Zebrafish (ढाणियो rerio) माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण और रोगजनन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया हड्डीवाला पशु मॉडल बन रहे हैं । यह प्रोटोकॉल zebrafish लार्वा में भोजन जनित संक्रमण के लिए एक वाहन के रूप में प्रोटोजोआ Paramecium caudatum के उपयोग का वर्णन करता है । पी caudatum आसानी से internalizes बैक्टीरिया और लार्वा zebrafish द्वारा प्राकृतिक शिकार व्यवहार के माध्यम से लिया जाना ।
उनकी पारदर्शिता, आनुवंशिक संश्वसनता, और रखरखाव में आसानी के कारण, zebrafish (ढाणियो rerio) संक्रामक रोगों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया हड्डीवाला मॉडल बन गए हैं । कोशिकीय प्रोटोजोआ Paramecium caudatumपर लार्वा zebrafish स्वाभाविक रूप से शिकार करते हैं । इस प्रोटोकॉल लार्वा zebrafish में भोजन जनित संक्रमण के लिए एक वाहन के रूप में पी caudatum के उपयोग का वर्णन है । पी caudatum internalize बैक्टीरिया और बैक्टीरियल कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला कई घंटे के लिए व्यवहार्य रहते हैं । Zebrafish तो caudatumपर शिकार, बैक्टीरियल लोड paramecium वाहन के पाचन पर अग्रांत्र में जारी किया जाता है, और बैक्टीरिया आंत्र पथ उपनिवेश । प्रोटोकॉल paramecia रखरखाव का एक विस्तृत विवरण शामिल है, बैक्टीरिया के साथ लोड हो रहा है, बैक्टीरियल क्षरण और खुराक के निर्धारण, साथ ही paramecia के साथ खिलाने से zebrafish के संक्रमण. भोजन जनित संक्रमण की इस पद्धति का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह बारीकी से मानव रोग में मनाया संक्रमण की विधा की नकल है, विसर्जन प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक मजबूत औपनिवेशीकरण की ओर जाता है, और रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन की अनुमति देता है । zebrafish मॉडल में खाद्य जनित संक्रमण मेजबान के भीतर बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, और बैक्टीरियल बोझ, स्थानीयकरण, प्रसार और रुग्णता सहित pathogenicity की पहचान.
Zebrafish शेयर आकृति विज्ञान और कार्यात्मक स्तनधारियों के साथ सुविधाओं के संरक्षण, granulocytic वंश सहित (जैसे, न्यूट्रोफिल), monocyte/मैक्रोफेज की तरह कोशिकाओं, टोल रिसेप्टर्स की तरह, समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स1 . zebrafish में आंत्र पथ पूरी तरह से 6 दिनों के बाद निषेचन (dpf) में विकसित होता है और स्तनधारी जठरांत्र संबंधी मार्ग के साथ रूपात्मक और कार्यात्मक संरक्षण से पता चलता है, जैसे आंत्र उपकला कोशिकाओं में संरक्षित transcriptional विनियमन के रूप में 2. यह आंतों माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण और रोगजनन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल zebrafish बनाता है । enterohemorrhagic ई कोलाई3, Vibrio हैजा4,5, साल्मोनेला enterica6, सहित zebrafish मॉडल में प्रवेश रोगाणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन किया गया है, zebrafish microbiota7,8, और आंतों उन्मुक्ति में प्रोबायोटिक्स की भूमिका9. zebrafish मॉडल का एक विशिष्ट लाभ यह है कि यह अंतर्जात microbiota, जो मिश्रित माइक्रोबियल आबादी3के संदर्भ में माइक्रोबियल व्यवहार की जांच की अनुमति देता है को बाधित किए बिना कई रोगाणुओं द्वारा बृहदांत्र है, 6. वर्तमान में, जठरांत्र औपनिवेशीकरण और रोग के सबसे zebrafish मॉडल स्नान विसर्जन द्वारा रोगाणुओं के प्रशासन पर निर्भर करते हैं, जहां zebrafish10समय की एक विशेष राशि के लिए एक जीवाणु निलंबन में मशीन हैं । हालांकि, इस प्रशासित बैक्टीरिया की सटीक खुराक निर्धारित करने के लिए मुश्किल बनाता है, और विशेष रूप से गैर रोगजनक बैक्टीरिया के साथ कुछ रोगाणुओं के साथ सीमित औपनिवेशीकरण की ओर जाता है. वैकल्पिक रूप से, एक जीवाणु निलंबन मौखिक gavage11के माध्यम से मछली के लिए प्रशासित है, लेकिन यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और पुराने लार्वा और वयस्क मछली के लिए सीमित है ।
