Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Merkel cel Polyomavirus infectie en detectie

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een protocol om te infecteren primaire menselijke dermale fibroblast met MCPyV. Het protocol bevat Isolatievan dermale fibroblasten, voorbereiding van MCPyV virionen, virusbesmetting, immunofluorescentie kleuring en fluorescentie in situ hybridisatie. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het karakteriseren van MCPyV-gastheer interacties en het ontdekken van andere celtypes ze door MCPyV.

Abstract

Merkel cel polyomavirus (MCPyV) infectie kan leiden tot Merkel cel carcinoom (MCC), een zeer agressieve vorm van huidkanker. Mechanistisch onderzoek te onderzoeken volledig MCPyV moleculaire biologie en oncogene mechanismen hebben belemmerd door een gebrek aan voldoende cel cultuur modellen. Hier beschrijven we een aantal protocollen voor het uitvoeren en het opsporen van MCPyV infectie van primaire menselijke huidcellen. De protocollen beschrijven het isolement van menselijke dermale fibroblasten, voorbereiding van recombinante MCPyV virionen, en detectie van virusinfectie door zowel immunefluorescentie (IF) kleuring en in situ DNA-hybridisatie kettingreactie (HCR), dat een uiterst gevoelige is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) benadering. De protocollen hierin kunnen worden aangepast door interesse onderzoekers om andere soorten cellen of cellijnen die ondersteuning bieden voor MCPyV infectie te identificeren. De beschreven aanpak van de vis kan ook worden aangepast voor het opsporen van lage niveaus van virale Ani aanwezig in de besmette menselijke huid.

Introduction

Merkel cel polyomavirus (MCPyV) is een kleine, double-stranded DNA-virus dat is gekoppeld aan een zeldzame maar agressief huidkanker, Merkel cel carcinoom (MCC)1,2. Het sterftecijfer van MCC, ongeveer 33% hoger dan die van melanoom3,4. MCPyV heeft een circulaire genoom van ~ 5 kb1,5 doorsneden door een niet-coderende regelgevende regio (NCRR) in het vroeg en laat codering gebieden1. De NCRR bevat de virale oorsprong van replicatie (Ori) en bidirectionele promotoren voor virale transcriptie6,7. De vroege regio codeert tumor antigeen proteïnen genaamd grote T (LT), kleine T (sT), 57kT, alternatieve LT ORF (ALTO), evenals een autoregulatory miRNA1,8,9,10. De late regio codeert de Eiwitmantel eiwitten VP1 en VP211,12,13. LT sT de best bestudeerde MCPyV eiwitten en zijn ter ondersteuning van de virale DNA replicatie en MCPyV-geïnduceerde tumorvorming5is gebleken. Klonen integratie van MCPyV DNA in het genoom van de host, die tot 80% van MCCs oedeem is waargenomen, is waarschijnlijk een oorzakelijke factor voor virus-positieve tumor ontwikkeling14,15.

De incidentie van MCC heeft verdrievoudigd in de afgelopen twintig jaar16. Asymptomatische infectie van de MCPyV is ook wijdverbreid in de algemene bevolking17,18,19. Met het toenemende aantal MCC diagnoses en de hoge prevalentie van MCPyV infectie is er behoefte aan een betere ons begrip van het virus en zijn potentieel oncogene. Toch blijven veel aspecten van MCPyV biologie en oncogene mechanismen slecht begrepen20. Dit is vooral omdat MCPyV gerepliceerd slecht in gevestigde cel lijnen11,12,21,22,23 en, tot voor kort huidcellen beeldschermresolutie ondersteunen MCPyV infectie had niet ontdekt22. Mechanistisch onderzoek te onderzoeken volledig MCPyV en zijn interactie met de gastheer cellen hebben belemmerd door een gebrek aan celcultuur voor vermeerdering van het virus-5.

