Summary
Zebrafish (Danio rerio) 널리 사용 된 척추 동물 모델 미생물 식민과 병에 대 한 되 고 있다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레에 식품을 매개로 감염에 대 한 차량으로 Paramecium caudatum protozoan의 사용을 설명합니다. P. caudatum 쉽게 박테리아를 유입 하 고 애벌레 zebrafish 자연 먹이 행동에 의해 촬영 얻을.
Abstract
그들의 투명성, 유전 추적성 및 유지 보수의 용이성, zebrafish (Danio rerio) 전염병은 널리 사용 되는 척추 모델 되고있다. 애벌레 zebrafish 자연스럽 게 단 세포 protozoan Paramecium caudatum에 먹이. 이 프로토콜 애벌레 zebrafish의 식품을 매개로 감염을 위한 차량으로 P. caudatum 의 사용을 설명합니다. P. caudatum internalize 다양 한 박테리아와 세균성 세포는 몇 시간 동안 실행 가능한 유지. Zebrafish P. caudatum에 다음 먹이, 세균성 부하 foregut paramecium 차량 소화 시에 출시 하 고 박테리아는 창 자를 식민지. 프로토콜은 paramecia와 먹이로 paramecia 유지 보수, 박테리아, 로드 세균성 저하 및 복용량, 물론 zebrafish의 감염에 대 한 자세한 설명이 포함 되어 있습니다. 음식을 매개로 감염의이 방법 사용의 장점은 밀접 하 게 인간의 질병에서 감염의 모드를 모방, 침수 프로토콜에 비해 보다 강력한 식민지로 연결을 다양 한 병원 균의 연구를 수 있습니다. Zebrafish 모델에서 식품을 매개로 감염 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용, 및 pathogenicity 세균 부담, 지역화, 배포 및 사망률 등의 세균성 유전자 발현을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
Zebrafish 공유 형태학 상으로 그리고 기능적으로 granulocytic 계보 (예: 호 중구), monocyte/대 식 세포와 같은 세포, 수용 체 통행세 같이, 프로 염증 성 cytokines 그리고 항균 펩 티 드1 포함 한 포유류와 기능 보존 . Zebrafish에 장로 6 일 게시물 수정 (dpf)에 완벽 하 게 개발 되 고 형태학 및 기능 보존 장 상피 세포에 있는 보존된 transcriptional 규칙 등 포유류 위장와 함께 보여줍니다. 2. 이것은 제 브라 장내 미생물 식민과 병에 대 한 우수한 모델. 다양 한 장의 미생물 enterohemorrhagic3 대장균, 비 브리 오 cholerae4,5, 살 모 넬 라 enterica6, zebrafish 모델에서 공부는 zebrafish microbiota7,8, 그리고9장의 면역 probiotics의 역할. 뚜렷한 zebrafish 모델의 장점은 그것 혼합된 미생물 인구3, 의 맥락에서 미생물 행동의 조사를 수 있는 내 생 microbiota를 방해 하지 않고 많은 미생물에 의해 식민지는 6. 목욕 침수, zebrafish 세균성 정지 시간10의 특정 금액에 대 한 인 큐베이 팅에 의해 위장 식민과 질병의 대부분 zebrafish 모델 미생물의 관리에 의존 하는 현재. 그러나,이 어려운 관리, 박테리아의 정확한 복용량을 결정 하 고 특히 비 병원 성 박테리아와 일부 미생물과 제한 된 식민지에 이르게. 또한, 세균 현 탁 액은 구강11를 통해 물고기를 관리 하지만 이것이 기술적으로 도전적이 고 더 오래 된 애벌레 및 성인 물고기.
