Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.
Abstract
תנועת התא הוא מאפיין קריטי של trophoblasts במהלך הריון מוקדם ופיתוח היפרדות. המשמעות של הגירה trophoblast נאות ופלישה מומחש הפרעות ההריון כגון הגבלת גדילה תוך רחמי, רעלת היריון, אשר משויכות trophoblast לקוי הפלישה להערכת אימהית. למרבה הצער, שלנו להבנת המנגנונים מאת אשר השליה מתפתח נודדות trophoblasts מוגבל. ניתוח במבחנה של נדידת תאים באמצעות וזמינותו הזמני הוא כלי שימושי בזיהוי גורמים לווסת את קיבולת נודדות trophoblast. עם זאת, זו assay לבד אינו מגדיר את השינויים הסלולר שיכול לגרום נדידת תאים שהשתנו. פרוטוקול זה מתאר שלושה מבחני במבחנה שונים המשמשים יחדיו כדי להעריך את תנועת התא trophoblast: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה ואת וזמינותו התפשטות. ניתן לשנות את הפרוטוקולים המתוארים כאן גם לשימוש במבנים אחרים תא לכמת תנועת התא בתגובה לגירויים. שיטות אלה מאפשרות חוקרים כדי לזהות גורמים בודדים לתרום תנועת התא, לספק בדיקה יסודית של מנגנונים פוטנציאליים שבבסיס לכאורה לשינויים נדידת תאים.
Introduction
פיתוח היפרדות היא שלב חיוני בהקמה של ההריון, להשפיע על בריאות האמהי וגם העובר. עם זאת, הבסיס מכניסטית שבו מתרחש תהליך זה אינו מובן במלואו. נדידת תאים הוא תהליך ביולוגי חשוב אשר תורם הקמתה ואת הפונקציות של השליה במהלך ההריון. בעקבות ההשתלה הבלסטוציסט, מבדילה trophectoderm לתוך trophoblasts villous חלקית, אשר לכסות את המשטח של villi כוריוני מעורבים גז וחילופי מזין, trophoblasts extravillous (EVTs), אשר להעביר החוצה villi לפלוש אימהי רותמי, להערכת1. העברה של EVTs חיוני עבור שיפוץ ספירלה אימהי העורקים ויצירת מחזור uteroplacental כדי לתמוך גידול העובר2. הפלישה trophoblast לקויה במהלך ההריון התוצאה היא התפתחות לא תקינה היפרדות, עשוי לתרום הריון סיבוכים כגון רעלת, הריון יתר לחץ דם, גדילה המושבחים לידה לידה מוקדמת3, 4. לכן, להבין את הגורמים המשפיעים על תנועתיות trophoblast הוא חיוני לקביעת המסלולים הדרושים עבור placentation רגיל.
Trophoblast ההעברה נשלטת על ידי רשת מורכבת של מולקולות, לרבות גורמי גדילה, ציטוקינים, ההורמונים גורמי אנגיוגנזה5איתות. בגלל המגבלות של הלומדים את השליה ויוו, מבחני במבחנה ניצול מונצחים תא trophoblast האנושי קווים הייתה מכרעת לזיהוי גורמים שתורמים trophoblast תנועתיות. מבחני שריטה ופלישה נעשה שימוש נרחב להעריך באופן כמותי את התפקיד של מולקולות בודדות על trophoblast תא העברה6,7,8. עם זאת, בעוד שימושי במשולב כדי לחקור כיצד שינויים ההעברה עלולה להיגרם על ידי שינויים ב- invasiveness תא, אלה שני מבחני להסביר מנגנונים נוספים שעשויים לתרום שיעור שונה של נדידת תאים. לדוגמה, הנחות על קצב התפשטות תאים עלול לגרום תאים פחות זמין להעביר.