We ontdekten dat de primaire menselijke dermale fibroblasten (HDFs) geïsoleerd van neonatale menselijke voorhuid ondersteuning robuuste MCPyV infectie beide in vitro en ex vivo24. Uit deze studie vastgesteld we het eerste model van het infectie van de cultuur van de cel voor MCPyV24. Voortbouwend op dit modelsysteem, toonden we dat de inductie van matrix metalloproteinase (MMP) genen door de WNT/β-catenine signalering traject en andere factoren die de groei MCPyV infectie stimuleert. Bovendien, we vonden dat de FDA-goedgekeurde MEK antagonist trametinib effectief MCPyV infectie5,25 remt. Uit deze studies vastgesteld wij een verzameling protocollen voor het isoleren van de menselijke dermale fibroblasten24,25, voorbereiding MCPyV virionen11,12, MCPyV infectie wilt uitvoeren op menselijke dermale fibroblasten 24 , 25 en detectie MCPyV eiwitten door als kleuring26. Bovendien, aangepast we de in situ DNA hybridisatie kettingreactie (HCR) technologie27 voor de ontwikkeling van een hooggevoelige vis techniek (HCR-DNA vis) voor het opsporen van MCPyV DNA in besmette menselijke huidcellen. Deze nieuwe methoden zijn nuttig voor het bestuderen van de besmettelijke cyclus van MCPyV, alsmede de cellulaire respons op MCPyV infectie. De natuurlijke gastheer reservoir cellen die MCPyV infecties te handhaven en de cellen die aanleiding tot MCC tumoren geven blijven onbekend. De technieken die we in dit manuscript beschrijven kon worden toegepast om te onderzoeken van de verschillende soorten menselijke cellen zowel de cellen van het reservoir worden geïdentificeerd en de oorsprong van MCC tumoren. Onze gevestigde methoden, zoals het Hoge Commissariaat voor vluchtelingen-DNA vis, kunnen ook worden gebruikt in de opsporing van andere DNA tumor virussen en de karakterisatie van gastheer cel interacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menselijke neonatale foreskins werden verkregen uit Penn huid ziekte Research Center. Volwassen menselijke fibroblasten werden verkregen uit afgedankte normale huid na de operatie. Alle protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania institutionele Review Board.

1. isolatie van menselijke dermale fibroblasten

  1. Gebruik een paar van schaar te knippen uit vet en onderhuids weefsel van de menselijke neonatale voorhuid en het monster van de huid in helften of kwarten gesneden.
  2. Incubeer het weefsel in 5 mL 10 mg/mL dispase II in PBS aangevuld met antibioticum-antimycotic bij 4 ° C's nachts.
  3. In een steriele 10 cm schotel, zorgvuldig de opperhuid van de huidlagen met behulp van microdissection pincet te scheiden.
  4. Overdracht van de resulterende dermale weefsel aan een conische tube van 15 mL met 5 mL 2 mg/mL collagenase type IV in FBS-gratis medium aangevuld met antibioticum-antimycotic.
  5. Incubeer het monster bij 37 ° C in 5% CO2 voor 4-6 h met periodieke schudden tot slechts een paar macroscopische weefsel aggregaten blijven.
  6. Laat enkele cellen uit de dermis door pipetteren krachtig op en neer (triturating) tien keer met een pipet 10 mL.
  7. Centrifugeer bij 180 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  8. Plaat van de gedissocieerde cellen in DMEM medium aangevuld met 1%, 10% foetaal kalfsserum en 1% niet-essentiële aminozuren L-glutamine bij 37 ° C in 5% CO2.