이 프로토콜 zebrafish 애벌레의 위장 요로에 미생물의 식품을 매개로 배달 차량으로 단 세포 protozoan Paramecium caudatum 의 사용을 설명합니다. Paramecia 간편 하 고 저렴 한 유지 하 고 미생물, 조류, 곰 팡이, 박테리아, 그들은 ciliated 구두 홈12,13,14을 통해 내 면화 등의 다양 한에 먹이의 할 수 있다. 일단 내 면, 박테리아는 그들에서 개최 되는 결국 시 어 지 다 하 고 목차 몇 시간15시간 프레임 저하는. 애벌레 zebrafish paramecia 자연 먹이로 빨리 후에 부 화, 약16, 온도 따라 3-4 dpf 캡처하고 높은 효율으로 그들을 차지 합니다. 먹이 붙 잡음의 과정 검색에서 평균 1.2 s에17, 잡으려고 하 고 캡처된 paramecia zebrafish foregut에 소화 신속 하 게 내 면된 가능한 박테리아는 창 자3에 출시 되는. 그 결과, paramecia zebrafish의 위장 요로에 박테리아의 높은 하 고 일관 된 복용량을 제공 하는 빠르고 쉬운 방법으로 사용할 수 있습니다. 배달 된 박테리아 중 mCherry 같은 형광 단백질을 표현 하는, 여기에 설명 된 대로 변형 될 수 있다 또는 그들은 유전으로 다루기 힘든 박테리아의 경우 미리 내에서 시각화 수 있도록 형광 염료와 스테인드 수는 위장 요 로입니다.
이 프로토콜에 설명 합니다 enteropathogenic 대장균 의 식품을 매개로 전달 (enterohemorrhagic E. 콜라 [EHEC] 및 부착 침략 대장균 [AIEC]), 그리고 ssp. 살 모 넬 라 enterica Typhimurium. 병원 성 대장균 과 S. typhimurium 전송 통해 분 변-구강 경로18,19, 그리고 획득 을 통해 오염 된 음식, 고기, 야채, 유제품 등을 수 있습니다. P. caudatum 를 사용 하 여 차량으로, 대장균 과 S. typhimurium 성공적으로 식민지 화 paramecium 차량 공동 보육의 30-60 분 이내 zebrafish 애벌레. 달성된 세균성 부담 충분히 강력한 시각화 식민 조직 homogenates를 도금 하 여 부담을 결정 하는.
Protocol
Zebrafish 관리, 번 식, 그리고 여기에 설명 된 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드를 따라 하 고 텍사스 대학 보건 과학 센터, 프로토콜의 기관 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었습니다. 숫자 AWC-16-0127입니다.
1. 성장 및 Paramecia 의 유지 보수
- 소스 Zebrafish 국제 리소스 센터 (ZIRC) 등에서 라이브 paramecia 문화를 가져옵니다.
- Paramecia 문화, 1에서 resuspended는 대장균 MG1655 문화 (광학 밀도 OD600 1.0-2.0)의 1 mL의 1 mL을 추가 라이브 성장 문화에서 x E3 (0.29 g/L NaCl, KCl, 13 mg/L 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0.48 g/L HEPES, pH 7.0, 살 균), 그리고 1의 8 mL 10ml 조직 배양 플라스 크로 x E3. 가볍게 소용돌이 22 ° c.에 저장
- 문화를 유지 하려면 2 주마다 10를 포함 하는 신선한 1 x E3 매체의 9 mL와 10 mL 조직 배양 플라스 크에 paramecia 문화의 1 mL 통로8 CFU/mL 대장균 MG1655 1에 resuspended의 x E3.
2. 세균성 복용량 Zebrafish에 관리의 결정
-
Paramecium 내에서 세균 반감기를 결정
참고: 아래 설명 된 대로 paramecia 내의 박테리아의 반감기 도금 paramecium에서 복구 가능한 대장균 에 의해 결정 됩니다.- 박테리아 (OD600 1.0) 22 ° C에서 paramecia와의 2 h 인큐베이션, 다음 paramecia와 50 mL 원뿔 튜브로 세균성 공동 문화를 결합, E3, 그리고 수 x 1와 paramecia 세척 (아래 단계에서 설명 하는 대로 밀리 리터 당 paramecia의 수 3.2.7 고 3.2.8)입니다.
- Paramecia의 수를 세 후 paramecia 및 세균성 공동 문화 (6 h 사후 노출)에 대 한 매시간 50 µ L을 제거 하 고 신선한 1.5 mL 튜브에 각 샘플을 추가 합니다.