इस प्रोटोकॉल zebrafish लार्वा के जठरांत्र संबंधी मार्ग के लिए रोगाणुओं के भोजन वहन वितरण के लिए एक वाहन के रूप में कोशिकीय प्रोटोजोआ Paramecium caudatum के उपयोग का वर्णन करता है । Paramecia आसान और सस्ते बनाए रखने के लिए कर रहे है और रोगाणुओं की एक विस्तृत विविधता पर खिलाने में सक्षम हैं, शैवाल, कवक सहित, और बैक्टीरिया, जो वे एक ciliated मौखिक नाली12,13,14के माध्यम से internalize । एक बार आंतरिक, बैक्टीरिया रिक्तिकाएं, जो अंततः acidify और सामग्री में आयोजित कर रहे है कई घंटे15की एक समय सीमा से अधिक नीचा दिखा रहे हैं । लार्वा zebrafish प्राकृतिक शिकार के रूप में जल्दी ही सेने के बाद paramecia पर कब्जा, 3 के आसपास-4 dpf तापमान के आधार पर16, और उंहें उच्च दक्षता के साथ ले लो । शिकार कैप्चर की प्रक्रिया का पता लगाने के लिए17पर कब्जा करने से औसत १.२ s पर ले जाता है, और कब्जा कर लिया paramecia जल्दी से zebrafish अग्रांत्र में पचा रहे हैं, ऐसी है कि आंतरिक व्यवहार्य बैक्टीरिया आंत्र पथ3में जारी कर रहे हैं । नतीजतन, paramecia zebrafish के जठरांत्र संबंधी मार्ग में बैक्टीरिया की एक उच्च और सुसंगत खुराक देने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वितरित बैक्टीरिया या तो ऐसे mCherry के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त बदल सकता है के रूप में यहां वर्णित है, या, आनुवंशिक रूप से असभ्य बैक्टीरिया के मामले में, वे पूर्व एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग के भीतर दृश्य की अनुमति हो सकती है जठरांत्र संबंधी मार्ग ।
इस प्रोटोकॉल enteropathogenic ई. कोलाई के भोजन वहन वितरण का वर्णन (enterohemorrhagic ई. कोलाई [EHEC] और अनुयाई इनवेसिव ई. कोलाई [AIEC]), और साल्मोनेला enterica एसएसपी. Typhimurium. दोनों रोगजनक ई. कोलाई और एस typhimurium मल-मौखिक मार्ग18,19के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं, और इस तरह के मांस, सब्जियां, और डेयरी के रूप में दूषित भोजन, के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । एक वाहन के रूप में पी caudatum का उपयोग करना, ई. कोलाई और एस typhimurium सफलतापूर्वक 30 के भीतर zebrafish लार्वा उपनिवेश-सह के 60 मिनट-paramecium वाहन के साथ मशीन । प्राप्त बैक्टीरियल बोझ काफी मजबूत करने के लिए औपनिवेशीकरण कल्पना और ऊतक homogenates चढ़ाना द्वारा बोझ निर्धारित है ।
यहां वर्णित बुनियादी प्रोटोकॉल रोगजनक ई. कोलाईके लिए अनुकूलित किया गया है, और साल्मोनेला enterica और Vibrio हैजासहित अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है । कुछ प्रजातियों कि स्नान विसर्जन के बाद zebrafish आंत उपनिवेश नहीं है के लिए, कुछ साल्मोनेला enterica उपभेदों और कुछ anaerobes सहित, भोजन जनित संक्रमण के रूप में यहां वर्णित सफलतापूर्वक औपनिवेशीकरण स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । microgavage, जो भी लार्वा आंत्र पथ में उच्च बैक्टीरियल बोझ स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है की तुलना में, भोजन जनित संक्रमण तकनीकी रूप से कम चुनौतीपूर्ण है और कम विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । हालांकि, महत्वपूर्ण मापदंडों जीवाणु प्रजातियों और उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस तरह के कारकों जीवाणु और बैक्टीरिया के लिए paramecium घनत्व शामिल-paramecium सह संस्कृति कदम: अगर paramecia के भीतर बैक्टीरियल संख्या कम कर रहे हैं, इस सह संस्कृति कदम में जीवाणु घनत्व में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है । कुछ जीवाणु प्रजातियों paramecium मेजबान को नुकसान का कारण हो सकता है, और यह सूक्ष्म द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल में एक अंय महत्वपूर्ण कारक zebrafish द्वारा शिकार कब्जा है । शिकार के रूप में यहां वर्णित दर इस धारणा है कि हर शिकार एक paramecium की घूस में हड़ताल के परिणाम पर कब्जा पर आधारित है । उच्च घनत्व उच्च शिकार दर सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में paramecia प्रति मछली का उपयोग किया जाता है । हालांकि, शिकार कब्जा प्रणाली में paramecia के घनत्व पर निर्भर है, और बहुत paramecium संस्कृतियों