Summary
Her presenterer vi en svært tilgjengelig protokoll for å vurdere celle bevegelsen i menneskelig trophoblast celler ved hjelp av tre in vitro analyser: scratch analysen, transwell invasjon analysen og celle spredning analysen.
Abstract
Cellen bevegelse er en kritisk egenskap for trophoblasts under placental utvikling og tidlig i svangerskapet. Betydningen av riktig trophoblast overføring og invasjonen er demonstrert av graviditet lidelser som svangerskapsforgiftning og intrauterine vekst begrensning, som er forbundet med utilstrekkelig trophoblast invasjon av mors blodkar. Dessverre vår forståelse av mekanismer som morkaken utvikler seg fra overføring av trophoblasts er begrenset. In vitro analyser av celle migrasjon via scratch analysen er et nyttig verktøy i å identifisere faktorer som regulerer trophoblast trekkfugler kapasitet. Denne analysen alene definerer imidlertid ikke mobilnettet endringene kan føre til endrede celle migrasjon. Denne protokollen beskriver tre forskjellige in vitro analyser som brukes kollektivt å evaluere trophoblast celle bevegelse: scratch analysen, analysen invasjon og spredning analysen. Protokollene beskrevet her kan også endres for bruk i andre linjer å kvantifisere celle bevegelse i respons på stimuli. Disse metodene kan etterforskerne å identifisere individuelle faktorer som bidra til celle bevegelsen og gir en grundig undersøkelse av potensielle mekanismene bak tydelig endringer i celle migrasjon.
Introduction
Placental utvikling er et viktig skritt i etableringen av graviditet, påvirker både mors og fosterets helse. Imidlertid er mekanistisk grunnlaget som dette skjer ikke fullt ut forstått. Celle migrasjon er en viktig biologisk prosess som bidrar til etablering og funksjoner av morkaken under graviditeten. Etter blastocysten implantasjon skiller trophectoderm villous trophoblasts, som dekker overflaten av chorion villi, og er involvert i gass og næringsstoffer exchange, og extravillous trophoblasts (EVTs), som migrerer ut fra villi og invadere mors decidua og blodkar1. Migrering av EVTs er viktig for ombygging mors spiral arterier og etablere uteroplacental sirkulasjon for å støtte fetal vekst2. Utilstrekkelig trophoblast invasjon under graviditet resulterer i unormal placental utvikling og kan bidra til graviditet komplikasjoner som preeclampsia, svangerskapsdiabetes hypertensjon, intrauterin vekst begrensning og tidlig fødsel3, 4. Derfor er forstå faktorene som påvirker trophoblast motilitet avgjørende å bestemme veier kreves for vanlig placentation.
Trophoblast overføring styres av et kompleks nettverk av signalnettverk molekyler, inkludert vekstfaktorer, cytokiner, hormoner og angiogenic faktorer5. På grunn av begrensningene av studere morkaken i vivo, in vitro analyser utnytte udødeliggjort menneskelige trophoblast celle linjene er avgjørende for å identifisere faktorer som bidrar til trophoblast motilitet. Bunnen og invasjonen analyser har vært brukt mye til kvantitativt vurdere rollen molekyler på trophoblast celle migrasjon6,7,8. Men mens nyttig i tandem å undersøke hvordan endringer i migrasjon kan forårsakes av endringer i celle invasiveness, høyde disse to analyser ikke for ytterligere mekanismer som kan bidra til endrede priser av celle migrasjon. For eksempel kan reduksjoner til frekvensen av celle spredning resultere i færre celler tilgjengelige for overføring.
Her beskriver vi kvantitative i vitro metoder for å vurdere trophoblast overføring ved hjelp av bunnen, celle spredning og celle invasjonen analyser. Et ensartet sår er opprettet i en celle monolayer i scratch analysen, og migrering av celler å fylle gapet er målt ved automatisert, time-lapse avbildning av såret og tetthet av celler i såret. Celle spredning analysen er basert på beregning av forholdet mellom cellene på hvert punkt i forhold til en kjent start antall celler. I celle invasjonen analysen, celler er seeded oppå en ekstracellulær matrix-belagt celle kultur sett inn kammer (f.eks Transwell) og antall celler som invaderer gjennom den ekstracellulære matrisen svar chemo-attractant telles.
