Sebrafisken (Danio rerio) blir en utbredda vertebrate djur modell för mikrobiell kolonisering och patogenes. Det här protokollet beskriver användningen av protozo Paramecium caudatum som ett fordon för livsmedelsburna infektioner hos zebrafiskar larver. P. caudatum lätt internaliserar bakterier och få tas upp av larval zebrafisk genom naturliga preying beteende.
På grund av sin öppenhet, genetiska tractability och enkelt underhåll, zebrafisk (Danio rerio) har blivit en allmänt använd ryggradsdjur modell för infektionssjukdomar. Larval zebrafiskar offer naturligt på den encelliga protozo Paramecium caudatum. Det här protokollet beskriver användningen av P. caudatum som ett fordon för livsmedelsburna infektioner i larval zebrafiskar. P. caudatum internalisera ett brett spektrum av bakterier och bakteriella celler förbli lönsamt i flera timmar. Zebrafiskar sedan offer på P. caudatum, bakteriehalten släpps i framtarmen vid matsmältningen av fordonets paramecium och bakterierna kolonisera tarmen. Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av paramecia underhåll, laddning med bakterier, bestämning av bakteriell nedbrytning och dosen, samt infektion av zebrafisk genom utfodring med paramecia. Fördelen med att använda denna metod för livsmedelsburna infektioner är att den nära härmar funktionsläget av infektion som observerats i mänskliga sjukdomar, leder till mer robust colonization jämfört med nedsänkning protokoll och tillåter studier av ett brett utbud av patogener. Livsmedelsburna infektioner i zebrafisk modellen kan användas för att undersöka bakteriell genuttryck inom host, host-patogen interaktioner och kännetecken för patogenicitet inklusive bakteriell börda, lokalisering, spridning och sjuklighet.
Zebrafiskar aktie morfologiskt och funktionellt bevarade funktioner med däggdjur, inklusive granulocytic härstamningar (t.ex. neutrofiler), monocyt/makrofag-liknande celler, Toll-liknande receptorer, pro-inflammatoriska cytokiner och antimikrobiella peptider1 . Tarmkanalen i zebrafisk är fullt utvecklad på 6 dagar efter befruktning (dpf) och visar morfologiska och funktionella bevarande med däggdjur magtarmkanalen, såsom bevarade Transkriptionsreglering i tarmepitelceller 2. Detta gör zebrafiskar en utmärkt modell för intestinal mikrobiell kolonisering och patogenes. Ett brett utbud av enteriska mikrober har undersökts i zebrafisk modellen, inklusive entrohemoragiska Escherichia coli3, Vibriocholerae4,5, Salmonella enterica6, den Zebrafiskar bakterieflora7,8, och rollen av probiotika i intestinal immunitet9. En klar fördel av zebrafisk modellen är att det är koloniserade av många mikrober utan att störa den endogena bakterieflora, vilket gör att utredningen av mikrobiell beteende i samband med blandade mikrobiella populationer3, 6. för närvarande, de flesta zebrafiskar modeller av gastrointestinala koloniseringen och sjukdom lita på administrationen av mikrober genom bad nedsänkning, där zebrafiskar inkuberas i en bakteriesuspension för en viss mängd tid10. Men detta gör det svårt att avgöra den exakta dosen av bakterier administreras, och leder till begränsad kolonisering med vissa mikrober, särskilt med icke-patogena bakterier. Alternativt en bakteriesuspension administreras för att fiska via oral sondmatning11, men detta är tekniskt utmanande och begränsad till äldre larver och vuxna fiskar.
Det här protokollet beskriver användningen av de encelliga protozo Paramecium caudatum som ett fordon för livsmedelsburna leverans av mikrober till mag-tarmkanalen av zebrafisk larver. Paramecia är lätta och billiga att underhålla och klarar av att mata på en mängd olika mikrober, alger, svampar och bakterier, som de internalisera genom en cilierade muntliga groove12,13,14. En gång internaliserat, bakterier hålls i vakuoler, bryts som så småningom syrsätt och innehåll över en tidsram på flera timmar15. Larval zebrafiskar fånga paramecia som naturliga bytesdjur snart efter kläckningen, omkring 3 – 4 dpf beroende på temperatur16, och ta upp dem med hög verkningsgrad. Processen för byte fånga tar på genomsnittet 1.2 s från upptäckt till fånga17, och fångade paramecia smälts snabbt i zebrafiskar framtarmen, sådan att internaliserade livskraftiga bakterier släpps ut i tarmkanalen3. Paramecia kan därför användas som en snabb och enkel metod för att leverera en hög och jämn dos av bakterier i mag-tarmkanalen av zebrafiskar. De levererade bakterierna kan antingen omvandlas för att uttrycka en fluorescerande protein, såsom mCherry som beskrivs här, eller, när det gäller genetiskt svårbehandlade bakterier, de kan vara pre färgas med ett fluorescerande färgämne att tillåta visualisering inom den mag-tarmkanalen.