2. recombinant MCPyV virion voorbereiding

  1. Digest 50 µg pR17b plasmide (uitvoering MCPyV genoom) met 250 U van BamHI-HF in een volume van 200 µL (4 uur bij 37 ° C) te scheiden van het virale genoom van de vector-backbone (Figuur 2).
  2. Voeg 1200 µL van buffer PB (aangevuld met 10 µL van 3 M NaAc, pH 5.2) tot het DNA dat verteerd en te zuiveren van meer dan 2 miniprep spin kolommen (20 µg DNA capaciteit). Elueer de plasmide verteerd pR17b van elke kolom met 200 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Bereiden de afbinding reactie in een centrifugebuis 50 mL. Voeg 400 µL van gezuiverde plasmide DNA uit stap 2.2, 8.6 milliliters 1.05 x T4 ligase buffer en 6 µL van hoge concentratie T4 ligase. Incubeer bij 16 ° C's nachts.
  4. 45 mL buffer PB (aangevuld met 10 µL van 3 M NaAc, pH 5.2) toevoegen aan de afbinding en gebruik een vacuüm variëteit te laden via 2 miniprep spin kolommen. Elueer elke kolom met 50 µL van TE buffer. Verwacht een rendement van ongeveer 30 µg van DNA.
  5. In de late middag/avond, zaad 6 x 106 293TT28 cellen in een 10 cm schotel met DMEM medium aangevuld met 1%, 10% foetaal kalfsserum en 1% niet-essentiële aminozuren L-glutamine zonder hygromycin B.
  6. De volgende ochtend, zorgen dat de cellen ongeveer 50% confluent. Transfect met behulp van 66 µL van transfectiereagens (1.1 µL/cm2), 12 µg opnieuw ligaturen MCPyV isoleren R17b DNA uit stap 2.4, 8.4 µg ST expressie plasmide pMtB en 9.6 µg LT expressie plasmide pADL *29.
  7. Wanneer de transfected cellen bijna confluente, de volgende dag, trypsinize van de cellen en deze overbrengen naar een 15 cm schotel voor verdere groei.
  8. Desgewenst nemen van een klein aantal 293TT cellen op uitbreiding en uitvoeren als de kleuring voor MCPyV LT (CM2B4) en VP1 (MCV VP1 konijn30) om te bepalen van de transfectie efficiëntie. In dit stadium, zal nucleaire LT signaal mogelijk zichtbaar VP1 expressie waarschijnlijk echter niet waarneembaar.
  9. Wanneer de 15 cm schotel wordt bijna heuvels (meestal 5-6 dagen na de eerste transfectie), breng de cellen in drie 15 cm schotels. Oogst de cellen van de 15 cm schotels als ze bijna confluente worden en volg het virus oogst protocol hieronder.
    Opmerking: Voer desgewenst kwaliteitscontrole als zoals beschreven in stap 2.8. Allermeest naar de cellen moeten zowel de MCPyV LT en de VP1 positief in dit stadium.
  10. Het verkrijgen van het virus, trypsinize cellen, bij 180 x g gedurende 5 min op RT draaien en verwijder de bovendrijvende substantie. Toevoegen van één cel pellet volume van DPBS-Mg (DPBS met 9.5 mM MgCl2 en 1 x antibiotica-antimycotic). Voeg vervolgens 25 mM ammoniumsulfaat (vanaf een 1 M pH 9 stockoplossing) gevolgd door 0,5% Triton X-100 (van een 10% stockoplossing), 0.1% Benzonase en 0,1% van een ATP-afhankelijke DNase. Meng goed en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
  11. Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten op ijs en voeg vervolgens 0,17 volume van 5 M NaCl. Meng en incubeer op ijs voor een ander 15 min. Spin voor 10 min op 12.000 x g in een centrifuge 4 ° C. Als het supernatant niet duidelijk is, voorzichtig omkeren van de buis en herhaal de draaiende stap. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis.
  12. Resuspendeer de pellet met een volume van DPBS aangevuld met 0.8 M NaCl, en spin opnieuw, zoals beschreven in stap 2.11.
  13. Combineer het supernatant van de stap 2.11 en 2.12, en nog een keer zoals beschreven in stap 2.11 spin.
  14. Giet gradiënten van iodixanol in dunne wand 5 mL polyallomer buizen door onderliggende (27%, dan 33%, dan 39%) ~0.7 mL stappen met behulp van een spuit met 3 mL is voorzien van een lange naald of een pipet p1000.
  15. 3 mL geklaarde virus-bevattende supernatant op het verloop van de voorbereide iodixanol laden.
  16. Spin gedurende 3,5 uur bij 234,000 x g en 16 ° C in de rotor van een SW55ti. Stel de versnelling en vertraging te vertragen.
  17. Na ultracentrifugatie, verzamelen 12 breuken in gesiliconiseerd buizen (elk deel is ~ 400 µL).
  18. Analyseren van de fracties voor de aanwezigheid van virus door dsDNA reagens en/of westelijke vlek voor VP1 (MCV VP1 konijn30). Zwembad kleurovergang breuken met piek dsDNA en/of VP1 inhoud en karakteriseren van de voorraad door kwantitatieve PCR voor de berekening van het virale genoom gelijkwaardig31. Opslaan MCPyV virion voorraad bij-80 ° C.

