーナーにポリプロピレンバルクヘッドユニオンを追加します。これらの付属品は管の関係が木炭フィルターされた空気を押し込み、ヘッドスペースから香りを引き出すことを可能にする。
  4. 75%のエタノールですべての袋とチューブをすすいでください。すすいで両方の空気を乾燥させます。
  5. オーブン袋を乾燥させた後、弱火でオーブンで袋やチューブを焼き、約74〜85°C30分間焼きます。

3. 揮発性コレクション

メモ:袋またはフィルターカートリッジに接触するとサンプルが汚染される可能性があるため、滅菌ネオプレン手袋は、このプロセス全体を通して着用する必要があります。

  1. 焼いたオーブン袋で選択した花をカバーします。袋に不要な空気の流れを防ぐために、花の下にプラスチック製のジップネクタイでしっかりと袋をシンチ。
  2. 回収装置の空気コンセントからチューブを取り付け、オーブンバッグのバルクヘッドユニオンの1つに接続します。
  3. 他のバルクヘッドユニオンに、多孔質ポリマー吸着剤を含むガラスフィルターカートリッジを取り付けます。
  4. 真空入力の収集装置に2本目のチューブを取り付けます。2 番目のチューブの端をガラス揮発性コレクション フィルター カートリッジに接続します。
  5. エアポンプと真空の両方を~0.05 L/minに設定して同時にオンにします。花の周りのヘッドスペースは空気で満たされますが、膨張し過ぎにはなりません。システムはフィルターを通して袋から空気を引っ張り、花の揮発性をトラップする。
  6. 機械を10分間動かしてから、エアポンプと真空の両方をオフにします。
    注:より少ない量の香りを生成/放出する花種は、より長い期間サンプリングする必要があります。
  7. チューブとガラスフィルターカートリッジを分解します。スクリューオンキャップ付きのガラスバイアルにフィルターを入れます。キャップがオンになったら、PTFEパイプスレッドテープでバイアルを密封します。
  8. GC-MSを使用して分析するまで、サンプルを冷凍庫に保存します。
  9. 清潔なオーブンバッグとガラスフィルターでこのプロセスを繰り返し、今度は空のオーブンバッグで、コントロールとして空の空気サンプルを収集します。これにより、収集されたバックグラウンド揮発性物質を識別できます。
    注:一部の花は1日の間に様々な香りのレベルを生成するので、サンプル収集を繰り返す必要があります。

4. GC-MS

  1. 冷凍庫からガラスフィルターカートリッジを取り外し、インジェクタポートのGC-MSに入れます。
  2. ヘリウムガスの流れの中で8分間220°Cに熱回収トラップ(TCT)で加熱することにより、吸着から吸着剤から収集された多孔質ポリマー吸着剤で収集されたヘッドスペース揮発性物質を放出する(速度:1.2 mL/分)。
  3. TCTコールドトラップユニットで脱着した化合物を-130°Cで回収します。コールドトラップ温度はGC-MSプログラムによって調整されます。
  4. TCTコールドトラップユニットをフラッシュ加熱し、TCTコールドトラップユニットが接続されたガスクロマトグラフのキャピラリーカラムに化合物を注入する。TCTの方法は-20°Cから始まり、150°で終わります。
  5. GC-MSをプログラムして、40°Cで40°Cから280°Cに上昇し、40°Cで5分保持します。

5. データ分析

  1. 同定のために、試料の質量スペクトルを質量スペクトルライブラリ(NISTおよび化学生態学科、スウェーデン11)からのものと比較し、ならびに揮発性物質の保持時間を本物の化合物規格12の時間に対して比較する。
  2. 収集された揮発性物質のクロマトグラムを比較して、再発する一般的なピークを特定します。
  3. ピーク揮発性物質を特定した後、フェロベース(セミオケミカルとフェロモンのオンラインデータベース)を使用して、それらが以前に花の香りに記載されているかどうかを判断する。