Scratch analysen er et enkelt og effektivt verktøy som kan brukes til å bestemme hvordan ulike miljømessige forhold påvirker celle migrasjon. Spredning og invasjonen analyser kan senere brukes til å finne ut bidrag av celle spredning og invasiveness for generelle endringer i celle migrasjon. Samlet gir disse analyser robust målinger av biologiske prosesser som kan bidra til celle motilitet. To udødeliggjort første trimester trophoblast linjer ble brukt i beskrevet analyser, Swan.71 (Sw.71) og halv-st-8/SVneo9,10. Men kan disse analyser også være optimalisert for bruk i andre celletyper å identifisere viktige modulatorer av celle migrasjon og invasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse
- Vedlikeholde celler i T-75 flasker i standard vekst medier på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet.
Merk: Cellene som brukes i disse eksperimentene ble den udødeliggjort første trimester trophoblast cellen linjer Swan.71 (Sw.71) og halv-st-8/SVneo9,10. Sw.71 cellene ble opprettholdt i DMEM/F-12 med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 1.0 mM natrium pyruvate, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM ikke-essensielle aminosyrer, 100 enheter/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Halv-st-8/SVneo cellene ble opprettholdt i RPMI-1640 supplert med 5% inaktivert FBS. - At cellene å replikere til de når 90-100% samløpet. Bruker sterilt vev-kultur flyt hette, Sug opp media fra flasken og vask cellene med 10 mL steril 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Sug opp PBS og legge 5 mL 1 x (0,05%) Trypsin-EDTA til kolbe, sørge for at cellene er dekket av trypsin. Plasser kolbe i laboratoriet inkubator vedlikeholdt på 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfuktighet til alle celler har løsrevet fra bunnen av flasken (ca 5-10 min).
- Legge til 10 mL forvarmes vekst medier kolbe deaktivere trypsin-EDTA.
2. scratch analysen
- Følgende trinn 1.4, frø riktig antall celler i en 24-vel plate å oppnå 100% samløpet i 48 timer.
Merk: Det er mulig å utføre scratch analysen med en rekke forskjellige plate oppsett. Maksimalt antall brønner tillatt av såret maker verktøyet er en 96-brønns format. - Neste dag (dag før bunnen analysen), endre media til fenol-rød gratis media supplert som kreves, inkludert inaktivert, trekull dekstran-strippet FBS.
Merk: Andre studier har anbefalt bruk av medier med lav konsentrasjon FBS (f.eks 1%) minimere celle spredning, som kan brukes som et alternativ i denne protokollen11. - På dagen for scratch analysen, pretreat celler i 30 min ved å legge til ønskede behandling for media i hver brønn. Skissert eksperimenter utnyttet kjøretøy (1 x PBS) og 100 nM deksametason fortynnet i 1 x PBS.
-
For å opprette uniform sår, plassere sterilt 10 µL pipette tips om pinnene av såret maker verktøyet. Senk tips i den første raden av brønner og flytter platen langs sporet av såret maker pipette-spisser nå den andre siden av brønnen.
- Flytt platen tilbake til startposisjonen, slik at pipette-spisser kontinuerlig berøre bunnen av platen slik en konstant sår over diameter av brønnen. Fjerne og erstatte de sterile 10 µL pipette-spisser og lavere tips til neste rad brønner.
- Gjenta trinn 2.4 til alle brønnene er ripete.
Merk: Hvis en såret maker verktøyet ikke er tilgjengelig, kan sår opprettes ved manuelt skraping midten av brønnene med 10 µL pipette tips. - Nøye Sug opp media og forsiktig vaske celler to ganger med 1 x PBS. Etter en siste vask, Legg supplert fenol-rød gratis, strippet eller lav-FBS media med ønsket behandling eller kjøretøy (som vist i trinn 2.3).
Merk: Halv-st-8/SVneo celler bør vaskes med supplert fenol-rød medier, som vaske med 1 x PBS vil føre celler koble. - Plasser 24-vel platen inneholder riper brønner i den automatiserte, time-lapse imager (se Tabell for materiale) ligger i et laboratorium inkubator opprettholdt på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet. Bildet brønner med jevne mellomrom for å tillate at celler å fullføre sårheling (f.eks hver 2 timer på 72 h).
- Beregne såret tetthet og bredden av forbundet med automatisert, time-lapse imager (se Tabell for materiale). Beregner prosentvis endring i såret størrelse i forhold til Start såret, angi såret bredden på tiden 0 lik 100%. Del størrelsen på såret i hver påfølgende timepoint av såret størrelsen på tiden 0 og multipliseres med 100 for å få ønsket (figur 1).
3. invasjonen analysen
- Følgende trinn 1.4, frø riktig antall celler i 6-vel platene slik at cellene å nå 90% samløpet i 48 h. vedlikeholde celler i et laboratorium inkubator satt til 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet.