כאן, אנו מתארים במבחנה שיטות כמותיות להערכת trophoblast ההעברה באמצעות שריטות, התפשטות תאים מבחני חדירה לתא. ב וזמינותו מאפס, פצע אחיד נוצר בטפט התא, ההעברה של תאים כדי למלא את הפער נמדד על ידי הדמיה אוטומטית, בצילום מואץ של גודל הפצע צפיפות של תאים בתוך הפצע. תא התפשטות וזמינותו מבוסס על חישוב היחס בין תאים בכל נקודה בזמן לעומת כמות ההתחלתי ידוע של תאים. ב תא הפלישה וזמינותו, התאים הם נזרע על גבי תא הוספה התרבות תאים מצופים מטריצה חוץ-תאית (למשל Transwell), מספר תאים לפלוש דרך מטריצה חוץ-תאית, בתגובה כימותרפיה-attractant נספרים.
וזמינותו הזמני הוא כלי פשוט ויעיל יכול לשמש כדי לקבוע תנאים סביבתיים שונים איך להשפיע על נדידת תאים. מבחני התפשטות ופלישה עשוי לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את התרומה של התפשטות תאים, invasiveness לשינויים הכוללת נדידת תאים. באופן קולקטיבי, מבחני אלה מספקים מדידות חזקים של תהליכים ביולוגיים שעשויים לתרום תא תנועתיות. שתי שורות תאים מונצחים בטרימסטר הראשון trophoblast שימשו מבחני המתואר, Swan.71 (Sw.71), תיקוני-8/SVneo9,10. עם זאת, אלה מבחני עשוי גם ממוטב לשימוש בסוגי תאים אחרים כדי לזהות מאפננים מפתח של נדידת תאים, הפלישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא הכנה
- לשמור על תאים T-75 מבחנות בתקשורת צמיחה רגיל-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות.
הערה: התאים המשמשים ניסויים אלה היו immortalized בטרימסטר הראשון trophoblast תא קווים Swan.71 (Sw.71) לתיקוני-8/SVneo9,10. התאים Sw.71 היו בהשתתפות DMEM/F-12 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) פירובט נתרן 1.0 מ מ, 10 מ מ HEPES, חומצות אמינו מ מ 0.10 MEM שאינם חיוניים, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100. התאים תיקוני-8/SVneo היו בהשתתפות RPMI-1640 בתוספת 5% FBS חום-לא פעיל. - מאפשרים לתאים לשכפל עד שיגיעו למפגש 90-100%. בעזרת ברדס זרימה רקמות סטריליים-תרבות, תשאף התקשורת את הבקבוקון ואת שטיפת התאים עם 10 מ"ל של עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- האחות של PBS ולהוסיף 5 מ של 1 x (0.05%) טריפסין-EDTA הבקבוק, מוודא כי תאים מכוסים על ידי טריפסין. הניחו את הבקבוק בחממה מעבדה ומתוחזק על 37 ° C, 5% CO2ו- 95% לחות עד כל התאים יש תלושים מתחתית הבקבוק (כ 5-10 דקות).
- להוסיף 10 מ של מדיה ומחוממת טרום הצמיחה הבקבוק כדי לבטל את טריפסין-EDTA.
2. לגרד Assay
- בעקבות צעד 1.4, זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחת 24-טוב כדי להשיג 100% הנהרות 48 שעות.
הערה: זה אפשרי לבצע וזמינותו מאפס עם מגוון של פריסות שונות צלחת. המספר המרבי של וולס מותר על-ידי הכלי להכנת הפצע היא תבנית 96-ובכן. - למחרת (יום לפני assay מאפס), לשנות מדיה פנול אדום מדיה פנויה שיושלם כנדרש, לרבות הפשיטו לתוספי FBS חום-לא פעיל, פחם.
הערה: מחקרים אחרים המלצות בשימוש במדיה עם ריכוז נמוך FBS (כגון: % 1) כדי למזער את התפשטות תאים, אשר יכולים לשמש חלופה זו פרוטוקול11. - ביום של גירוד וזמינותו, pretreat תאים במשך 30 דקות על-ידי הוספת הטיפול הרצוי המדיה של כל טוב. הניסויים מחולקת לרמות מנוצל הרכב (1 x PBS) ו- 100 ננומטר דקסמתזון מדולל ב- 1 x PBS.
