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Biochemistry

GC-MS 열 탈착 샘플링을 위한 헤드스페이스 휘발성 수집 기법을 사용한 신속한 플로랄 향수 휘발성 수집

doi: 10.3791/58928 Published: December 10, 2019

Summary

여기서, 우리는 비파괴 샘플링 절차를 사용하여 꽃꽃에서 꽃 향기 휘발성을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.

Abstract

많은 꽃 가문의 향기가 샘플링되고 휘발성 물질분석되었습니다. 향기를 구성하는 화합물을 아는 것은 위협적이거나 멸종 위기에 처한 꽃을 보존하는 중요한 단계가 될 수 있습니다. 꽃 향기는 꽃가루를 유치하는 데 매우 중요하기 때문에이 방법은 수분을 더 잘 이해하거나 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 휴대용 숯 공기 필터와 진공을 사용하여 꽃 향기 휘발성을 수집하는 프로토콜을 제시한 다음 GC-MS에 의해 분석됩니다. 이 방법을 사용하면 쉽게 운반할 수 있는 기계를 사용하여 무파괴 방법을 사용하여 향수 휘발성을 샘플링할 수 있습니다. 이 방법론은 빠른 샘플링 절차를 사용하여 샘플링 시간을 2-3시간에서 약 10분으로 단축합니다. GC-MS를 사용하여, 향수 화합물은 본격적인 기준에 따라 개별적으로 식별 될 수있다. 재료 설정에서 데이터 출력 수집에 이르기까지 향기 및 제어 데이터를 수집하는 데 사용되는 단계가 표시됩니다.

Introduction

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꽃은 일반적으로 수분 공급자를 유치하는 데 사용되는 향기를 생산하고 있습니다. 이 향기는 모두 꽃 혼합1,2,3로함께 작용하는 많은 화학 화합물로 구성되어 있습니다. 이러한 향기가 없다면 꽃은 꽃가루를 사용하여 유전 정보를 전달할 가능성이 적습니다. 꽃 향기는 많은 꽃 식물 가족에 문서화되어 있으며, 오키다과는 4연구 된 일반적인 가족 중 하나입니다. 수분에서 꽃 향기의 역할을 이해하려면, 비파괴적으로 수집하고 하루 중 다른 시간에 꽃에서 방출되는 화학 화합물을 분석하는 것이 중요하다 몇 일에서 몇 주 동안 꽃이 열려, 향기는 시간이 지남에 따라 다를 수 있기 때문에5.

이러한 종류의 샘플링에 대한 초기 프로토콜은 히스와 마누키안6에의해 개발되었습니다. 그들의 샘플링 방법의 목표는 연구되는 표본 (예를 들어, 식물, 곤충)에 대한 스트레스를 줄이는 것이었습니다. 이전 논문은 향기를 수집하기 위해 꽃꽃을 제거하는 등 식물에 파괴적인 절차가 필요하다고 문서화했다. 최근 칸치노와 데이먼7,8에 의해 꽃 향기 간행물은 유사한 방법을 사용했다. 이 연구는 유리 챔버에 꽃을 넣고 그 위에 정화 된 공기를 전달; 이어서 챔버로부터의 향료 화합물을 투명한 파스퇴르 피펫에서 다공성 폴리머 흡착제 에 흡수되었다. 향료는 본 연구 기간 동안 적어도 2시간 동안 수집되었다. Sadler et al.9는 원래 연구10과마찬가지로 플로리다 남부의 에피피틱 난초에 대한 꽃 향기 연구를 수행했습니다. 다시, 이 연구는 다공성 폴리머 흡착제에 수집 된 향기와 함께, 향기 휘발성을 수집하기 위해 2 시간 이상 꽃을 샘플링할 것을 요구했다. 이 백서는 훨씬 더 빠른 샘플링을 허용하는 비파괴 방법을 제시하며 10분 만 지속됩니다. 또한, 대신 유리 챔버 오븐 베이킹 백을 사용하는 챔버의 보다 유연한 움직임을 허용하고 꽃에 손상의 가능성을 줄일 수 있습니다 사용된다. 이 가방은 여러 가지 크기로 제공되므로 샘플이나 주변 재료를 손상시키지 않고 개별 샘플에 쉽게 맞을 수있는 가방 크기를 선택할 수 있습니다. 본 연구에 사용된 흡착제는 테낙스 다공성 폴리머 흡착제였다. 이는 샘플을 분석을 위해 GC-MS 컬럼에 열적으로 탈착할 수 있기 때문에 Porapak과 다르므로 화학 용매의 사용을 제거합니다.