3. infectie

  1. Handhaven van primaire menselijke dermale fibroblasten in DMEM met 1%, 10% foetaal kalfsserum en 1% niet-essentiële aminozuren L-glutamine. Bij het bereiken van samenvloeiing, splitsen fibroblasten 1:4 zonder spinnen neer.
    Opmerking: Gebruik voor hoogste MCPyV infectie efficiëntie, primaire fibroblasten tussen 5 en 12 die actief op het moment van plating delen passages.
  2. Om te infecteren de menselijke dermale fibroblasten, gecombineerd het medium en wassen van de cellen met DPBS.
  3. Voeg vervolgens 1 mL van 0,05% trypsine-EDTA aan de schotel en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
  4. Kijk onder de Microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen zijn afkomstig uit de schotel.
  5. Voeg 10 mL van DMEM/F12 medium met 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF en 3 µM CHIR99021, die allemaal stimuleren MCPyV infectie24, tot de schotel en breng de oplossing van de cel in een tube van 15 mL.
  6. Spin down de cellen bij 180 x g gedurende 2 min, en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in de DMEM/F12 medium met 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF en 3µM CHIR99021 op 2-4 x 104 cellen per mL.
  7. Beënt 200 µL van de celsuspensie aangevuld met 1 mg/mL collagenase type IV in ieder putje van een 96-wells-plaat. Ontdooi MCPyV virion voorraad op ijs. Voeg toe 109 virale genoom equivalenten van MCPyV virionen (berekend in stap 2.18) per 1 µL van iodixanol voor elke 2500 tot 5000-cellen geïnfecteerd.   Tik zachtjes op de kant van de plaat en plaats van de plaat in de incubator.
  8. Na incubatie bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 48-72 uur, Voeg 20% FBS aan elk putje.
  9. Toestaan dat de infectie te gaan bij 37 ° C in 5% CO2 72-96 uur.

4. immunefluorescentie kleuring

  1. Fix cellen verkregen in stap 3.9 met 3% paraformaldehyde in PBS voor 20 min.
  2. De cellen met PBS tweemaal wassen.
  3. Incubeer de cellen in blokkeren/permeabilization buffer (0,5% Triton X-100, 3% BSA in PBS gefilterd door 0,22 µm filter) op RT gedurende 1 uur.
  4. Incubeer de cellen met de volgende primaire antilichamen: muis monoklonaal anti-MCPyV LT (CM2B4) (1:1000) en konijn polyklonale anti-MCPyV VP1 antilichaam (1:2000), op RT gedurende 3 uur.
  5. Spoel de cellen met PBS driemaal.
  6. Incubeer de cellen met de secundaire antilichamen: Fluor 594 geit-antimuis IgG (1:1000) en Fluor 488 geit anti-konijn IgG (1:500) op RT gedurende 1 uur.
  7. Spoel de cellen met PBS driemaal.
  8. Counterstain van de cellen met 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride).
  9. Mount coverslips op glas dia's en analyseren met behulp van een omgekeerde fluorescentie Microscoop.

5. ter plaatse DNA-Hoge Commissariaat voor vluchtelingen

Opmerking: Deze techniek vereist dat cellen worden overgeënt op coverslips. Voor dit doel, kunnen de infectie voorwaarden beschreven (stap 3) worden opgeschaald naar de 24-well plaat-indeling.