- Neste dag, endre media til fenol-rød gratis media supplert som kreves, inkludert inaktivert, trekull dekstran-strippet FBS.
Merk: Cellene kan være forbehandlet samtidig avhengig av eksperimentell design. - På denne tiden, plassere ampullen av 10 mg/mL ekstracellulær matrix (se Tabell for materiale) på is, og la det tine i kjøleskapet over natten.
- Neste dag, pre-avkjøle invasjonen analysen leverer ved å plassere 24-vel plater, cellekultur setter, microcentrifuge rør, og pipette-spisser i kjøleskapet (4 ° C) for minst 2 timer før du arbeider med den ekstracellulære matrisen.
- Bruker kjølt forsyninger i vev kultur panseret, fortynne 10 mg/mL ekstracellulær matrix 1:1 med fenol-rød-fri, serum-free media å en final konsentrasjon av 5 mg/mL.
Merk: Alltid holde beholdningen og utvannet ekstracellulær matrix på is. Forholdet mellom ekstracellulær matrix Media kan bli justert basert på egenskaper for celle linjen brukt i analysen. - Bruker kjølt forsyninger i vev kultur panseret, tilsett 100 μL av utvannet ekstracellulær matrix skivene (se Tabell for materiale) som er plassert i 24-vel plate. Kontroller at matrisen er nivå uten bobler. Plass 24-vel platen inneholder matrix-belagt innsettinger i kuvøse på 37 ° C tillate matrix å stivne.
- For å prep celler for invasjonen analysen, vaske celler med 1 mL 1 x PBS, Sug opp PBS og legge 500 µL av 1 x trypsin-EDTA i hver brønn. Plass 6-vel platen i laboratoriet inkubator vedlikeholdt på 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfuktighet til alle celler har løsrevet fra bunnen av platen.
- Når celler har enebolig, legger du til 500 µL av fenol-rød-fri, serum-free media hver brønn av trypsinized celler.
- Overføre 1000 µL av frittstående celler til microcentrifuge t og rotere ned i 5 min på 400 x g på 4 ° C.
- Sug opp media og resuspend celler i fenol-rød-fri, serum-free media (volumet avhenger på konsentrasjon av celler). Telle celler med en automatisert cellen counter (se Tabell for materiale) og justere volumet av cellen suspensjon for en siste konsentrasjon av 5 x 105 celler per mL.
Merk: En hemocytometer og mikroskopet kan også brukes til å telle celler. - Legge til 600 μL komplett vekst medier brønnene av 24-vel plate som skal brukes for invasjonen analysen.
Merk: Flere chemoattractants eller behandlinger kan legges til fullstendig vekstmediet i brønnen (lavere kammer). Skissert eksperimenter lagt kjøretøy (1 x PBS) eller 100 nM deksametason fortynnet i 1 x PBS til nedre kammeret. - Sted pre belegg inn hver brønn som inneholder fullstendig vekstmediet som skal brukes for invasjonen analysen. Deretter tilsett 200 μL av celler på hver pre belagt celle sett (øvre kammer) for totalt 1 x 105 celler.
Merk: Som en negativ kontroll for denne analysen, kan en lik mengde fenol-rød-fri, serum-free media (uten celler) legges til den øvre kammeret. - Plasser 24-vel plate i laboratoriet inkubator opprettholdt på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet for 24 timer.
Merk: Inkubasjonstiden 24 h var optimalisert for udødeliggjort første trimester trophoblast cellene og ytterligere tester kan være nødvendig å bestemme nødvendige inkubasjonstiden i andre linjer. - Etter natten inkubasjon enkel du sugeevnen gjenværende media fra øvre og nedre kammeret uten å forstyrre den ekstracellulære matrisen. Deretter forsiktig fjerne ekstracellulær matrix og ikke-invaderte celler fra den øvre delen av sette med en bomullspinne, swabbing så mange ganger som nødvendig for å fjerne ekstracellulær matrix.
- Vask hver inn 3 x med 1 x PBS, legge PBS til både øvre og nedre kamre av brønnen. Sug opp PBS etter hver vask.
- Fastsette celler knyttet til skivene ved å plassere innstikk i 100% iskald metanol i 30 min på 4 ° C. Vask setter inn 3 x 1 x PBS og fjern PBS etter finalen vask. Stain cellene knyttet til skivene i 10 min med 0,2% crystal violet i 20% etanol.
- Skyll 3 x med deionisert vann og Sug opp deionisert vann etter siste vask.