이 연구의 방법은 꽃에 의해 생성된 향수 휘발성을 신속하게 샘플링하는 방법을 제공하며 곤충 페로몬 또는 버섯 휘발성 물질과 같은 다른 표본의 휘발성 물질도 샘플링하는 데 사용될 수 있습니다. 샘플링 시간이 단축되면 샘플에 대한 스트레스가 줄어들고 단기간에 많은 샘플을 수집할 수 있습니다. 예를 들어, Sadler et al.9에서는밤에만 꽃이 향기가 나기 때문에 매일 밤 2~3개의 샘플만 수집할 수 있었습니다. 이 방법을 사용하면 같은 꽃에서 15-20 분 간격으로 밤새 샘플을 채취할 수 있습니다. 또한 유리 챔버 대신 가방을 사용하여 위험에 처한 식물 종에 대한 현장 수집을 위해 현장에서 샘플링하기 위해 헤드 스페이스를 쉽게 일시 중단 할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법을 사용하여 지상 1.5~2m높이의 꽃을 시음할 수 있었습니다. 이러한 방법은 실험실과 현장에서 향수 수집에 매우 유용하며, 연구원들에게 샘플에 빠르고 비파괴적인 샘플링 기술을 제공합니다.

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Protocol

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참고: 향수 나 향이 나는 로션 및 제품은 이러한 절차 중 착용해서는 안됩니다.

1. 꽃 선택

참고: 사용되는 꽃은 자연적으로 환경에서 자라거나 인공 환경 조건하에서 보관될 수 있습니다. 수집 중 온도, 습도 및 조명 수준은 사용되는 특정 꽃 종과 수집되는 데이터의 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 같은 꽃에 대해 낮과 밤에 데이터를 수집하여 향기가 하루 중 시간에 따라 달라지는지 확인하고, 현장에서 온실 꽃에서 수집되었습니다.

  1. 처음에 개봉되지 않은 꽃을 선택하여 샘플 수집 시간을 표준화합니다. 이것은 시간이 지남에 따라 향기를 변화하는 꽃에 대한 제어합니다.
  2. 개화 시간의 지속 시간에 따라 가능하면, 모든 샘플에 대한 표준 시간을 설정, 샘플을 수집하기 위해 개화 후 적어도 24 시간을 기다립니다.
  3. 식물에 여러 개의 꽃이 피는 경우, 같은 꽃의 반복 샘플링을 보장하기 위해 플래그 테이프 또는 유사한 것과 함께 사용되는 꽃을 표시합니다.

2. 재료 준비

  1. 오븐 백 (약 40.5 cm × 44.5 cm)과 골판지 PTFE 튜브를 사용합니다.
  2. 처음에는 오븐 백을 물에 30분 동안 끓여 잔류 플라스틱 화합물을 제거합니다. 말리려면 175 °C의 오븐에서 굽습니다.
  3. 가방이 건조되면 오븐 봉투의 닫힌 끝 모서리에 폴리 프로필렌 격벽 유니온을 추가합니다. 이러한 부착물은 튜브를 연결하여 숯으로 여과된 공기를 밀어 내고 헤드스페이스에서 향기를 끌어낼 수 있게 합니다.
  4. 75% 에탄올로 모든 가방과 튜브를 헹구십시오. 헹구고 나서 두 공기를 모두 말리십시오.
  5. 오븐 백을 건조 한 후, 낮은 열에서 오븐에 가방과 튜브를 구워, 약 74-85 °C 에 대 한 30 분.

3. 휘발성 수집

참고: 가방이나 필터 카트리지에 접촉하면 시료가 오염될 수 있기 때문에 멸균 네오프렌 장갑은 이 과정 전반에 걸쳐 착용해야 합니다.

  1. 구운 오븐 가방으로 선택한 꽃을 덮습니다. 꽃 아래에 플라스틱 지퍼 넥타이로 가방을 단단히 끼워 가방에 원치 않는 공기가 유입되는 것을 방지합니다.
  2. 수집 장비의 공기 출구에서 튜브를 부착하고 오븐 가방에 격벽 유니온 중 하나에 연결합니다.
  3. 다른 격벽 결합체에 다공성 폴리머 흡착제가 포함된 유리 필터 카트리지를 부착합니다.
  4. 진공 입력의 수집 장비에 두 번째 튜브를 부착합니다. 두 번째 튜브의 끝을 유리 휘발성 수집 필터 카트리지에 연결합니다.
  5. ~0.05 L/min으로 설정된 에어 펌프와 진공을 동시에 켭니다. 꽃 주위의 헤드 스페이스는 공기로 채워지지만 과도하게 팽창되지는 않습니다. 시스템은 필터를 통해 가방에서 공기를 끌어, 꽃 휘발성 을 트래핑합니다.
  6. 기기가 10분 동안 실행되도록 한 다음 에어 펌프와 진공 을 모두 끕니다.
    참고: 더 적은 양의 향을 생산/방출하는 꽃 종은 더 오랜 기간 동안 샘플링해야 할 수도 있습니다.
  7. 튜브와 유리 필터 카트리지를 분해합니다. 필터를 나사식 캡이 있는 유리 병에 넣습니다. 캡이 켜지면 PTFE 파이프 스레드 테이프로 바이알을 밀봉합니다.
  8. GC-MS를 사용하여 분석할 때까지 샘플을 냉동실에 보관합니다.
  9. 깨끗한 오븐 가방과 유리 필터로이 과정을 반복, 빈 오븐 가방이 시간, 제어로 빈 공기 샘플을 수집합니다. 이렇게 하면 수집된 모든 배경 휘발성을 식별할 수 있습니다.
    참고: 일부 꽃은 하루 동안 다양한 향기 수준을 생성하기 때문에 샘플 수집을 반복하는 것은 매일 거의 같은 시간에 수행되어야합니다.