  1. Repareren van cellen gekweekt op coverslips met 4% PFA in PBS voor 10 min. Wash de coverslips twee keer met PBS, vervolgens behandelen met 70% ethanol tot de permeabilize van de cellen bij 4 ° C's nachts.
    Opmerking: Vaste monsters kunnen in deze toestand blijft voor enkele dagen.
  2. Vooraf het vermengen van monsters door de ethanol vervangen door sonde hybridisatie buffer en incubatie gedurende 60 minuten op RT.
  3. De probe(s) (1 µM) verdunnen (tabel 1) in de kruising van de sonde buffer oplossing bij 1:500 verdunning 30 minuten vóór het einde van de pre kruising stap en Incubeer bij 45 ° C.
  4. Pipetteer aan het einde van de incubations, ~ 10 μl van het mengsel verdunde sonde per dekglaasje aan op Microscoop dia's. Place de coverslips, cel-zijde naar beneden, op hun respectieve druppels van hybridisatie sonde mengen. Het zegel van de randen en de rug van de coverslips op de dia's met een liberale bedrag van rubber-cement.
  5. Verwarm de dia's met toegevoegde sondes bij 94 ° C gedurende 3 minuten door het instellen van de dia's op de platte kant van een warmte-blok. De dia's overbrengen in een bevochtigde kamer en na een nacht bebroeden bij 45 ° C. Om een eenvoudige bevochtigde kamer, licht temperen steriele papieren handdoeken met dH2O en plaats in de onderkant van een plastic container dat de zeehonden met een rubberen afdichting.
    Opmerking: Tijdens de verwarming van het rubber-cement kan bubble kort. Er echter voor zorgen dat het zegel niet breekt.
  6. Zorgvuldig schil weg de rubber-cement met een tang en plaats de coverslips cel-kant omhoog terug in putjes van de plaat van een 24-well. Spoel de coverslips met de sonde was buffer op RT driemaal.
  7. Incubeer het dekglaasje aan in de buffer (200 µL in 24-Wells-platen) van de versterking op RT 30-60 min.
  8. Ondertussen, het ontharden van elk van de twee gelabelde oligonucleotide haarspelden herkennen de sondes (tabel 1) in aparte PCR buizen door verhitting tot 94 ° C gedurende 90 s en koeling aan RT gedurende 30 minuten terwijl het beschermt tegen licht. Meng de twee haarspelden in versterking buffer, elk bij een verdunning 1:50.
  9. Maak een oppervlak voor de versterking-reactie door paraffine film uit te rekken over de open gezicht van een 24-well plaat deksel. Pipeteer 50-100 µL druppels van het mengsel van de buffer haarspeld/versterking op de paraffine film voor elke dekglaasje aan. Pincet gebruiken om zorgvuldig de coverslips van de versterking van de pre-oplossing. Droog het dekglaasje aan door het aanraken van de rand om een poreuze disposable doekje, en plaats neer cel-kant op de amplificatie druppel.
  10. Plaats het deksel van de plaat houden de coverslips in een bevochtigde kamer en na een nacht bebroeden bij RT in het donker.
  11. Ga nogmaals de coverslips terug naar putten. Incubeer de monsters met 5 x SSCT [5 x natriumchloride Natriumcitraat (SSC) 0,1% Tween 20 gefilterd door een 0,22 µm filter] de monsters tweemaal met 5 met 0,5 µg/mL DAPI gedurende 1 uur op RT. wassen x SSCT op RT.
  12. De coverslips op Microscoop-dia's koppelen. Analyseren van de cellen en het beeld van de monsters met behulp van een omgekeerde fluorescentie Microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol beschreven in dit manuscript toegestaan isolatie van een bijna homogene populatie van HDFs (Figuur 1). Zoals aangetoond door immunefluorescentie kleuring, bijna 100% van de menselijke huid cellen geïsoleerd met behulp van de in dit protocol beschreven omstandigheden positief waren gekleurd voor dermale fibroblast markeringen, vimentin en collageen ik24, maar negatief voor menselijke voorhuid Keratinocyt marker K14 (Figuur 1). Figuur 2 toont het proces van het genereren van MCPyV virionen met behulp van recombinant MCPyV genoom en een monster van het virion na concentratie van de ultracentrifuge. Na het visualiseren van de band van MCPyV virionen geconcentreerd in de kern van het verloop (gemarkeerd met een pijl in Figuur 2B), 500 µL breuken werden verzameld en MCPyV qPCR werd uitgevoerd ter identificatie van de piek breuken. Een voorbeeld van de qPCR analyse-gegevens wordt weergegeven in Figuur 2C. In sommige andere experimenten, waren de monsters ook geanalyseerd met het westelijke bevlekken met behulp van een konijn-anti-MCPyV VLP antilichaam (aanvullende figuur 1). Figuur 3 toont immunefluorescentie gekleurde beelden van HDFs geïnfecteerd met MCPyV. Om handmatig kwantificeren positieve cellen, we ten minste drie willekeurige weergaven van ongeveer 300 cellen geteld. Wij beschouwen de cellen die LT positieve, VP1 positieve, of zowel LT en VP1 positieve als positief voor MCPyV infectie. In de experimenten afgebeeld in Figuur 3, meer dan 30% van de cellen zijn LT positieve en meer dan 10% zijn VP1 positief. Het MCPyV genoom gerepliceerd in de geïnfecteerde cellen werden waargenomen met behulp van zowel de UNHCR-DNA vis (Figuur 4A) en de Immunofluorescent-Hoge Commissariaat voor vluchtelingen-DNA vis (Figuur 4B). Terwijl het Hoge Commissariaat voor vluchtelingen-DNA vis onthult de lokalisatie van MCPyV DNA aanwezig in de replicatie fabriek (foci) in Figuur 4A, de methoden van de Immunofluorescent-Hoge Commissariaat voor vluchtelingen-DNA vis maakt de gelijktijdige ontdekking van MCPyV DNA zowel LT eiwit mede lokaliseren Hiermee centreert u de replicatie (Figuur 4B). De beelden van de vis immunefluorescentie-Hoge Commissariaat voor vluchtelingen-DNA aangetoond dat deze techniek kan worden gebruikt om onthullen co lokalisatie van viraal DNA en de bijbehorende virale eiwitten.