Det här protokollet beskriver livsmedelsburna leverans av enteropathogenic E. coli (entrohemoragiska E. coli [EHEC] och vidhäftande invasiva E. coli [AIEC]), och Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Både patogena E. coli och S. typhimurium är överförda via den fekal-orala smittvägen18,19, och kan vara förvärvade via förorenade livsmedel, såsom kött, grönsaker och mejeriprodukter. Med P. caudatum som ett fordon, kolonisera E. coli och S. typhimurium framgångsrikt larvaena zebrafiskar inom 30 – 60 min samtidig inkubering med paramecium fordonet. Den uppnådda bakteriella bördan är tillräckligt robust för att visualisera koloniseringen och bestämma bördan av plätering vävnad homogenates.
Det grundläggande protokollet som beskrivs här har optimerats för patogena E. coli, och har framgångsrikt anpassats för andra bakteriearter, inklusive Salmonella enterica och Vibriocholerae. För vissa arter som inte kolonisera zebrafiskar tarmen efter bad nedsänkning, inklusive vissa Salmonella enterica stammar och vissa anaerober, kan livsmedelsburna infektioner som beskrivs här användas att framgångsrikt etablera colonization. Jämfört med microgavage, som också används för att fastställa höga bakteriell bördor i larval tarmkanalen, livsmedelsburna infektioner är tekniskt mindre utmanande och kräver mindre specialiserad utrustning. Kritiska parametrar bör dock optimeras för bakteriell arter och stammar skall användas. Sådana faktorer inkluderar bakteriell och paramecium densitet för bakterier-paramecium samtidig kultur steg: om bakteriell nummer inom paramecia är låg, detta kan förbättras genom att öka bakteriell tätheten i steget samtidig kultur. Vissa bakteriearter kan skada paramecium värden, och detta bör bedömas av mikroskopi.
En annan viktig faktor i detta protokoll är bytesdjur fånga av zebrafiskar. Andelen preying baseras som beskrivs här på antagandet att varje byte fånga strike resultat i intag av en paramecium. Höga tätheter av paramecia per fisk används i protokollet för att säkerställa hög preying priser. Dock byte capture är beroende av tätheten av paramecia i systemet, och i mycket utspädd paramecium kulturer, preying priser kan vara så låg som 13 – 15 paramecia per timme21,22. En begränsning är att byte bindningsandel är också starkt beroende på ljusförhållanden och i mörkret, bindningsandel är 80% lägre än i ljus21 och detta bör beaktas när du konfigurerar experiment. Om exponering gånger att offer måste utökas för att optimera koloniseringen, har hänsyn ges till sekundär exponering för bakterier genom avföring. De villkor som beskrivs ovan – 2 h byte exponering – är denna exponering försumbar, eftersom tarmen Passagetiden av bakterier är mer än 1 h och koncentrationen av bakterier i fordonet är mycket högre än i avföring. Dock om prey exponeringstiden ökas avsevärt, kan detta bli en betydande faktor.
Lämpliga kontroller bör ingå i detta protokoll, inklusive koloniseringen av zebrafisk efter utfodring med paramecia som innehåller icke-patogena E. coli MG1655. Om flera bakteriestammar jämförs för deras förmåga att kolonisera zebrafiskar värden, är det viktigt att testa om deras halveringstiden inom paramecia är jämförbara. Bakteriella mutationer, inklusive de äventyrar cellväggen integritet eller syra avkänning, kan äventyra bakteriell stabilitet inom paramecia. I sådana fall måste zebrafiskar utfodring justeras för skillnader i dosering.
Protokollet beskrivs här kan användas för att undersöka bakteriell kolonisation och dess konsekvenser, inklusive av imaging bakteriell kolonisering av zebrafiskar som beskrivits ovan samt att fastställa CFU per zebrafiskar från vävnad Homogenatet3, eller utredande-infektionsassocierad morbiditet och mortalitet. Idealiskt, för bakteriell visualisering, bakteriestammar som uttrycker fluorescerande proteiner såsom mCherry eller röd fluorescerande protein (RFP) bör användas. Detta gör att visualisering av växande bakterie befolkning. Om bakteriestam är inte genetiskt eftertraktansvärda eller användning av fluorescerande proteinuttryck hindras av andra skäl, kan bakterier färgas med ett fluorescerande färgämne, såsom FM 4-64FX, före samarbete kultur med paramecia. När du använder protokollet beskrivs här, samtidig kultur med paramecia minskar inte ljusstyrkan för färgen och färgade bakterier syns tydligt i zebrafiskar tarmen. Färgen kommer dock spädas över tid sker betydande bakteriell spridning inom zebrafiskar värden. I båda fallen är röd fluorescerande bakterier att föredra över grön fluorescerande bakterier, eftersom vävnad autofluorescens kan vara högre i gröna än i den röda kanalen.
Det har konstaterats att detta protokoll kan anpassas för aerob och namnet bakteriearter. Det kan vara möjligt att anpassa det för utfodring av sporer och svamp arter, även om detta återstår testas experimentellt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka medlemmarna i gruppen Krachler för kritiskt läsande och kommentarer på manuskriptet. Detta arbete finansierades av en UT system STAR award, BBSRC och NIH (R01AI132354).
Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
hemocytometer or cell counter | any | ||
stereomicroscope | any | ||
table-top centrifuge | |||
microwave | |||
rotator wheel | |||
heated shaking incubator | |||
aquatics facilities | |||
breeding tanks |