- 1% 비 계면 활성 제의 장소 950 µ L ( 재료의 표참조) 인산 염에 버퍼링 (PBS) 염 1.5 mL 튜브와 1 분은 paramecia을 lyse 소용돌이의 각. 수행 하는 1시 10분 희석 액 (900 µ L 즉, 100 µ L)으로 살 균 PBS를 사용 하 여 각 샘플의 희석.
- 선택적 접시에 각 희석의 100 µ L 플레이트 (파운드 tet 매체: 30 µ g/mL 항생물질, 1 g/L NaCl, 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L tryptone)와 16 h 37 ° C에서 품 어. 다음 날, 계산 하 고 계산만 분리 되 고 명료한 개인적인 식민지에 의해 접시 (콜로 니 형성 단위, CFUs)에 세균성 식민지의 수를 기록 합니다. 30-300 CFU 주는 희석으로 접시를 식별 합니다.
- 희석을 결정 요소 사용. 예를 들어 1 µ L 세균성 문화의 살 균 PBS의 99 mL와 혼합 하는 경우이 1: 100 (0.01) 희석입니다. 이 번호는 희석에서 CFU의 수 있을 것입니다. 원래 샘플의 CFU를 결정 하기 위해 모든 시간 지점에 대 한 아래, 계산을 수행:
- 계산 가능한 대장균수를 그래프/paramecium에 해당 하는 시간 노출 단계 3.3.1 계산 paramecia 농도 사용 하 여 게시 하 고 paramecia (그림 1) 내 반감기를 결정 합니다.
- CFU를 사용 하 여 계산 하 고 그래프의 paramecia 농도 단계 3.3.1에서에서 계산을 사용 하 여 x 축에 시간 게시물 보육 대 y paramecium 당 가능한 대장균 수 수 각 시간 지점에 대 한 계산. paramecia 내 반감기를 결정 합니다.
-
세균성 세균성 하프 라이프에서 투약 하 고 먹이 속도 결정 합니다.
참고: 세균성 복용량을 결정 하는 paramecia 안에 박테리아의 반감기와 paramecia에 zebrafish의 먹이 비율 고려 되어야 해야 (단계 3.4 참조).- 다음 수식을 사용 하 여 paramecia 내의 세균성 감퇴를 결정.
(1)
N0 paramecia 당 박테리아의 초기 수량 2 h 부 화 후가 Nt는 시간 t 후 나머지 수량, τ 후 실행 가능한 박테리아의 수는 절반으로, 시간 이며 k는 붕괴 상수. - 저하 실험에서 붕괴 상수 k 세균 하프 라이프를 사용 하 여 결정 (즉, 시간 후 실행 가능한 박테리아/paramecium의 금액은 절반 가까이 떨어졌다).
(2)
하프 라이프의 결정에 대 한 용어
및
(3)
또는
(4)
참고: 그림 1을 바탕으로, paramecia에 대장균 의 반감기는 약 2.3 h 이다. 따라서, 수식 (4), 감퇴 율, k를 사용 하 여, 대장균 은:
(5)
- Zebrafish 애벌레에 의해 촬영 가능한 박테리아 (Nt)의 복용량을 찾을 반감기 실험에서 감퇴 율 (k)를 결정 후 먹이 시간 (t), (P)은 먹이 속도 또는 시간 당 한 물고기에 의해 먹 히는 paramecia의 수:
(6)
또는
(7)
참고: 그림 1, 2 h 인큐베이션 (t) 후 paramecia (N0) 당 박테리아의 초기 수량 790 CFU입니다. 영화 1 과 그림 2, 먹이 속도 (P) 1539입니다. - 이러한 값을 사용 하 여 방정식 (7)에, 다음으로 2 시간 보육 제 브라에서 세균성 복용량을 계산:
(8)
- 다음 수식을 사용 하 여 paramecia 내의 세균성 감퇴를 결정.
및
또는
또는
3. 음식을 통한 감염 Zebrafish의
- Paramecia와 박테리아를 품 어.
- Paramecia 및 대장균 MG1655의 공동 문화 감염 전에 밤을 준비 합니다. E3 미디어의 8 mL, 지속적인 paramecia 문화의 1 mL 및 대장균 MG1655 문화의 1 mL (OD600 = 1.0) 1에서 resuspended T25 조직 배양 플라스 크에 x E3. 하룻밤 실 온 (RT)에서 플라스 크를 품 어. 각 치료 상태에 대 한 paramecia의 2 개의 플라스 크를 준비 합니다.