- Air-Dry setter 1t ved romtemperatur. Ved hjelp av tang og et barberblad, klippe bunnen membranen av sette og montere på et glass lysbilde med undersiden grossist. Tillat montering materiale tørke ved romtemperatur.
- Få minst 4 unike bilder av invaderte celler per utvalget med lys mikroskop med en 20 x mål. Teller antall celler i hvert bilde og normalisere antall celler å kontrollere prøver og plotte dataene (figur 2).
4. spredning analysen
- Følgende trinn 1.4, telle trypsinized celler fra flasken med en automatisert celle teller og frø i 6-vel platene på en tetthet av 2 x 105 celler per brønn i standard vekst medier.
- Plasser celler i et laboratorium inkubator opprettholdt på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet 4 h eller til celler har overholdt.
- Endre media å fenol-rød gratis media supplert som kreves, inkludert inaktivert, trekull dekstran-strippet FBS og legge til ønskede behandling. Skissert eksperimenter lagt kjøretøy (1 x PBS) eller 100 nM deksametason fortynnet i 1 x PBS. Plass 6-vel platene i et laboratorium inkubator opprettholdt på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet.
- Fjerne media og erstatte med nye medier og behandling hver 48 timer.
- Etter 24 48 og 72 h behandling, vask celler med 1 mL 1 x PBS og legge til 500 µL av trypsin-EDTA i hver brønn. Plasserer 6-vel plate i inkubator til celler har løsrevet fra platen.
- Når celler har løsrevet fra platen, kan du legge til 500 µL av supplert fenol-rød gratis media å deaktivere trypsin.
- Legg 5 µL av trypsinized celler til 5 µL Trypan blå i et separat rør og bland av pipettering.
- Telle celler fra alle brønnene i duplikat bruker en automatisert celle teller.
- Gjennomsnittlig antall celler per brønn på hvert punkt og plott som en funksjon av tid (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellelinjer udødeliggjort menneskelige første trimester trophoblast Sw.71 og halv-st-8/SVneo ble brukt i disse eksperimentene for å bestemme rollen glukokortikoider i trophoblast celle migrasjon12. Glukokortikoider ble brukt i disse eksperimentene som de har nylig vist å endre trophoblast funksjoner, selv om alternative behandlinger kan være brukt12. Begge linjer ble behandlet med kjøretøy (1 x PBS) eller 100 nM av syntetisk glukokortikoid dexamethasone (Dex) for alle eksperimenter. Såret tetthet og størrelse ble målt hver 2 timer på 72 h med en automatisert, time-lapse tenkelig system. Figur 1 viser et eksempel på bilder og resultatene fra scratch analysen på forskjellige timepoints. Eksempler på bilder fra 0, 8 og 18 h timepoints for begge behandlinger har fått (figur 1A). Såret tettheten og sår størrelse er grafisk over tid for prøver behandlet med kjøretøy (Veh) eller 100 nM Dex (figur 1B). Dex behandling redusert hastighet på såret nedleggelse etter både såret tetthet og sår størrelse, som angir at glukokortikoider hemmer celle migrasjon i første trimester trophoblast celler.
Figur 2 viser et eksempel på bilder tatt av celle kultur sette etter invasjonen analysen. Cellene ble behandlet for 24 timer med Veh eller 100 nM Dex. Invaderte celler ble regnet fra fire uavhengige gjentak per behandling med fire unike synsfelt per replikere. Glukokortikoid behandling redusert celle invasiveness, som vist av en 15% reduksjon i antall invaderte celler.
Figur 3 viser et eksempel på celle spredning analysen. Cellene ble talt på 24, 48 og 72 h etter behandling med Veh eller 100 nM Dex. Glukokortikoid behandling redusert celle spredning, som indikert av færre celler på hvert tidspunkt. Samlet viser disse analyser at glukokortikoid eksponering reduserer celle motilitet ved å hemme både celle spredning og invasjon.