-
כדי ליצור פצעים אחיד, מקום סטרילי טיפים פיפטה 10 µL על הפינים של הכלי מכונת הפצע. הנמך את הטיפים אל השורה הראשונה של בארות ולהעביר לצלחת לאורך המסלול של הבורא הפצע עד קצות פיפטה להגיע לצד השני של הבאר.
- להעביר את הצלחת חזרה לנקודת ההתחלה, המאפשר את הטיפים פיפטה לגעת ללא הרף התחתון של הלוח כדי להבטיח קבוע פצע לאורך הקוטר של הבאר. להסיר, להחליף את העצות סטרילי µL 10 פיפטה ולהוריד את הטיפים אל השורה הבאה של בארות.
- חזור על שלב 2.4 עד כל בארות שרוטים.
הערה: אם כלי להכנת הפצע אינו זמין, הפצעים יכולים להיווצר על ידי גירוד ידנית במרכז הבארות עם טיפ פיפטה 10 µL. - בזהירות תשאף מדיה ותרחץ בעדינות תאים פעמיים עם 1 x PBS. לאחר שטיפה סופית, להוסיף שהושלם פנול אדום ללא תשלום, הפשיטו או נמוך-FBS מדיה עם הטיפול הרצוי או רכב (בהמלצת בשלב 2.3).
הערה: תיקוני-8/SVneo תאים יש לחפוף שהושלם פנול אדום מדיה, כמו כביסה עם 1 x PBS יגרום תאים לנתק. - מקם את הצלחת 24-ובכן המכיל שרוט בארות םלצה אוטומטיות, בצילום מואץ (ראה טבלה של חומרים) שוכן חממה מעבדה ומתוחזק על 37 ° C, 5% CO2ו- 95% לחות. התמונה בארות במרווחי זמן קבועים לפי הצורך כדי לאפשר תאים כדי להשלים ריפוי הפצע (למשל, כל 2 h עבור 72 h).
- לחשב את הפצע בצפיפות ורוחב על-ידי התוכנה המשויכים םלצה אוטומטיות, בצילום מואץ (ראה טבלה של חומרים). כדי לחשב את אחוז השינוי בגודל הפצע יחסית לגודלו של הפצע מתחיל, הגדר את רוחב הפצע בזמן 0 שווה ל- 100%. לחלק את גודל הפצע כל timepoint הבאים לפי גודל הפצע בזמן 0, להכפיל ב- 100 כדי להשיג את האחוז (איור 1).
3. פלישת Assay
- בשלב הבא 1.4, זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחות 6-טוב כדי לאפשר תאים להגיע למפגש 90% בח' 48 תאים תחזוקה חממה מעבדה מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות.
- למחרת, לשנות מדיה פנול אדום מדיה פנויה שיושלם כנדרש, לרבות הפשיטו לתוספי FBS חום-לא פעיל, פחם.
הערה: יכול להיות pretreated תאים בשלב זה בהתאם תכנון ניסויים. - בשלב זה, למקם את בקבוקון מטריצה חוץ-תאית 10 מ"ג/מ"ל (ראה טבלה של חומרים) על קרח, ולתת לזה להפשיר במקרר למשך הלילה.
- למחרת, הפלישה מראש מגניב assay מספקת על ידי הנחת לוחות 24-ובכן, תרבית תאים מוסיף, צינורות microcentrifuge, וטיפים פיפטה במקרר (4 ° C) במשך לפחות 2 h עובדים עמם מטריצה חוץ-תאית.
- באמצעות ציוד צוננת בשכונה תרביות רקמה, לדלל מטריצה חוץ-תאית 10 מ"ג/מ"ל, 1:1 עם מדיית פנול אדום-חינם, ללא סרום כדי ריכוז הסופי של 5 מ"ג/מ"ל.