Figure 1
Figuur 1 . Menselijke dermale fibroblasten geïsoleerd van neonatale menselijke voorhuid. Menselijke huid cellen gekweekt in DMEM/F12 medium aangevuld met 10% FBS werden gekleurd met antilichamen tegen vimentin, collageen I, of keratine 14 (K14). De cellen waren ook counterstained met DAPI. Bar, 50 µm. Dit cijfer werd aangepast uit Figuur S2 van Liu et al., 201624. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Productie van MCPyV virion met behulp van recombinant virale genoom. (A) A plasmide kaart van pR17b (MCPyV genoom plasmide). (B) een representatief beeld van een MCPyV virion monster geoogst en gezuiverd over een verloop. Pijl markeert de band van MCPyV virionen geconcentreerd in de kern van het verloop. (C) het virale genoom exemplaar nummer in elke kleurovergang Fractie werd gekwantificeerd aan de hand van qPCR. Core kleurovergang breuken (cijfers, geteld vanaf de bovenkant van de helling, worden aangegeven aan de onderkant van de grafiek). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.) drie technische herhalingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Menselijke dermale fibroblasten ondersteuning van robuuste MCPyV infectie, transcriptie en replicatie. Dermale fibroblasten geïsoleerd van menselijke huid werden behandeld met MCPyV virionen in DMEM F12 middellange met EGF, bFGF, CHIR99021 en collagenase IV voor twee dagen. Na het omzetten in verse DMEM/F12 medium met 20% FBS voor drie dagen, cellen waren immuno-gekleurd met de aangegeven antilichamen en counterstained met DAPI. Veel van de cellen niet alleen zeer zou hebben verkondigd LT en VP1 maar ook robuuste MCPyV replicatie foci. Dit cijfer werd aangepast van Figuur 3 van Liu et al., 201624. Schaal bar, 50 m. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Detectie van MCPyV in de geïnfecteerde cellen met behulp van vis technieken. (A) menselijke dermale cellen gekweekt in DMEM/F12 met EGF, bFGF, CHIR99021 en collagenase type IV werden behandeld met MCPyV voor 2 dagen. Na het veranderen van verse DMEM/F12 met FBS voor 3 dagen, werden de cellen onderworpen aan UNHCR-DNA FISH analyse. De cellen waren ook counterstained met DAPI. (B) menselijke dermale cellen gekweekt in medium met EGF, bFGF, en CHIR99021 werden beide onbehandeld (Mock) of (Infected) behandeld met MCPyV, zoals beschreven in (A). De cellen werden onderworpen aan immuno-vis met behulp van LT antilichaam en MCPyV-specifieke DNA sondes voor counterstaining met DAPI. HPV16 sondes werden gebruikt als een negatieve controle. Schaal bar, 10 m. Dit cijfer werd aangepast van Figuur 4 van Liu et al., 201624. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De naam van de sonde Sequenties
MCPyV sonde 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabel 1: Sondes gebruikt in de studie.