Figur 1: celle Scratch analysen. (A) representant bilder av sår Veh - og Dex-behandlet Sw.71 cellene på 0, 8 og 18 h vises. Røde linjene indikerer sår størrelse. (B) såret tetthet og såret ble målt i Sw.71 og halv-st-8/SVneo-cellene behandlet med kjøretøy (Veh) eller 100 nM Dex. Bildene ble tatt hver 2 timer på 72 h med en automatisert, time-lapse mikroskop. Dataene representerer gjennomsnittet av fire uavhengige gjentak ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: celle invasjonen analysen. Invasjonen analyser ble gjennomført med Sw.71 og halv-st-8/SVneo-cellene behandlet for 24 timer med kjøretøy (Veh) eller 100 nM Dex. (A) representant bilder fra invasjonen analysen for Veh - og Dex-behandlet cellene etter 24-timers inkubasjon. Innfelt bilde er negativ kontroll med ingen celler lagt til den øvre kammeret. Bilder tatt på 200 x forstørrelse. Skala barer er 120 µm. (B) invadert celler ble regnet og søylediagrammer representerer normalisert gjennomsnittet av fire uavhengige gjentak ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: celle spredning analysen. SW.71 og halv-st-8/SVneo-cellene behandlet med kjøretøy (Veh) eller 100 nM Dex var regnet hver 24 h med en automatisert celle teller. Celletall er grafisk som gjennomsnittlig ± SEM minst 11 uavhengige replikerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne prosedyren bygger på bruk av migrasjon og invasjonen analyser med frekvensen av celle spredning som potensielle bidragsyter til målt forskjeller i trophoblast celle bevegelse. Brukes sammen, er disse in vitro analyser enkle og effektive metoder som kan brukes til å identifisere mobilnettet veier som regulerer trophoblast overføring. Som beskrevet ovenfor, kan trophoblast cellene behandles med hormoner, cytokiner, vekstfaktorer eller andre molekyler å avgjøre deres innvirkning på trophoblast bevegelse. Eventuelt kan mål proteiner bli tømt fra celler å belyse sin funksjonelle rolle i trophoblast motilitet. Identifisere viktige modulatorer trophoblast migrasjon kan gi en bedre forståelse av de grunnleggende mekanismene underliggende komplikasjoner i svangerskapet knyttet til placental feil, inkludert preeclampsia, intrauterine vekst begrensning og tidlig fødsel.
Det er flere viktige skritt i denne protokollen som kreves for å få nøyaktige resultater. Ettersom fenol-rød har estrogenic aktivitet i konsentrasjoner i celle kultur medier13, er det viktig at fenol-rød gratis media brukes for eksperimentelle endepunkter for å hindre uønsket aktivering av østrogenreseptor i celler. Under transwell invasjon analysen er det viktig å sikre at den ekstracellulære matrisen er homogen, nivå, og at kaldt forsyninger brukes til å forhindre tidlig polymerisering av matrix. Når du utfører celle spredning og invasjonen analyser, er det viktig å telle prøver umiddelbart å forhindre re-overholdelse av cellene til vev kultur plater. Det bør også tas under vurdering at celledød på grunn av eksperimentell behandling kan påvirke resultatene av alle tre analyser. Derfor markører for celledød (f.eks laktat dehydrogenase utgivelsen, fosfatidylserin eksternalisering eller DNA degradering) i respons på behandling bør vurderes i eksperimentell cellen linje før vurderer migrasjon, invasjon, og spredning14. Noen begrensninger finnes for disse analyser, for eksempel å lage et sår i en celle monolayer induserer en celle skade respons enn kan forvirre celle overføringsprosessen. Videre kan manuell skraping presentere interexperiment variasjon, men bruker et sår-maker verktøy som lager uniform såret bredder kan delvis redusere denne begrensningen. Ulempen med invasjonen analysen er at det er et endepunkt analysen, og the kinetics av bevegelse er ikke lett nås. Til tross for disse begrensningene, analyser beskrevet her gi reproduserbare, kvantitative data på relativt rimelige.
Analyser beskrevet her kan også endres for å måle celle migrasjon i andre celletyper, selv om disse analyser ikke ville være egnet for ikke-tilhenger celletyper. I scratch analysen, kan tenkelig intervaller for time-lapse mikroskopi justeres for å tilstrekkelig fange forskjellene i frekvensen av celle migrasjon. Automatiserte systemer for levende celle bildebehandling kan fange sår størrelse bildene så ofte som hver 15 min. bilder tatt minst hver 30 min kan bli sydd sammen til å lage en film av sårheling. Antall celler seeded invasjonen analysen, konsentrasjonen av ekstracellulær matrix, og lengden på inkubasjon før fikse og teller celler kan justeres kontoen for den bestemte satsen av invasjonen i forskjellige celletyper. I celle spredning analysen, kan antall celler seeded på platene og tidspunkt for cellen opptelling justeres til kontoen for ulike satser for cellevekst. Samlet er disse analyser fleksible og svært tilgjengelige verktøy som kan brukes i en rekke celletyper for å identifisere virkningsmekanismer underliggende celle migrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Gil Mor for å gi Sw.71 cellene. Denne forskningen ble støttet av en Albert McKern Scholar Award for S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