הערה: שמור תמיד את המניות ואת מטריצה חוץ-תאית מדולל על קרח. היחס של מטריצה חוץ-תאית למדיה ניתן להתאים בהתבסס על מאפייני הקו תא בשימוש וזמינותו. - באמצעות ציוד צוננת בשכונה תרביות רקמה, להוסיף 100 μL של מטריצה חוץ-תאית מדולל התוספות (ראה טבלה של חומרים) הונחו בצלחת 24-. טוב. ודא כי המטריקס היא רמת ללא בועות. מקם את הצלחת 24-ובכן המכיל מצופים מטריצה מוסיף בחממה ב 37 ° C כדי לאפשר המטריקס להקשיח.
- להכנות תאים עבור הפלישה assay, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS 1 x, וארוקן את PBS, ומוסיפים µL 500 של טריפסין 1 x-EDTA מכל קידוח. מקם את הצלחת 6-ובכן בחממה מעבדה ומתוחזק על 37 ° C, 5% CO2ו- 95% לחות עד כל התאים יש תלושים מהחלק התחתון של הלוח.
- ברגע תאים יש תלושים, להוסיף 500 µL של פנול אדום-חינם, ללא סרום מדיה מכל קידוח של תאי trypsinized.
- µL 1,000 תאים מנותקת להעביר צינור microcentrifuge ו ספין למטה במשך 5 דקות ב x 400 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
- האחות מדיה ו resuspend תאים בתקשורת פנול אדום-חינם, ללא סרום (אמצעי אחסון תלויות ריכוז של תאים). ספירת תאים באמצעות תא אוטומטיות מונה (ראה טבלה של חומרים) ולכוונן את העוצמה של התא השעיה על ריכוז סופי של תאי5 5 x 10 מ"ל.
הערה: Hemocytometer עם מיקרוסקופ עשוי לשמש גם לספור תאים. - להוסיף 600 μL של צמיחה מלאה מדיה הבארות של צלחת 24-ובכן זה ישמש עבור וזמינותו הפלישה.
הערה: ניתן להוסיף chemoattractants נוספים או טיפולים מדיום הגידול מלאה בתוך הבאר (החדר התחתון). הניסויים מחולקת לרמות הוסיף הרכב (1 x PBS) או 100 ננומטר דקסמתזון מדולל ב- PBS x 1 לתא התחתון. - המקום מצופים מראש להוסיף כל טוב שמכיל מדיום הגידול מלאה שישמש עבור וזמינותו הפלישה. לאחר מכן להוסיף 200 μL של תאים מעל כל הוספה תא מצופה מראש (העליון קאמרית) עבור סכום כולל של עונה 1 פרק 105 תאים.
הערה: כפקד שלילי עבור זה וזמינותו, ניתן להוסיף אמצעי שווה של פנול אדום-חינם, ללא סרום מדיה (ללא תאים) לתא העליון. - מניחים צלחת 24-ובכן בחממה מעבדה ומתוחזק על 37 ° C, 5% CO2ו- 95% לחות במשך 24 שעות ביממה.
הערה: תקופת הדגירה 24 שעות היה מותאם עבור התאים מונצחים trophoblast בטרימסטר הראשון, בהמשך בדיקות עשוי להידרש כדי לקבוע תקופת הדגירה נדרש בשורות תאים אחרים. - בעקבות לילה דגירה, שאיבה התקשורת שנותרו מן החדר העליון והתחתון מבלי להפריע את מטריצה חוץ-תאית. . אז, בזהירות להסיר את מטריצה חוץ-תאית ללא פלש תאים מן החלק העליון של תותב עם ספוגית כותנה, מקימה פעמים רבות ככל הדרוש כדי להסיר מטריצה חוץ-תאית.
- רחיצת כל להוסיף 3 x עם PBS 1 x, הוספת PBS בשני הצ'יימברס העליון והתחתון של הבאר. האחות PBS לשטוף אחרי זה.