- 세균성 성장 미디어 접종 (파운드: 1 g/L tryptone 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L NaCl) 박테리아의 전염 성 긴장, 접시에서 개별 세균성 식민지를 선택 하 여 사용 하 여 살 균 접종 루프. 37 ° C에 액체 문화를 품 어 고 하룻밤 분 (rpm) 당 110 회전에서 흔들어 둡니다.
참고: 개인 보호 장비 (실험실 코트와 장갑)을 착용 해야 하 고 전염 성 요원을 처리할 때 사용 해야 하는 biosafety 수준 2 시설. - 다음 날, 하룻밤 문화의 OD600 을 측정 합니다. 문화 미디어의 11 ml에서 resuspended 때 1의 OD600 달성 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다.
- Paramecia의 g 5 분, 각 플라스 크에 대 한 하나의 볼륨 x 6000에 원심 분리를 통해 단계 3.1.2에서에서 박테리아의 볼륨을 수확. 상쾌한 삭제 하 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.
- 필요에 따라 사전에 형광 염료와 박테리아 얼룩.
- FM 4 64FX 세균성 얼룩 (5 mg/mL 재고 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다. 커버 호 일 photobleaching에서 보호 하 고 회전 이상 끝 RT에서 15 분 동안 품 어 튜브.
- 1 세척 하 여 과잉 염료를 제거 x E3: 작은 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 1.5 분에서 다음 E3 미디어의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 두 번 세척 단계를 반복 합니다.
- 수확 스테인드 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 5 분 삭제에는 상쾌한 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.
- 신선한 paramecia의 두 개의 플라스 크의 각 세균 정지의 1 mL를 추가 합니다. 2 h RT에서 품 어.
참고: 얼룩진된 박테리아를 사용 하는 경우 2 시간에 대 한 실시간에 어둠 속에서 품 어.
- 워시 박테리아/paramecia 공동 문화입니다.
- 50 mL 원뿔 튜브에 paramecia/박테리아 공동 문화의 두 플라스 크의 내용을 결합 합니다. 10 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플은 원심이이 단계 전에 미리 냉각 있는지 확인 합니다.
- E3 상쾌한 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여의 약 10 mL을 제거 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3.
참고: 모든 세척 단계 동안 되려고 매우 빠른 상쾌한, 제거는 paramecia 펠 릿에서 수영 하기 시작 것입니다 필수적입니다. 회전 하 고이 단계에서 충분 한 빠른 처리를 위해 한 번에 하나의 튜브에서 상쾌한 제거는 상쾌한에 paramecia의 손실을 방지. - 5 분 약 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 e 3 상쾌한의 제거에 대 한 샘플 원심 분리를 통해 15 ° C에서 300 x g에서 회전 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- 5 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플 약 10 mL는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 E3 상쾌한의 제거.
- E3 미디어의 나머지 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관으로 현 탁 액의 500 µ L를 전송. Paramecia의 수를 계산 하는 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuging에 의해 paramecia의 500 µ L를 작은.
- 500 µ L 샘플에서 표면에 뜨는 E3의 400 µ L을 제거 합니다. Paramecia의 나머지 100 µ L를 36.5% 포름알데히드 용액의 20 µ L을 추가 하 고 부드럽게 resuspend, 및 22 ° c.에 5 분 동안 품 어
참고: 이 단계는 세 수 있도록 paramecia를 죽인다. - 피 펫 및 레코드를 사용 하 여 실제 총 볼륨을 측정 합니다. Paramecia 서 스 펜 션 1:1 v/v 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석.
- 사용 하 여 셀 또는 hemocytometer 죽은 paramecia/mL의 수를 계산 하.
참고: 사전 정착 단계 때문에 대부분 paramecia 죽은 시점에서, 하지만이 숫자는 라이브 paramecia 공동 배양 실험에 대 한 수를 반영. 저자가 여기 요인으로 무시 될 수 있다 그래서 세균성 공동 화, 때문에 중요 한 paramecia 죽음을 발견 하지 않았습니다.