में पतला, शिकार दर के रूप में कम हो सकता है के रूप में 13-15 paramecia प्रति घंटा21,22। एक सीमा है कि शिकार पर कब्जा दरों में भी दृढ़ता से प्रकाश व्यवस्था की स्थिति पर निर्भर है और अंधेरे में, कब्जा दरों ८०% प्रकाश शर्तों21 की तुलना में कम कर रहे है और यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जब प्रयोग की स्थापना । अगर शिकार के लिए जोखिम बार औपनिवेशीकरण का अनुकूलन करने के लिए विस्तार किया जाना है, विचार करने के लिए मल के माध्यम से बैक्टीरिया को माध्यमिक जोखिम के लिए दिया जाना है । शर्तों के तहत ऊपर वर्णित-2 शिकार जोखिम के ज-यह जोखिम नगण्य है, जीवाणुओं के आंत समय बीतने के बाद से अधिक 1 ज और वाहन में बैक्टीरिया की एकाग्रता है बहुत मल की तुलना में अधिक है । हालांकि, अगर शिकार जोखिम समय काफी बढ़ जाती है, यह एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है ।
उपयुक्त नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में शामिल किया जाना चाहिए, जिसमें गैर-रोगजनक ई. कोलाई MG1655 युक्त paramecia के साथ zebrafish के बाद औपनिवेशीकरण की गई है । यदि एकाधिक बैक्टीरियल उपभेदों zebrafish मेजबान उपनिवेश करने की क्षमता के लिए तुलना कर रहे हैं, यह परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है कि उनके आधे paramecia भीतर जीवन तुलनीय है । बैक्टीरियल उत्परिवर्तनों, सेल दीवार अखंडता या एसिड संवेदन समझौता उन सहित, paramecia के भीतर बैक्टीरियल स्थिरता समझौता हो सकता है । ऐसे मामलों में, zebrafish खिला खुराक में अंतर के लिए खाते में समायोजित किया जाना है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और उसके परिणामों की जांच करने के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में zebrafish के इमेजिंग बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण द्वारा सहित, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक zebrafish3से homogenate प्रति CFU निर्धारित करके, इस्तेमाल किया जा सकता है या संक्रमण से जुड़े रुग्णता और मृत्यु की जांच । आदर्श रूप में, बैक्टीरियल दृश्य के लिए, बैक्टीरियल प्रोटीन जैसे mCherry या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए । यह जीवाणु आबादी बढ़ने के दृश्य की अनुमति देगा । यदि बैक्टीरियल तनाव आनुवंशिक रूप से नहीं है या गैर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग अंय कारणों के लिए precluded है, बैक्टीरिया ऐसे एफएम 4 के रूप में एक फ्लोरोसेंट डाई, के साथ दाग हो सकता है 64FX, सह से पहले paramecia के साथ संस्कृति । जब प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, paramecia के साथ सह संस्कृति डाई की चमक कम नहीं करता है और दाग बैक्टीरिया zebrafish आंत में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । हालांकि, डाई समय के साथ पतला हो जाएगा महत्वपूर्ण जीवाणु प्रसार zebrafish मेजबान के भीतर घटित होना चाहिए । या तो मामले में, लाल-फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया हरे-फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया पर बेहतर कर रहे हैं, के बाद से ऊतक autofluorescence लाल चैनल की तुलना में हरे रंग में उच्च हो सकता है ।
यह पाया गया है कि इस प्रोटोकॉल एरोबिक और microaerophilic बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह जीवाणुओं और कवक प्रजातियों के खिलाने के लिए अनुकूल करने के लिए संभव हो सकता है, हालांकि इस परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता रहता है.
The authors have nothing to disclose.
हम महत्वपूर्ण पढ़ने और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Krachler समूह के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । यह काम एक यूटी सिस्टंस स्टार पुरस्कार, BBSRC, और NIH (R01AI132354) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
hemocytometer or cell counter | any | ||
stereomicroscope | any | ||
table-top centrifuge | |||
microwave | |||
rotator wheel | |||
heated shaking incubator | |||
aquatics facilities | |||
breeding tanks |