- לתקן תאים מצורף צילום תקריב על-ידי הצבת מוסיף לתוך מאה אחוז מתנול קרח למשך 30 דקות ב 4 º C. שטיפת מוסיף 3 x 1-PBS והסר PBS לאחר הגמר לשטוף. כתם התאים המצורפת את הכיסויים 10 דקות בויולט קריסטל 0.2% 20% אתנול.
- לשטוף 3 x עם מים יונים, תשאף מים יונים לאחר כביסה הסופי.
- מילה נהדרת מוסיף לשעה בטמפרטורת החדר. באמצעות מלקחיים, סכין גילוח, לחתוך בזהירות את הקרום התחתון של הקדמי והר על משטח זכוכית עם הצד התחתון כלפי מעלה. לאפשר הרכבה מדיה לייבוש בטמפרטורת החדר.
- להשיג לפחות 4 תמונות ייחודיות של תאים פלש עבור דגימה באמצעות מיקרוסקופ אור עם יעד 20 x. לספור את המספר הכולל של תאים בכל תמונה, לנרמל את מספר התאים כדי לשלוט דגימות להתוות נתונים (איור 2).
4. הפצת Assay
- בשלב הבא 1.4, לספור תאים trypsinized מן הבקבוק באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות, זרע לתוך צלחות 6-ובכן-צפיפות של 2 x 105 תאים לכל טוב בתקשורת צמיחה רגיל.
- מקום תאים חממה מעבדה ומתוחזק על 37 ° C, 5% CO2ו- 95% לחות במשך 4 שעות או עד תאים יש דבקה.
- שינוי מדיה פנול אדום חינם מדיה בתוספת כנדרש, לרבות חום-לא פעיל, פחם הפשיטו לתוספי FBS ולהוסיף הטיפול הרצוי. הניסויים מחולקת לרמות הוסיף הרכב (1 x PBS) או 100 ננומטר דקסמתזון מדולל ב- 1 x PBS. למקם את הצלחות 6-ובכן חממה מעבדה ומתוחזק על 37 ° C, 5% CO2ו- 95% לחות.
- להסיר מדיה ולהחליף עם מדיה חדשה, טיפול כל 48 שעות.
- לאחר 24, 48 או 72 h טיפול, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של 1 x PBS ולהוסיף 500 µL של טריפסין-EDTA מכל קידוח. מקום 6-ובכן צלחת החממה עד תאים יש מנותקת צלחת.
- ברגע תאים יש מנותקת לצלחת, להוסיף 500 µL התקשורת החופשית פנול אדום שהושלם לבטל את הפעלתה של טריפסין.
- להוסיף 5 µL של תאים trypsinized µL 5 של Trypan blue בשפופרת נפרד ומערבבים על ידי pipetting.
- לספור תאים מכל קידוח ב שכפל באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית.
- ממוצע מספר התאים לכל במעגן בכל נקודת זמן עלילה כפונקציה של הזמן (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקווים תא מונצחים trophoblast בטרימסטר הראשון האנושית Sw.71, תיקוני-8/SVneo שימשו בניסויים אלה כדי לקבוע את התפקיד של glucocorticoids trophoblast תא ההעברה12. Glucocorticoids שימשו בניסויים אלה כפי שהם לאחרונה הוכחו לשנות פונקציות trophoblast, למרות טיפולים אלטרנטיביים יכול להיות בשימוש12. שתי שורות תאים שטופלו הרכב (1 x PBS) או 100 ננומטר של דקסאמתאזון glucocorticoid סינתטי (דקס) עבור כל הניסויים. צפיפות הפצע וגודל נמדדו כל שעתיים במשך 72 h באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית, זמן לשגות. איור 1 מראה דוגמה של תמונות והתוצאות שתתקבלנה ממנו וזמינותו מאפס ב- timepoints שונים. תמונות לדוגמה מ- 0, 8 ו 18 h timepoints עבור שני הטיפולים סופקו (איור 1 א'). הפצע צפיפות ואת גודל הפצע מוצגים בגרף לאורך זמן עבור דגימות שטופלו בקרת הרכב (Veh) או 100 ננומטר דקס (איור 1B). דקס טיפול מופחת הקצב של סגירת הפצע כפי שנקבע על ידי צפיפות פצע וגם גודל הפצע, המציין כי glucocorticoids לעכב נדידת תאים בתאי trophoblast בטרימסטר הראשון.