- 공동 Paramecia 그리고 zebrafish 애벌레를 품 어.
- Paramecia의 농도 계산.
참고: 이 계산 단계의 3.2.5 50 mL 원뿔 튜브에 paramecia의 농도 제공합니다. - E 3의 3 mL의 최종 볼륨에서 2 x 105 paramecia/mL의 농도에 필요한 세척된 paramecia의 볼륨을 계산 합니다.
참고: Paramecia의 농도 최적화는 원하는 세균성 복용량에 따라 조정할 수 있습니다. - 제 브라 paramecia (계산 단계에서의 적절 한 농도 포함 하는 신선한 E3의 3 mL의 총 볼륨으로 6 잘 플레이트의 각 음에 100 mg/l. 전송 10 zebrafish의 최종 농도를 100 mM Tris pH 8.0에서에서 tricaine를 추가 하 여 anesthetize 3.3.2). 그들은 받는 사람 잘 마 취에서 회복 되도록 액체의 최소한에 애벌레를 전송 확인.
- 먹이 대 한 최적의 번개 조건 되도록 하루 빛 조건에서 일주 인큐베이터에 2 h 30 ° C에서 품 어.
- 워시 zebrafish 전송 물고기는 새로운 잘 포함 3 mL 신선한 E3 때마다 100 mg/L tricaine를 포함 하 여 5 회 이상.
참고: 세척 단계는 tricaine를 생략 하지 마십시오. 마 취 없이 모바일 애벌레 전송 손상 동물 조 난의 위험이 증가 합니다. - 선택적으로, 준비 zebrafish 이미징 블랙 벽 6 잘 플레이트에서 1% 낮은 용융 agarose의 3 ml에서 zebrafish를 포함 하 여: 낮은 용융 agarose 1xE3에서 구성 하 고 전자 레인지에서가 열. 일단 녹은, 160 mg/mL의 최종 농도에 tricaine를 추가 합니다. 잘린된 젤 팁, 머리는 왼쪽 꼬리에가 로드를 사용 하는 stereomicroscope에서 위치 생선은 오른쪽 (그림 3). Agarose 설정 하려면 5 분 기다립니다 다음 이미징 1 x E3 포함 160 mg/mL tricaine와 함께 포함 된 물고기를 오버레이 합니다.
- Paramecia의 농도 계산.
- 먹이 속도 결정 합니다.
참고: 아니 별도 실험 먹이 속도 결정 하도록 설정 해야 합니다. 오히려,이 해질 수 있다 단계 3.3.4, 아래 설명 된 대로.- 3.3.4 단계 먹이 zebrafish 먹이 캡처의 stereomicroscope 및 캡처 영상 볼.
- 점수는 영상. 먹이 캡처 먹이 향해 zebrafish의 눈에 띄는 특징 이다. 비록이 단지 근사 각 공격 한 먹이 캡처 이벤트로 계산 ( 내용참조).
- 각각 다른 zebrafish 애벌레 (그림 2)을 나타내는 여러 개의 비디오 클립에서 시간 당 먹이 캡처 이벤트의 평균 개수를 계산 합니다.
Representative Results
Paramecium caudatum 는 쉽게 저장 그들에 박테리아의 넓은 범위를 유입. 세포내 세균 밀도 박테리아 및 공동 문화, 사용 하는 세균 종에 있는 paramecia의 밀도에 따라 달라 집니다. 시간이 지나면서, 그들은 시 어 지 다 및 세균성 저하 ensues. 속도 저하의 사용 하는 모든 종자에 대 한 개별적으로 확인할 수 있다. 병원 성 대장균, 초기 세균 밀도 790 박테리아 /paramecium및 박테리아는 약 2.3 h (그림 1)의 반감기를 가진 타락 한.