4. GC-MS

  1. 냉동고에서 유리 필터 카트리지를 분리하고 인젝터 포트의 GC-MS에 넣습니다.
  2. 열 수집 트랩(TCT)에서 가열하여 흡착제에서 흡착제상에 수집된 헤드스페이스 휘발성 물질은 헬륨 가스의 흐름 내에서 8분 동안 220°C(속도: 1.2 mL/min)로 방출한다.
  3. -130 °C에서 TCT 콜드 트랩 유닛에서 탈착 화합물을 수집합니다. 콜드 트랩 온도는 GC-MS 프로그램에 의해 조절됩니다.
  4. 플래시는 TCT 콜드 트랩 유닛이 연결된 가스 크로마토그래프의 모세관 기둥에 화합물을 주입하기 위해 TCT 콜드 트랩 유닛을 가열합니다. TCT에 대한 방법은 -20 °C에서 시작하여 150 °C에서 끝납니다.
  5. GC-MS를 15°C/min에서 40°C에서 280°C로 상승하도록 프로그래밍하고 40°C에서 5분 간 유지합니다.

5. 데이터 분석

  1. 식별을 위해, 질량 스펙트럼 라이브러리 (NIST 및 화학 생태학과, 고테보그 대학, 스웨덴11)에서그와 샘플의 질량 스펙트럼뿐만 아니라 본격적인 화합물 표준의 시간에 휘발성 물질의 보존 시간을 비교12.
  2. 수집된 휘발성 물의 크로마토그램을 비교하여 일반적인 재발 피크를 식별합니다.
  3. 피크 휘발성 물질을 식별 한 후, 그들은 이전에 꽃 향기10에설명 된 경우 를 결정하기 위해 Pherobase (반화학 및 페로몬의 온라인 데이터베이스)를 사용합니다.

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Representative Results

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GC-MS의 대표적인 데이터는 도 1에서크로마토그램으로 나타내고 있다. 크로마토그램 외에도 결과의 데이터 파일도 제공됩니다(보충파일 1). 이 데이터 파일은 각 피크(RT)에 대한 보존 시간을 제공하고 해당 피크가 어떤 화합물인지 식별합니다(라이브러리/ID). 10:00에서 15:00 분 사이의 피크는화합물10의분자량으로 인해 꽃 휘발성이다. 피크 위의 숫자는 결과의 데이터 파일을 참조하는 식별 된 화합물의 보존 시간을 의미합니다(보충 파일 1). 각 향기 샘플에 대한 크로마토그램 및 데이터 파일을 획득함으로써, 화합물을 비교할 수 있고 각 꽃 샘플에 대해 재발하는 화합물을 식별할 수 있습니다. 컬렉션은 샘플링된 꽃을 나타내는 이름인 "샘플" 범주, 컬렉션의 시간 및 날짜(예: UF1 8AM 03/16/15)에서 이 문서에서 식별할 수 있습니다. 본 문서의 1페이지는 또한 샘플로부터 확인된 특정 화합물의 식별을 도시한다(LibraryID), 이는 도 1로부터의 피크 보존 시간이 화합물(Pk#)에 해당하며, 각 휘발성이 포함하는 총 향료의 백분율(Area %)에 해당한다. "라이브러리/ID"에 나열된 모든 수집된 휘발성 물질은 Pherobase에서 참조하여 이전에 꽃 향기에 설명된 것인지 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 보충 파일 1에서,화합물 #21, 10.311의 체류 시간(RT)을 가진 벤잘데히드로 확인되었다. 미래의 샘플에서, 벤잘데히드가 존재하는 경우, 그것은 꽃에 대한 가능성이 꽃 화합물인지 확인하기 위해 Pherobase에 참조 할 수 있습니다. 도 2에서,벤잘데히드는 페로베이스에서 검색하였다. 화합물이 선택되면, 페이지는 식물 가족에 의해 조직 된 모든 꽃 종의 목록을 보여줍니다, 그 향기 화합물이 확인된. 도 2의 오른쪽 하단에 강조된 것은 벤잘데히드가 꽃향기에 존재하는 것으로 결정된 오키다과(Orchidaceae)의 작은 서브세트이다.