איור 2 מציג דוגמה של דימויים של התרבות התא הקדמי בעקבות הפלישה וזמינותו. תאים טופלו במשך 24 שעות ביממה עם Veh או 100 ננומטר דקס. תאים פלשו נספרו מ משכפל עצמאית ארבעה לכל טיפול באמצעות ארבעה שדות המבט הייחודית לכל שכפול. טיפול glucocorticoid מופחת תא invasiveness, כפי שמוצג על ידי צמצום 15% מספר התאים פלש.
איור 3 מראה דוגמה של התפשטות תא וזמינותו. תאים נספרו ב 24, 48, 72 שעות לאחר הטיפול עם Veh או 100 ננומטר דקס. טיפול glucocorticoid מופחת התפשטות תאים, כמצוין על-ידי תאים פחות בכל נקודה בזמן. באופן כללי, מבחני אלה מדגימים glucocorticoid חשיפה מפחית תנועתיות התא על ידי עיכוב התפשטות תאים וגם הפלישה.
איור 1: תא Assay מאפס. (א) להחליפן בתמונות של פצעים עבור Veh ודקס-שטופלו Sw.71 תאים על 0, 8 ו 18 h מוצגים. הקווים האדומים מצביעים על גודל הפצע. הפצע (B) צפיפות וגודל הפצע נמדדו בתאים Sw.71, תיקוני-8/SVneo מטופלים עם הרכב (Veh) או 100 ננומטר דקס. התמונות צולמו כל שעתיים במשך 72 h באמצעות מיקרוסקופ אוטומטיות, זמן לשגות. הנתונים מייצגים הממוצע של ± משכפל עצמאית ארבעה ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תא Assay הפלישה. הפלישה מבחני נערכו עם תאים Sw.71 ותיקוני-8/SVneo שטופלו במשך 24 שעות ביממה עם הרכב (Veh) או 100 ננומטר דקס. (א) להחליפן בתמונות מן הפלישה וזמינותו של תאים Veh, דקס-שטופלו לאחר דגירה 24 שעות ביממה. כניסה ממסגרת התמונה היא שליטה שלילי עם תאים לא הוסיף לתא העליון. תמונות שצולמו 200 x הגדלה. סולם ברים הם תאים 120 מיקרומטר. (B) Invaded נספרו ומייצגים מגרפים הממוצע המנורמל של ± משכפל עצמאית ארבעה ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תא התפשטות Assay. תאים Sw.71 ותיקוני-8/SVneo מטופלים עם הרכב (Veh) או 100 ננומטר דקס נספרו כל 24 שעות ביממה באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית. תא ספירת מוצגים בגרף כפי משכפל זאת אומרת ± SEM לפחות 11 עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך זה מתבסס על שימוש ההעברה הפלישה מבחני לכלול קצב התפשטות תאים כמו תורם פוטנציאלי להבדלים נמדד בתנועת התא trophoblast. נעשה שימוש יחד, מבחני במבחנה אלה הן שיטות פשוטה ויעילה שיכול לשמש כדי לזהות המסלולים הסלולר המסדירים trophoblast ההעברה. כפי שתואר לעיל, ניתן לטפל trophoblast תאים עם הורמונים, ציטוקינים, גורמי גדילה או מולקולות אחרות כדי לקבוע את ההשפעה שלהם על התנועה trophoblast. לחלופין, חלבונים היעד עשוי להיות מרוקנים מתאי התירי את תפקיד פונקציונלי שלהם ב- trophoblast תנועתיות. זיהוי מאפננים מפתח של הגירה trophoblast עשוי לספק הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים כבסיס שמירת היריון הקשורות לפגמים היפרדות, כולל רעלת, פיגור גדילה תוך רחמי, לידה preterm.