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Representative Results

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GC-MSからの代表的なデータは、図1にクロマトグラムとして示されている。クロマトグラムに加えて、結果のデータファイルも提供されています(補足ファイル1)。このデータ ファイルは、各ピーク (RT) の保存期間と、ピークがどの化合物 (ライブラリ/ID) であるかを識別します。10:00~15:00の間のピークは、化合物10の分子量に起因する花の揮発性である。ピークを超える数値は、結果のデータ ファイルを参照する特定された化合物の保持時間を示します (補足ファイル 1)。香料サンプルごとにクロマトグラムとデータファイルを得ることで、化合物を比較し、花サンプルごとに再発しているものを同定することができる。コレクションは、サンプリングされた花を表す名前付きのカテゴリ "Sample" の下にあるこのドキュメントから識別でき、コレクションの日時 (例: UF1 8AM 03/16/15)。このドキュメントの1ページ目はまた、サンプルから同定された特定の化合物(LibraryID)の同定、図1からのピーク保持時間(Pk#)、および各揮発性が含む全香料の割合(エリア%)を示す。「ライブラリ/ID」の下にリストされているすべての収集された揮発性物質は、それらが以前に花の香りに記載されているかどうかを判断するために、Pherobaseで参照することができます。例えば、補足ファイル1において、化合物#21、保存期間(RT)が10.311であり、ベンズアルデヒドとして同定されている。将来のサンプルでは、ベンズアルデヒドが存在する場合、それが花のための可能性が高い花の化合物であるかどうかを決定するためにフェロベースで参照することができます。図2では、ベンズアルデヒドをフェロベースで検索した。化合物が選択されると、ページには植物科別に編成されたすべての花種のリストが表示され、そこから香料化合物が特定されます。図2の右下隅に強調されているのは、ベンズアルデヒドが花の香りに存在すると判断された蘭種(オーキダ科)の小さなサブセットである。

Figure 1
図1:GC-MS揮発性ピーク結果花の香りサンプルのピーク揮発性を示すグラフィカルな結果。ピークを超える数値は、収集されたすべての揮発性化合物のリストに対応し、特定の揮発性に対するピークを識別する。10:00~15:00のピークは、花の香りから揮発性である可能性が最も高いです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: フェロベースの結果の例フェロベースが香料化合物を検索した結果の例。この図ではベンズアルデヒドを検索し、その結果、この香りが同定されたすべての花種のリストを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1: 結果データ。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。

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Discussion

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この技術は、そのサンプリング速度と移植性のために非常に貴重ですが、1つの制限は、エピフィフィティックな種、または地面からではなく、木の上に成長しているもののためにそれを使用しています。元の研究10では、サンプリングされた花の1つがエピフィティクスであった。機械は重すぎて自由に吊るすできないため、安定した高いベースをサンプリングに行う必要があります。さらに、機械はコンセントまたはバッテリ駆動に差し込むことができるので、長時間のフィールドサンプリングがある場合は、機械が使用していないときにバッテリを充電するための電源が必要です。

ここでの方法は、迅速な反復サンプリングとはるかに高速なサンプリング時間で、in situ非破壊サンプリングを可能にします。一部の花の香料研究では、1つのサンプルのために2〜3時間の香りを収集する必要がありますが、提示された方法は、ガラスに使用される収集材料(多孔質ポリマー吸着剤)のために約10分で揮発性物質を正確に収集することができますフィルター。

これらの収集方法は、花を破壊したり、害を与えることなく、花によって生成された香りを迅速かつ安全にサンプリングする方法を提供します。非常に多くの花、特にオーキダ科の花が脅かされたり絶滅の危機に瀕している中で、受粉生物学を理解する作業が行われる中で、彼らが非破壊的な方法で生産している香りを分析することは非常に重要です。これらの研究から得られた情報は、開花する蘭を持つ地域により多くの受粉者を引き付けるために発見されたピーク化学物質に基づいて合成ブレンドを使用して受粉を促進するために使用される可能性があります。

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Disclosures

著者は利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

USDA-ARS研究プロジェクト番号 6036-22000-028-00D.本書における貿易、企業名、または法人名の使用は、読者の情報と利便性を目的とします。このような使用は、米国農務省または任意の製品またはサービスの農業研究サービスによる、適切な他の製品またはサービスの公式の承認または承認を構成するものではありません。さらに、フロリダ大学のルイス校とバリナ・ヴォーン・フェローシップ(2017年)、フロリダ大学大学院研究フェローシップ(2014-2018)も資金提供を行いました。また、このビデオの撮影中に使用される蘭の植物のためにステットソン大学のシンディ・ベニントンに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bulkhead Union Cole-Palmer UX-06390-10
FEP tubing Cole-Palmer UX-06407-60
Gas Chromatography Hewlett Packard 6890
Glass Wool, Silanized Sigma-Aldrich 20411
Inlet liner Agilent 5062-3587
Mass Spectrometer Hewlett Packard 5973
Reynolds oven bag Reynolds Consumer Products Turkey size
Tenax Porous Polymer Adsorbent Sigma-Aldrich 11982

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References

  1. Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
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Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling. J. Vis. Exp. (154), e58928, doi:10.3791/58928 (2019).More

Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling. J. Vis. Exp. (154), e58928, doi:10.3791/58928 (2019).

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