그림 1: paramecia에 세균성 하프 라이프의 결정. (A) 다음 2 h 공동 보육의 전염 성 대장균, P. caudatum 와 세척 되었고 박테리아 없이 매체에 전송. 숫자 표시 시간 지점에서 가능한 대장균 의 세포 선택적 agar에 희석 도금에 의해 결정 되었다. 결과 의미의 평균 ± 표준 오차 (SEM, n = 3). Paramecium의 (B) 일반적인 이미지 내 면 밝은 필드 (Bi), 형광 박테리아 (Bii), 박테리아 및 채널 (Biii)를 병합. 눈금 막대 20 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
또한, zebrafish 먹이 속도, 즉, 어떤 zebrafish에 속도 internalize 공동 보육에 박테리아 로드 paramecia, 공부 했다. 비록 그것은 발견 했다, 애벌레의 개발 가속 30 ° C에서 발생 하 고 동물 먹이 행동 4 dpf에서 표시 애벌레 zebrafish 사냥 하 고 먹이 5 dpf20에서 캡처 시작 합니다. 먹이 행동20 (그림 2A), 눈에 띄는 특성과 먹이 비율의 결정은 가정을 기반으로 각 파업 한 paramecium의 국제화에 이르게이 간주만 수는 근사 ( 내용참조). Zebrafish 애벌레 먹이의 여기 설명 된 관측에 기초를 두어, paramecia 통풍 관 비율은 h (그림 2B) 당 약 1,539 이다.
그림 2: 제 브라 먹이 비율의 결정. (A) 표시는 제 브라 paramecia 형광 박테리아를 들고에 먹이 하는 유 충 (5 dpf) 먹이 비디오에서 스틸 이미지. [초] 시간입니다. 화살표는 눈에 띄는 하는 동안 운동의 주요 축을 나타냅니다. 먹이 속도 (시속 paramecia 섭취), 부 량 (B) n에 따라 = 10 동영상 전체 2 시간 노출 시간 점령. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Paramecia의 국제화, 다음에서 zebrafish 효율적으로 소화 시스템에 전염 성 박테리아를 방출 foregut에 먹이 저하 됩니다. 여기에 설명 된 대로 paramecia 저하 진행 신속 하 게, 그리고 무료 박테리아 먹이의 30 분 이내 창 자에서 검출 될 수 있다. 박테리아 무료 다음 이동은 foregut에서 중반-후부 및 내장 탐지는 먹이 (그림 3)의 시작 후 약 1-2 h. 소장에서 세균 지 종 및 복용량 범위에 따라 여러에서 E. coli 와 S. enterica몇 일. S. enterica localizes 일부 상피 침공 (그림 3D)과 장 거칠어에 주로 상피 (그림 3C)에 호 중구의 침투에 지도.
그림 3: 박테리아와 제 브라의 식민. Zebrafish 5 dpf에 감염 되지 않은 (A) 왼쪽 또는 mCherry (B) 대장균 또는 (C) S. enterica표현으로 식민지. 감염 실험 야생 타입 (A 와 B) 생선이 나 유전자 변형 라인에서 수행할 수 있습니다 (예를 들어, 라인 안내 (MPO::EGFP) 나114 (C)에 표시 된 녹색 형광 neutrophils 표현. 직장 여는 화살표가 표시 됩니다. 전체-마운트 포함된 애벌레 감염 된 살 모 넬 라 enterica 감염에서에서 장 섹션의 (D) 높은 확대. (디) 블루 Hoechst 핵, (Dii) 보라색 표시 = phalloidin (Diii) 레드 F 걸 표시 = = 살 모 넬 라, (Div) 병합. 눈금 막대 5 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 먹이 캡처 비디오 푸티지. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 기본 프로토콜 병원 성 대장균, 최적화 하 고 성공적으로 살 모 넬 라 enterica 등 비 브리 오 cholerae다른 세균 종에 대 한 적응 되었습니다. 다음 목욕 침수, 일부 살 모 넬 라 enterica 긴장 등 일부 anaerobes zebrafish 창 자 식민지 하지 않는 일부 종족에 대 한 식품을 매개로 감염 여기에 설명 된 대로 사용할 수 있습니다 성공적으로 식민지를 설립. 애벌레의 창 자에 높은 세균성 짐이 설정도, microgavage에 비해 식품을 매개로 감염 기술적으로 덜 도전 이며 덜 전문된 장비가 필요 합니다. 그러나, 세균성 종 및 긴장 사용할 수에 대 한 중요 한 매개 변수를 최적화 합니다. 이러한 요소가 포함 박테리아 paramecium 공동 문화 단계에 대 한 박테리아와 paramecium 밀도: paramecia 내의 세균 숫자 낮은 경우에,이 공동 문화 단계에서 세균 밀도 증가 시켜 향상 될 수. 일부 세균성 종 paramecium 호스트 손상 될 수 있습니다 그리고이 현미경 검사 법에 의해 평가 되어야 합니다.