ישנם מספר שלבים קריטיים של פרוטוקול זה נדרשים להשיג תוצאות מדויקות. מכיוון פנול אדום יש פעילות אסטרוגניים בריכוזים בשימוש תא תרבות המדיה13, חשוב שהמדיה חינם פנול אדום משמש עבור נקודות קצה נסיוני למניעת הפעלה בלתי רצויה של קולטן אסטרוגן בתאי. במהלך הפלישה transwell וזמינותו, חשוב להבטיח כי מטריצות הוא הומוגני, רמה, כי ספקי קר משמשים כדי למנוע הפילמור מוקדמת של המטריקס. כאשר עורכים מבחני התפשטות ופלישה של התא, חשוב למנות דוגמאות מיד כדי למנוע re-הדבקות של התאים ללוחות תרביות רקמה. צריך גם להתייחס לזה תחת שיקול כי מוות של תאים עקב טיפול ניסיוני יכול להשפיע על התוצאות של כל מבחני שלוש. לכן, צריך להעריך סמנים של מוות תאי (למשל, שחרור לקטט דהידרוגנאז, הוצאתו phosphatidylserine או השפלה DNA) בתגובה לטיפול בקו תא ניסיוני לפני חישוב ההעברה, הפלישה, ו התפשטות14. קיימות מספר מגבלות עבור אלה מבחני, לדוגמה, התהליך של יצירת פצע טפט תא גורם לתגובה פציעה תא ממה עשויים לבלבל את תהליך ההעברה של התא. יתר על כן, גירוד ידני עשוי להציג את השתנות interexperiment, למרות ניצול כלי הפצע-maker יוצר אחיד פצע רוחבי חלקית לרכך מגבלה זו. החיסרון של וזמינותו הפלישה הוא כי זה וזמינותו נקודת קצה, קינטיקה התנועה לא השיגו בקלות. למרות מגבלות אלו, לספק מבחני המתוארים כאן לשחזור נתונים כמותיים-נמוכים יחסית.
כן, ניתן לשנות את מבחני המתוארים כאן כדי למדוד את נדידת תאים סוגי תאים אחרים, אף על פי מבחני האלה לא יהיה מתאים עבור סוגי תאים שאינם מחסידי. ב וזמינותו מאפס, המרווחים הדמיה עבור זמן לשגות מיקרוסקופ עשוי להיות מותאם ללכוד מספיק הבדלים בשיעור של נדידת תאים. מערכות אוטומטיות עבור תא חי הדמיה ניתן ללכוד את גודל הפצע תמונות כמו בתדירות גבוהה כמו בכל 15 דקות מתמונות שצולמו לפחות בכל 30 דקות ניתן להשתמש ביריעות כדי ליצור סרט של ריפוי הפצע. הפלישה וזמינותו, הריכוז של מטריצה חוץ-תאית, נזרע המספר הכולל של תאים, משך הדגירה טרם מתקן וספירת תאים עשוי להיות מותאם לחשבון עבור שיעור מסוים של הפלישה סוגי תאים שונים. ב וזמינותו התפשטות תאים, מספר התאים נזרע על גבי הלוחות ואת נקודות זמן לספירת תאים עשוי להיות מותאם לחשבון עבור תעריפים שונים של צמיחת תאים. באופן כללי, מבחני אלה הם כלים גמישים ונגישים מאוד ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים לזיהוי המנגנונים נדידת תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים ד ר גיל מור על מתן התאים Sw.71. מחקר זה נתמך על ידי פרס אלברט מלומד מק'קרן כדי ייגמר בתיקו
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