Supplemental Figure 1
Aanvullende figuur 1. Iodixanol verloop breuken screening voor MCPyV VP1. MCPyV-geïnfecteerde cellen werden lysed en onderworpen aan Iodixanol kleurovergang fractionering. Kern kleurovergang breuken (cijfers, geteld vanaf de onderkant van het verloop in dit experiment, zijn aangegeven bij de bovenkant van de figuur) werden onderworpen aan westelijke vlekkenanalyse VP1 detecteren. 10 µL monsters van elke fractie waren aangepast op 1 x laden kleurstof met een 5%-eindconcentratie van 2-mercaptoethanol en kort verhit tot 65 ° C. De monsters werden gescheiden op een 4-12% BIB-Tris gel en wiste op nitrocellulose. Westelijke bevlekken werd uitgevoerd in TBST met nonfat droge melk met behulp van een konijn-anti-MCPyV VLP antiserum verdund 1:5000. De antiserum is beschikbaar op aanvraag. De 50 kDa standaard (die ook migreert naar de 47 kDa MCPyV VP1 monomeer) wordt gemarkeerd met een sterretje. In de getoonde afbeelding, vermindering van de steekproef was onvolledig en bisulfide-verbonden VP1 multimeren zijn duidelijk zichtbaar. Gebruik van dithiothreitol en/of hogere denaturatie temperaturen kan leiden tot meer volledige reductie tot de VP1 monomeer soorten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methoden die hierboven beschreven, met inbegrip van isolatie van dermale fibroblasten van menselijke huidweefsel, voorbereiding van recombinante MCPyV virionen, infectie van gekweekte cellen, immunefluorescentie kleuring en een gevoelige vis methode aangepast van HCR technologie, die onderzoekers te analyseren MCPyV infectie27in staat moeten stellen. Een van de meest kritische stappen tot de verwezenlijking van de in vitro MCPyV-infectie is de productie van hoge-titer virion preparaten. Met behulp van het protocol voor bereiding van recombinante MCPyV virionen hier beschreven, bereiken we virale titers van 1012 genoom exemplaren per mL idoxanol oplosmiddel11,12. Deze high-titer MCPyV preparaten stond ons toe om te identificeren HDFs als de enige primaire huid celtype tot nu toe dat verschijnt ter ondersteuning van de volledige MCPyV-infectie cyclus24.

Isoleren van verse menselijke dermale fibroblasten via het protocol beschreven in dit manuscript heeft ons in staat om te bepalen de kwaliteit van de cellen die worden gebruikt in MCPyV infectie experimenteren en samenhang van de bevindingen in het geheel van cellen van verschillende patiënten monsters geïsoleerd. Alle menselijke dermale fibroblasten geïsoleerd van neonatale huid beoordeeld moeten worden voor de aanwezigheid van MCPyV DNA door qPCR zodat er geen MCPyV besmetting vóór de behandeling met recombinant MCPyV virionen. Met het oog op een infectie van de maximumefficiency-MCPyV, is het cruciaal voor het gebruik van menselijke dermale fibroblasten geïsoleerd vers van neonatale menselijke voorhuid aangezien hogere passage fibroblasten lagere MCPyV infectie efficiëntie ondersteunt. Verder, als geïsoleerde parallel van volwassen huid monsters, fibroblasten van neonatale huid monsters ondersteund veel hogere MCPyV infectie efficiëntie24. We hebben nooit getest verkrijgbare cellen voor infectie van de MCPyV. Wij zien echter geen specifieke reden die commercieel geïsoleerd fibroblasten moet inferieur anders dan als zij hoger passage op het punt van bevriezen.

Het protocol beschreven hier dermale fibroblasten van andere dieren te isoleren, hebben we ook gebruikt. Bijvoorbeeld, zijn wij gewend het protocol met succes isoleren dermale fibroblasten van muis (Mus musculus), rat (Rattus norvegicus), boom shrew (Tupaia Belangeri) en rhesus makaken (Macaca mulatta)25. Zoals opgemerkt in menselijke cellen, fibroblasten geïsoleerd van jongere chimpansees toegestaan veel efficiënter MCPyV infectie in vergelijking met de oudere dieren25.