Figure 1
그림 1: GC-MS 휘발성 피크 결과. 꽃 향기 샘플의 피크 휘발성을 보여주는 그래픽 결과. 피크 위의 숫자는 수집된 모든 휘발성 화합물의 리스트에 해당하며, 피크를 특정 휘발성 으로 식별합니다. 10:00에서 15:00 분 사이의 피크는 꽃 향기로 인해 휘발성이 있을 가능성이 높습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 페로베이스 예제 결과. 향기 화합물에 대 한 Pherobase 검색에서 결과의 예. 이 그림에서 벤잘데히드가 검색되었고, 결과는이 향기가 확인된 모든 꽃 종의 목록을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 결과 데이터. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

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Discussion

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이 기술은 샘플링 속도와 휴대성에 매우 유용하지만, 한 가지 제한은 epiphytic 종, 또는 나무에서 자라는 것을 위해 그것을 사용하는 것이지 땅에서 자라지 않습니다. 본래 의10에서,샘플링된 꽃 중 하나는 골상이었다. 기계가 너무 무거워서 자유롭게 걸 수 없기 때문에 샘플링을 위해 안정적이고 높은 베이스를 만들어야 합니다. 또한 기기를 전기 콘센트또는 배터리 전원에 연결할 수 있으므로 필드 샘플링이 길어지면 기기를 사용하지 않을 때 배터리를 충전할 전원이 있어야 합니다.

여기서 의 방법을 사용하면 빠른 반복 샘플링과 훨씬 더 빠른 샘플링 시간으로 내부 비파괴 샘플링을 할 수 있습니다. 일부 꽃 향기 연구는 한 샘플에 대해 2-3 시간 동안 수집되는 향기를 필요로하지만, 제시 된 방법은 유리에 사용되는 수집 물질 (다공성 폴리머 흡착제)으로 인해 약 10 분 에서 휘발성 물질을 정확하게 수집 할 수 있습니다. 필터.

이러한 수집 방법은 꽃을 파괴하거나 손상시키지 않고 꽃에 의해 생성 된 향기를 빠르고 안전하게 샘플링 할 수있는 방법을 제공합니다. 많은 꽃, 특히 가족 꽃, 위협 또는 멸종 위기로 분류되는, 그들은 비 파괴적인 방식으로 생산하는 향기를 분석하는 것은 그들의 수분 생물학을 이해하기 위해 작업이 수행으로 중요하다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 잠재적으로 피는 난초와 지역에 더 많은 수분을 유치 하는 것으로 나타났습니다 피크 화학 물질에 따라 합성 혼합을 사용 하 여 수 분을 향상 하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

USDA-ARS 연구 프로젝트 번호 6036-22000-028-00D. 이 출판물에서 거래, 회사 또는 법인 이름을 사용하는 것은 독자의 정보와 편의를 위한 것입니다. 이러한 사용은 미국 농무부 또는 농업 연구 서비스에서 적합할 수 있는 다른 제품 또는 서비스를 배제하는 공식적인 승인 또는 승인을 구성하지 않습니다. 또한, 플로리다 생물학 부 루이스와 발리나 본 교제의 대학 난초 생물학 (2017), 플로리다 대학 대학원 연구 펠로우십 (2014-2018) 뿐만 아니라 자금을 제공. 우리는 또한이 비디오의 촬영 중에 사용되는 오키드 식물에 대한 Stetson 대학에서 신디 베닝턴 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bulkhead Union Cole-Palmer UX-06390-10
FEP tubing Cole-Palmer UX-06407-60
Gas Chromatography Hewlett Packard 6890
Glass Wool, Silanized Sigma-Aldrich 20411
Inlet liner Agilent 5062-3587
Mass Spectrometer Hewlett Packard 5973
Reynolds oven bag Reynolds Consumer Products Turkey size
Tenax Porous Polymer Adsorbent Sigma-Aldrich 11982

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References

  1. Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
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  3. Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
  4. Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
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  12. The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
GC-MS 열 탈착 샘플링을 위한 헤드스페이스 휘발성 수집 기법을 사용한 신속한 플로랄 향수 휘발성 수집
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Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling. J. Vis. Exp. (154), e58928, doi:10.3791/58928 (2019).More

Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling. J. Vis. Exp. (154), e58928, doi:10.3791/58928 (2019).

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