이 프로토콜에서 또 다른 중요 한 요인은 제 브라 먹이 캡처입니다. 먹이 속도 여기에 설명 된 대로 모든 먹이 캡처 한 paramecium의 섭취에 결과 공격 하는 가정에 근거한 다. 물고기 당 paramecia의 높은 밀도 높은 먹이 속도 보장 하는 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 먹이 캡처 시스템에서 paramecia의 밀도에 따라 달라 집니다 그리고 매우 희석 paramecium 문화에서 먹이 요금 시간21,22당 13-15 paramecia로 낮은 수 있습니다. 한계는 먹이 캡처 속도 또한 조명 조건에 그리고 어둠 속에서 강하게 의존, 캡처 요금은 80% 낮은 조명 조건에서21 와이 해야 고려해 실험을 설정할 때 보다. 먹이에 노출 시간 최적화 식민 확장 될 경우, 고려 보조 노출 배설물을 통해 박테리아에 게 있다. -2 h 먹이 노출-위에서 설명한 조건 하에서이 노출 때문에 박테리아의 소화 관 통과 시간 1 시간 이상 차량에는 박테리아의 농도 배설물에 보다 훨씬 더, 이다. 그러나, 먹이 노출 시간이 크게 증가 하 고,이 중요 한 요소가 될 수 있습니다.
먹이 비 병원 성 대장균 을 포함 하는 paramecia와 다음 zebrafish의 식민지를 포함 하 여이 프로토콜에 적절 한 컨트롤을 포함 한다 MG1655. 여러 개의 세균성 긴장 zebrafish 호스트를 식민지로 그들의 능력에 대 한 비교 하는 경우 그것은 paramecia 내의 그들의 반감기는 여부를 테스트 하는 것이 중요. 세균성 돌연변이, 세포 벽 무결성 또는 산 감지, 타협 포함 paramecia 내의 세균 안정성 손상 시킬 수 있습니다. 이러한 경우, zebrafish 먹이 복용량에 차이 대 한 계정 조정 해야 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 세균성 식민지와 조직 homogenate3, zebrafish 당 CFU 여 뿐만 아니라, 위에서 설명한 대로 zebrafish의 세균성 식민을 이미징 하 여를 포함 하 여 그 결과 조사 하 수 또는 감염 관련 질병 률 및 사망률을 조사. 이상적으로, 세균의 시각화를 위한 mCherry 등 형광 단백질 또는 빨간색 형광 성 단백질 (RFP)를 표현 하는 세균성 긴장 사용 되어야 한다. 이 세균성 인구 성장의 시각화 수 있게 됩니다. 만약 세균성 긴장은 유전자 세공 또는 형광 단백질 식의 사용은 다른 이유로 배제, 박테리아 수 있습니다 얼룩이 질 FM 4-64FX, 같은 형광 염료와 paramecia와 공동 문화 사전. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 때 paramecia와 공동 문화는 염료의 밝기를 감소 하지 않습니다 고 얼룩진된 박테리아 zebrafish 내장에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 그러나, 염료 zebrafish 호스트 내에서 발생 하는 중요 한 세균 확산 해야 시간이 지남에 희석 될 것입니다. 두 경우 모두, 레드-형광 박테리아는 녹색 형광 박테리아에 바람직 조직 autofluorescence 빨강 채널에 보다 녹색으로 높은 될 수 있기 때문.
이 프로토콜에 대 한 적용할 수 있습니다 발견 되었습니다 에어로빅 microaerophilic 세균성 종. 이 실험적으로 시험 될 남아 있지만 포자와 균 종, 먹이 대 한 적응 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 원고에 중요 한 읽기 및 의견에 대 한 Krachler 그룹의 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 UT 시스템 스타 상, BBSRC, NIH (R01AI132354)에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
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