Vergeleken met traditionele vis, is HCR-DNA vis een eenvoudige, maar zeer gevoelige methode voor de detectie van virale genoom24,27. Centra van MCPyV replicatie kunnen gemakkelijk worden opgespoord in de kernen van geïnfecteerde cellen als zeer specifieke punctate foci, met weinig tot geen achtergrond signaal gedetecteerd in de dezelfde degustaties neiging met een HPV specifieke sonde (Figuur 4)24. De aanpak kon in de toekomst dus worden onderzocht om te detecteren van lage-overvloed MCPyV DNA aanwezig in besmette menselijke huid. Het kan ook worden aangepast aan andere DNA-virussen te controleren. Wanneer gecombineerd met immunefluorescentie kleuring, biedt de immuno-vis een krachtige methode om tegelijkertijd detectie van viraal DNA en virale gecodeerde eiwit of host eiwitten aanwezig zijn in dezelfde cellen (Figuur 4). Voor het verkrijgen van de optimale resultaten met behulp van de protocollen beschreven hier, is het het beste te gebruiken vers vaste monsters voor immunefluorescentie kleuring en vis van de UNHCR-DNA-analyse. Voor de UNHCR-DNA FISH-analyse, moeten de sondes en versterker worden opgeslagen in-80 ° C in kleine porties om te voorkomen dat herhaald bevriezen en ontdooien.

Met behulp van de cultuur van de cel van het HDF en MCPyV infectie protocol, verkenden we de cel groei voorwaarden die best MCPyV binnenkomst, transcriptie, en replicatie in HDFs ondersteunen. We hebben ontdekt dat behandeling van HDFs met groeifactoren, zoals EGF, bFGF en stimulatie van de signalering WNT aanzienlijk MCPyV-infectie bevorderen. Gen expressie profilering, blijkt dat, na stimulatie met deze groeifactoren en activering van de WNT signalering traject, krachtig meerdere genen van de matrix metalloproteinase (MMP) familie, met inbegrip van MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 en 13, werden opgewekt. Omdat deze MMP-enzymen geschikt zijn voor vernederende extracellulaire matrix eiwitten, reden wij dat ze MCPyV infectie stimuleren kunnen door het verstoren van de extracellulaire matrix van de cellen van de gastheer. Inderdaad, behandelen HDFs met collagenase type IV, een lid van de familie MMP krachtig stimuleert MCPyV infectie (Figuur 3)24. Wij ook een matrix van stoffen, met inbegrip van verscheidene FDA-goedgekeurde kinase-remmers, voor remmende effect op MCPyV infectie gescreend. We hebben ontdekt dat trametinib, een MEK1 en MEK2-remmer, dramatisch remt MCPyV infectie24. Anderen kunnen gebruiken of wijzigen deze infectie systeem als een drug discovery platform voor MCPyV-remmers die de MCPyV virale lading bij immuungecompromitteerde patiënten verminderen.

Kortom bieden deze protocollen voor het bereiken van zeer efficiënte MCPyV infectie een platform voor het ophelderen van de slecht begrepen MCPyV besmettelijke fiets- en MCPyV-geïnduceerde oncogene mechanismen in het kader van virale infectie. Deze set van protocollen kan worden toegepast in toekomstige studies om extra MCPyV-tolerante menselijke celtypen, en de oorspronkelijke cellen van MCC, in welke incidentele MCPyV infectie tot de ontwikkeling van de tumor leiden kan te verkennen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Instituut) en Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) voor het verstrekken van reagentia en technische ondersteuning. Wij danken ook de leden van onze laboratoria voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies (R01CA187718, R01CA148768 en R01CA142723), de NCI Cancer Center ondersteuning subsidie (NCI P30 CA016520) en de Penn BVERRE award (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

Immunologie en infecties probleem 144 Merkel cel polyomavirus isolatie dermale fibroblasten infectie collagenase IV CHIR99021 immunefluorescentie kleuring fluorescentie in situ hybridisatie in situ DNA-hybridisatie kettingreactie transcriptie replicatie
Merkel cel Polyomavirus infectie en detectie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter