Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Merkel Hücresi Polyomavirus enfeksiyon ve algılama

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Burada, MCPyV ile birincil insan dermal fibroblast bulaştırmak için bir protokol mevcut. Protokol dermal fibroblastlar izolasyonu, MCPyV virions, virüs enfeksiyonu, ayirt boyama ve floresan hazırlanması in situ hibridizasyon içerir. Bu iletişim kuralı tarafından MCPyV MCPyV ana bilgisayar etkileşimleri karakterize ve diğer hücre tipleri infectable keşfetmek için genişletilebilir.

Abstract

Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) enfeksiyon Merkel Hücresi Karsinomu (MCC), cilt kanseri son derece saldırgan bir tür için yol açabilir. MCPyV moleküler biyoloji ve oncogenic mekanizmaları tam olarak araştırmak için mekanik çalışmaları yeterli hücre kültür modellerin eksikliği tarafından engel olmuştur. Burada, biz gerçekleştirmek ve birincil insan deri hücrelerinin MCPyV enfeksiyon tespit iletişim kuralları kümesi tanımlamak. İletişim kuralları insan dermal fibroblastlar, izolasyonu rekombinant MCPyV virions hazırlanması ve virüs enfeksiyonu tespiti immünfloresan (Eğer) boyama ve in situ olarak DNA hibridizasyon son derece hassas olan zincirleme (HCR), tarafından tarif floresans in situ hibridizasyon (balık) yaklaşım. İletişim kuralları burada baktılar araştırmacılar tarafından diğer hücre tipleri veya MCPyV enfeksiyon destek hücre satırları tanımlamak için adapte edilebilir. Tarif Balık yaklaşım da viral DNA'lar enfekte insan deride mevcut seviyesinin düşük algılamak için adapte.

Introduction

Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) küçük, Çift iplikçikli DNA virüsü bir nadir ama sert cilt kanseri, Merkel Hücresi Karsinomu (mm)1,2ilişkilendirilmiş olduğunu. MM, yaklaşık % 33, ölüm oranı Melanom3,4süresini aşıyor. MCPyV ~ 5 kb1,5 erken ve geç bölgeler1kodlama içine bir kodlama-düzenleyici bölgeye göre (NCRR) böldüğü dairesel genom vardır. NCRR çoğaltma (Ori) ve çift yönlü Rehberleri viral transkripsiyon6,7için viral kökenli içerir. Erken bölge büyük T (LT), küçük T (sT), 57kT, alternatif LT ORF (ALTO) yanı sıra autoregulatory miRNA1,8,9,10denilen tümör antijen protein kodlayan. Geç bölge kapsid protein VP1 ve VP211,12,13kodlar. LT ve sT en çok çalışılan MCPyV proteinler ve viral DNA ikileşmesi ve MCPyV kaynaklı tumorigenesis5desteklemek için göstermiştir. Klonal entegrasyon MCCs ilâ % 80 gözlenmiştir, ana bilgisayar genom MCPyV DNA'ın olası virüs-pozitif tümör geliştirme14,15nedensel bir faktördür.

MM insidansı üzerinde son yirmi yıl16kat arttı. Asemptomatik MCPyV enfeksiyon genel nüfus17,18,19' da yaygındır. MM tanılar sayısının artması ve MCPyV enfeksiyon yüksek yaygınlığı ile virüs ve oncogenic bir potansiyel anlayışımızı geliştirmek için gerek yoktur. Ancak, MCPyV biyoloji ve oncogenic mekanizmaları birçok açıdan kötü anlaşılan20kalır. Büyük ölçüde MCPyV kötü içinde kurulan hücre satırlar11,12,21,22,23 çoğaltır ve yakın zamana kadar MCPyV destekleme kapasitesine sahip hücreleri cilt, bunun nedeni enfeksiyon keşfedilen22olmasaydı. Tam olarak MCPyV ve konak hücreleri ile etkileşimi araştırmak için mekanik çalışmaları5virüs yayma için hücre kültür sistemi eksikliği ile engel olmuştur.

Biz birincil insan dermal fibroblastlar (HDFs) her iki vitro yenidoğan insan sünnet destek sağlam MCPyV enfeksiyondan izole keşfetti ve ex vivo24. Bu çalışmada, ilk hücre kültür enfeksiyon modeli MCPyV24için kurduk. Bu modeli sistemde bina, matriks metalloproteinaz (MMP) genler tarafından WNT/β-catenin yolu ve diğer büyüme faktörleri sinyal indüksiyon MCPyV enfeksiyon uyarır gösterdi. Ayrıca, FDA onaylı MEK antagonisti trametinib etkili MCPyV enfeksiyon5,25engeller bulduk. Bu çalışmalardan da insan dermal fibroblastlar24,25, izole için iletişim kuralları kümesi MCPyV virions11,12, MCPyV enfeksiyon üzerinde insan dermal fibroblastlar performans hazırlama kurduk 24 , 25 ve algılama MCPyV proteinler tarafından Eğer boyama26. Buna ek olarak, enfekte insan deri hücrelerinde MCPyV DNA'sı tespit için son derece hassas bir balık tekniği (HCR-DNA balık) geliştirmek için yerinde DNA hibridizasyon zincirleme reaksiyon (HCR) teknoloji27 uyarlanmış. Yeni yöntemlerin MCPyV hem de hücresel yanıt MCPyV enfeksiyon bulaşıcı döngüsü eğitimi için faydalı olacaktır. MCPyV enfeksiyon korumak doğal ana depo hücreleri ve mm tümörü ortaya çıkmasına hücreleri bilinmeyen kalır. Biz bu el yazması tarif teknikleri hem rezervuar hücreleri tanımlamak için insan hücreleri türleri ve MCC tümörler kökeni incelemek için uygulanabilir. HCR-DNA balık gibi bizim kurulan yöntemleri de diğer DNA tümör virüs tespiti ve konak hücre etkileşimleri karakterizasyonu istihdam olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan yenidoğan foreskins Penn cilt hastalığı araştırma Merkezi'nden elde edilmiştir. Yetişkin insan fibroblast ameliyattan sonra atılan normal deriden elde edilmiştir. Tüm iletişim kuralları University of Pennsylvania Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.

1. insan dermal fibroblastlar yalıtım

  1. İnsan yenidoğan sünnet derisi yağ ve subkutan doku kapalı trim ve yarım veya çeyrek deri örneği kesmek için bir makas kullanın.
  2. 5 mL 10 mg/mL dispase antibiyotik-antimycotic ile desteklenmiş PBS II de dokusunda kuluçkaya 4 ° C'de bir gecede.
  3. Bir steril 10 cm tabak içinde epidermis dermal katman mikrodiseksiyon forseps kullanarak dikkatlice ayırın.
  4. Transfer elde edilen deri dokusu ile 5 mL 2 mg/mL collagenase de içeren bir 15 mL konik tüp içinde FBS içermeyen çevre antibiyotik-antimycotic ile desteklenmiş IV yazın.
  5. Sadece bir kaç makroskopik doku agrega kalıncaya kadar % 5 CO2 için 4-6 periyodik sallayarak ile h 37 ° C'de örnek kuluçkaya.
  6. Dermis tek hücrelerden (triturating yukarı ve aşağı) şiddetle on kat 10 mL pipet ile pipetting tarafından yayın.
  7. 180 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  8. DMEM orta % 10 fetal buzağı serum, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1 ile desteklenmiş Disosiye hücrelerde plaka L-glutamin 37 ° c % 5 CO2.

2. rekombinant MCPyV virion hazırlık

  1. Özet 50 µg 250 ile pR17b plazmid (MCPyV genom taşıyan), U, BamHI-HF 200 µL birimindeki (4 h 37 ° C'de) viral genom vektör omurga (Şekil 2) ayırmak için.
  2. Arabellek PB (3 M NaAc, pH 5.2 10 µL ile desteklenmiş) 1200 µL sindirilir DNA ekleyin ve 2 miniprep spin sütunları (20 µg DNA kapasite) arındırmak. 200 µL TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA) ile her sütundan sindirilmiş pR17b plazmid elute.
  3. 50 mL santrifüj tüp ligasyonu tepki hazırlayın. Arıtılmış plazmid DNA 400 µL adımından 2.2, 8,6 mL 1.05 x T4 ligaz arabelleği ve yüksek konsantrasyon T4 ligaz 6 µL ekleyin. 16 ° C'de gecede kuluçkaya.
  4. Arabellek PB (3 M NaAc, pH 5.2 10 µL ile desteklenmiş) 45 mL için ligasyonu ekleyin ve bir vakum manifoldu 2 miniprep spin sütunları ile yüklemek için kullanın. Her sütun 50 µL TE arabelleği ile elute. DNA'ın yaklaşık 30 µg verimini bekliyoruz.
  5. Geç öğleden sonra/akşam, tohum 6 x 106 293TT28 hücrelere 10 cm % 10 fetal buzağı serum, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1 ile desteklenmiş içeren DMEM orta çanağı L-glutamin hygromycin B. olmadan
  6. Ertesi sabah, hücreleri yaklaşık % 50 olması konfluent. 66 µL transfection reaktif (1.1 µL/cm2) kullanarak transfect, yeniden ve birleştirilmiş MCPyV 12 µg adımından 2.4, ST ifade plazmid pMtB 8.4 µg ve LT ifade plazmid pADL *299,6 µg R17b DNA izole.
  7. Transfected hücreleri ertesi gün neredeyse konfluent olduğunda hücreleri trypsinize ve sürekli genişleme için 15 cm çanak aktarmak.
  8. İsteğe bağlı olarak 293TT hücreleri üzerine genişleme az sayıda almak ve MCPyV LT (CM2B4) için boyama Eğer gerçekleştirmek ve VP1 (transfection verimliliği belirlemek için MCV VP1 tavşan30). Bu aşamada, nükleer LT sinyal görünür olabilir ama VP1 ifade muhtemelen tespit olmayacaktır.
  9. Ne zaman 15 cm çanak olur neredeyse birleşmesi (genellikle 5-6 gün sonra ilk transfection), aktarım hücreleri üç 15 cm yemekleri. Onlar neredeyse konfluent haline ve virüs hasat iletişim kuralı aşağıdaki takip 15 cm yemekleri hücrelerden hasat.
    Not: İsteğe bağlı olarak açıklandığı gibi Eğer adım 2.8 kalite kontrol gerçekleştirin. Hücrelerin çoğu MCPyV LT ve VP1 bu aşamada olumlu olmalıdır.
  10. Virüs hasat için hücreleri trypsinize, 180 x g RT, 5 min için de spin ve süpernatant kaldırın. Bir hücre Pelet birim DPBS-mg (9,5 mM MgCl2 ve 1 x antibiyotik antimycotic ile DPBS) ekleyin. Sonra 25 mM amonyum sülfat (üzerinden bir 1 M pH 9 hisse senedi çözüm) (a % 10 hisse senedi eriyik--dan), Triton X-100 %0,5 tarafından takip ekleyin ve bir ATP-bağımlı DNaz %0,1 %0.1 Benzonase. Mix iyi ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  11. Buz üzerinde 15 dakika karışımı kuluçkaya ve 5 M NaCl 0,17 hacmi ekleyin. Mix ve başka bir 15 dakika Spin 12.000 x g 4 ° C santrifüj de 10 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya. Süpernatant belli değilse, yavaşça tüp ters çevir ve iplik adımı yineleyin. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın.
  12. 2.11. adımda açıklandığı gibi bir 0.8 M NaCl ve spin ile tekrar takıma DPBS hacmi kullanarak Pelet resuspend.
  13. Adım 2,11 ve 2.12 supernatants birleştirmek ve 2.11 adımda anlatıldığı gibi bir kez daha spin.
  14. İodixanol degradeler ince duvar 5 mL polyallomer tüplerde (% 27, sonra % 33, sonra % 39) underlaying tarafından dökün ~0.7 mL adımları 3 mL şırınga kullanarak uzun iğne veya p1000 pipet ile donatılmış.
  15. Hazır iodixanol degradenin üzerinde eritilmiş virüs içeren süpernatant 3 mL yükleyin.
  16. 3.5 h 234,000 x g de ve 16 ° C SW55ti Open End için spin. Hızlanma ve yavaşlama yavaşlatmak için ayarlayın.
  17. Ultrasantrifüj sonra silikonlu tüpler (her kesir ~ 400 µL olan) 12 kesirleri toplamak.
  18. Virüs'ün kesirler dsDNA reaktif ve/veya VP1 için Western blot tarafından analiz (MCV VP1 tavşan30). Havuzu degrade kesirler tepe dsDNA ve/veya VP1 ile içerik ve hisse senedi viral genom eşdeğer31hesaplamak için kantitatif PCR ile karakterize. MCPyV virion hisse senedi-80 ° C'de depolayın

3. enfeksiyon

  1. Birincil insan dermal fibroblastlar DMEM içinde % %1 10 fetal buzağı serum, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ile korumak L-glutamin. İzdiham ulaştıktan sonra iplik aşağı olmadan fibroblast 1:4 Böl.
    Not: birincil fibroblastlar pasajlar 5 ve kaplama anda aktif bölme 12 arasında en yüksek MCPyV enfeksiyon verimlilik için kullanın.
  2. İnsan dermal fibroblastlar bulaştırmak için orta Aspire edin ve DPBS hücrelerle yıkayın.
  3. 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA çanak ve 5-10dk için 37 ° C'de kuluçkaya.
  4. Hücreleri çanak geliyor emin olmak için mikroskop altında kontrol edin.
  5. DMEM/F12 orta 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ve 3 µM içeren 10 mL ekleyin CHIR99021, tüm bunların MCPyV enfeksiyon24, çanak için teşvik ve hücre çözümü 15 mL tüp içine aktarın.
  6. Spin aşağı 180 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın. DMEM/F12 orta 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ve 3µM içeren hücrelerde resuspend CHIR99021 2-4 mL başına 104 hücre x.
  7. 1 mg/mL collagenase tip bir 96-şey plaka ile IV her kuyuya takıma hücre süspansiyon 200 µL tohum. MCPyV virion hisse senedi üzerinde buz çözme. 109 viral genom karşılıkları MCPyV virions iodixanol bulaşması her 2500-5000 hücreler için 1 µL (içinde hesaplanan adım 2.18) ekleyin.   Yan plaka hafifçe dokunun ve plaka da kuluçka makinesine koyun.
  8. 48-72 saat için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçka sonra % 20 eklemek FBS her şey için.
  9. Enfeksiyon % 5 CO2 72-96 h 37 ° C'de devam etmek izin verir.

4. immünfloresan boyama

  1. 20 dk için PBS içinde % 3 paraformaldehyde ile 3.9. adımda elde hücreleri tamir.
  2. PBS hücrelerle iki kez yıkayın.
  3. Engelleme/permeabilization arabellek hücrelerde kuluçkaya (% 0.5 Triton X-100, PBS % 3 BSA filtre 0,22 µm filtreden), RT 1 h için.
  4. Aşağıdaki birincil antikorlar hücrelerle kuluçkaya: fare monoklonal anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) ve 3 h için RT, tavşan poliklonal anti-MCPyV VP1 antikor (1:2000).
  5. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
  6. İkincil antikorlar hücrelerle kuluçkaya: Fluor 594 keçi Anti-fare IgG (1: 1000) ve Fluor 488 keçi Anti-tavşan IgG (1:500) RT, 1 h için.
  7. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
  8. Hücreleri 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ile counterstain.
  9. Mount coverslips camına slaytlar ve bir ters floresan mikroskop kullanarak çözümleyebilirsiniz.

5. In situ DNA-HCR

Not: Bu teknik hücreleri üzerinde coverslips numaralı seribaşı gerekir. Bu amaç için (adım 3) açıklanan enfeksiyon koşulları 24-şey plaka biçimine ölçekli.

  1. Hücreleri tamir kültürlü coverslips % 4 ile üzerinde iki kez PBS ile 10 dk. yıkama coverslips için PBS PFA sonra tedavi onları % 70 etanol ile gecede 4 ° C'de hücreler permeabilize.
    Not: Sabit örnekleri birkaç gün için bu durumda kalabilir.
  2. Melezlemek örnekleri etanol ile sonda hibridizasyon tampon değiştirme ve 60 dk RT. az için kuluçka tarafından önceden
  3. Probe(s) (1 µM) seyreltik (Tablo 1) prob hibridizasyon içinde 1:500 seyreltme 30 dk öncesi hibridizasyon adım sonu önce tampon çözüm ve 45 ° C'de kuluçkaya
  4. İncubations sonunda, ~ 10 μL seyreltilmiş sonda karıştırın coverslip mikroskop slaytlarda başına pipet. Yer coverslips, hücre tarafı aşağı, hibridizasyon sonda onların anılan sıraya göre damlacıkları üzerinde karıştırın. Kenarları ve coverslips ermesinin kauçuk çimento liberal miktarda slaytlara kapatın.
  5. Slaytları slaytlar bir ısı blok düz tarafında ayarlayarak 94 ° C'de 3 min için eklenen probları ile ısı. Slaytları oksijen odasına aktarmak ve 45 ° C'de gecede kuluçkaya. Basit bir oksijen odası yapmak için hafifçe steril kağıt havlu dH2O ve lastik conta ile mühürler bir plastik kap dibinde yer ile nemlendirin.
    Not: kısaca kauçuk çimento Isıtma sırasında kabarcık. Ancak, değil mührü emin olun.
  6. Dikkatle kauçuk çimento forseps ile peel away ve coverslips hücre tarafa geri 24-şey plaka kuyu yerleştirin. Sonda yıkama arabelleği ile coverslips RT üç kez yıkayın.
  7. Coverslip RT, amplifikasyon arabelleği (24-şey tabak içinde 200 µL) kuluçkaya 30-60 dakika.
  8. Bu arada, her biri ayrı PCR tüpler (Tablo 1) probları Isıtma için 90 94 ° c tarafından kabul ederek iki etiketli oligonükleotid tokalar tavlama s ve ışıktan koruyarak için 30 dk RT için soğutma. Amplifikasyon arabelleği, her bir seyreltme 1:50 at iki saç tokaları karıştırın.
  9. Bir yüzey güçlendirme reaksiyon için 24-şey plaka kapak açık yüz parafin film yayarak olun. Saç tokası/amplifikasyon arabellek karışımı parafin filmin her coverslip için 50-100 µL damlacıkları pipette. Forseps dikkatle coverslips öncesi amplifikasyon çözümden kaldırmak için kullanın. Coverslip gözenekli tek kullanımlık mendil kenarına dokunarak kuru ve hücre tarafı amplifikasyon damlacık yerleştirin.
  10. Coverslips oksijen odasına tutan plaka kapak yerleştirin ve gece karanlıkta RT kuluçkaya.
  11. Coverslips kuyu için bir kez daha geri. 5 örnekleriyle kuluçkaya x SSCT [5 Sodyum Klorür sodyum sitrat (SSC) %0.1 ara 20 filtre 0,22 µm filtreden x] 0,5 µg/mL DAPI RT. 1 h için içeren örnekleri 5 ile iki kez yıkayın RT., x SSCT
  12. Coverslips mikroskop slaytlarda bağlayın. Hücreler çözümlemenize ve bir ters floresan mikroskop kullanarak örnekleri resim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu el yazması açıklanan protokol yalıtım HDFs (Şekil 1) neredeyse homojen bir nüfusun izin. İmmünfloresan boyama tarafından gösterildiği gibi neredeyse % 100 insan deri hücreleri izole bu iletişim kuralında tanımlanan koşullara olumlu kullandığınız lekeli dermal fibroblast işaretleri, vimentin ve kollajen için ben24, ama insan için olumsuz sünnet derisi keratinosit marker K14 (Şekil 1). Şekil 2 MCPyV virions ultracentrifuge konsantrasyonu sonra rekombinant MCPyV genom ve virion örnek kullanarak oluşturma süreci gösterir. MCPyV virions ( Şekil 2Bbir okla işaretli) degrade çekirdek konsantre grup görselleştirme sonra 500 µL kesirler toplanmıştır ve MCPyV qPCR tepe kesirler tanımlamak için gerçekleştirildi. QPCR çözümleme veri örneği Şekil 2' deCgösterilir. Bazı diğer deneylerde örnekleri de Western blot bir tavşan-anti-MCPyV VIP antikor (Tamamlayıcı Şekil 1) kullanarak analiz edildi. Şekil 3 MCPyV ile enfekte HDFs immünfloresan lekeli görüntüleri gösterir. El ile pozitif hücrelerinin ölçmek için en az üç rasgele sayısı yaklaşık 300 hücre saydık. Biz LT olumlu, olumlu, VP1 veya hem LT ve VP1 olumlu MCPyV enfeksiyonu için pozitif olarak hücreleri düşünün. Şekil 3' te gösterilen deneylerde, üzerinde hücrelerinin % 30 LT olumlu ve fazla % 10 VP1 olumlu vardır. Enfekte hücrelerde çoğaltılan MCPyV genleri HCR-DNA balık (Şekil 4A) ve Immunofluorescent-HCR-DNA balık (Şekil 4B) kullanarak tespit edildi. HCR-DNA balık MCPyV DNA'sı mevcut (resimde) çoğaltma fabrikasında Şekil 4Alokalizasyonu ortaya sürece Immunofluorescent-HCR-DNA balık yöntemleri MCPyV DNA ve protein birlikte LT yerelleştirme eşzamanlı olarak algılanmasını sağlar çoğaltma sırasında (Şekil 4B) merkezleri. HCR DNA immünfloresan balık görüntülerden bu teknik viral DNA ve ilişkili viral protein Co yerelleştirme ortaya çıkarmak için kullanılan olabilir gösterdi.

Figure 1
Resim 1 . Yenidoğan insan sünnet derisi izole insan dermal fibroblastlar. DMEM/F12 orta FBS lekeli vimentin karşı antikor kullanarak % 10 ile takıma kültürlü insan deri hücreleri kollajen ben veya keratin 14 (K14). Hücreleri de DAPI ile counterstained. Bar, 50 µm. Bu rakam Liu vd., 201624 Şekil S2 adapte oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Üretim rekombinant viral genom kullanarak MCPyV virion. PR17b (A) A plazmid Haritası (MCPyV genom plazmid). (B) A temsilcisi MCPyV virion örnek resmini ve hasat üzerinde gradyan saf. Ok MCPyV virions geçişin çekirdeğinde yoğunlaşmıştır grup işaretler. (C) viral genom kopyası sayısı her degrade kesir qPCR kullanarak sayısal. Degrade kesirler (sayılar, sayma geçişin, en baştan grafiğin alt kısmında gösterilir) çekirdek. Hata çubukları üç teknik tekrarlar ortalaması (S.E.M.) standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . İnsan dermal fibroblastlar sağlam MCPyV enfeksiyon, transkripsiyon ve çoğaltma destek. Dermal fibroblastlar insan derisi izole iki gündür MCPyV virions DMEM F12 orta içeren EGF, bFGF, CHIR99021 ve collagenase IV ile tedavi edildi. Taze DMEM/F12 orta ve % 20 içeren değiştirdikten sonra üç gün daha, FBS hücreleri belirtilen antikorları kullanarak IMMUNO lekeli ve DAPI ile counterstained. Birçok hücre sadece son derece LT ve VP1 dile getirdiler ama aynı zamanda sağlam MCPyV çoğaltma foci göstermek. Bu şekil Şekil 3 , Liu ve ark., 201624den uyarlanmıştır. Ölçek bar, 50 m. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . MCPyV balık teknikleri kullanarak enfekte hücrelerde tespiti. DMEM/F12 IV 2 gündür MCPyV ile tedavi EGF, bFGF, CHIR99021 ve collagenase türü içeren kültürlü(a)insan deri hücreleri. Taze DMEM/F12 FBS 3 gün daha içeren değiştirdikten sonra hücreleri HCR-DNA balık analize tabi tutuldu. Hücreleri de DAPI ile counterstained. (B) insan deri hücreleri orta içeren EGF, bFGF, kültürlü ve CHIR99021 her iki tedavi edilmemiş (sahte) ya da (Infected) (A) açıklandığı gibi MCPyV ile tedavi. Hücreleri IMMUNO-balık için tabi tutuldu LT kullanarak antikor ve MCPyV özgü DNA probları DAPI ile counterstaining önce. HPV16 sonda bir negatif kontrol kullanılmıştır. Ölçek çubuğu, 10 m. Bu şekil Şekil 4 , Liu ve ark., 201624den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonda adı Dizileri
MCPyV sonda 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonda 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonda 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonda 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonda 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonda 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tablo 1: araştırmada kullanılan Probes.

Supplemental Figure 1
Tamamlayıcı Şekil 1. MCPyV VP1 için Iodixanol degrade kesirler eleme. MCPyV-enfekte hücreleri lysed ve Iodixanol degrade ayırma için tabi. Çekirdek degrade kesirler (sayılar, bu denemede geçişin alttan sayma rakam üst kısmında gösterilir) VP1 algılamak için Western blot Analizi maruz. Her kesir 10 µL örnekleri 1 x 2-mercaptoethanol % 5 final konsantrasyon ile yük boya göre düzeltilir ve kısaca 65 ° C'ye ısıtılmış Örnekleri üzerinde 4-%12 BIS-Tris jel ayrılmış ve nitroselüloz deyimiyle. Western blot TBST içinde bir tavşan-anti-MCPyV VIP seyreltilmiş anti-serum 1: 5000 kullanarak yağsız Kuru süt ile yapılmıştır. Anti-serum istek üzerine mevcuttur. (Hangi benzer şekilde 47 kDa MCPyV VP1 monomer geçirir) 50 kDa standart bir yıldız ile işaretlenir. Gösterilen görüntü örnek azaltma eksik ve disülfür bağlantılı VP1 multimers belirgin. Dithiothreitol ve/veya yüksek denatürasyon sıcaklıklar daha kapsamlı azaltma VP1 monomer türler için neden olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsan cilt dokusundan dermal fibroblastlar yalıtım, rekombinant MCPyV virions hazırlanması, enfeksiyon kültürlü hücreleri, immünfloresan boyama ve HCR teknolojisinden adapte hassas bir balık yöntemi de dahil olmak üzere yukarıda açıklanan yöntemleri hangi Araştırmacılar MCPyV enfeksiyon27analiz etmek etkinleştirmeniz gerekir. MCPyV enfeksiyon tüp bebek ulaşmada en önemli adımlardan biri yüksek titresi virion hazırlıklar yapımıdır. İstimal belgili tanımlık protokol için burada açıklanan rekombinant MCPyV virions hazırlanması, idoxanol solvent11,12mL başına 1012 genom kopya viral titreleri elde etmek. Tam MCPyV enfeksiyon desteklemek için görünen HDFs şu ana kadar yalnızca birincil deri hücre türü olarak tanımlamak için bize izin verdi bu yüksek-titresi MCPyV hazırlıklar24döngüsü.

Taze insan dermal fibroblastlar bu el yazması açıklanan protokolü kullanılarak izole bize deneme ve tutarlılığı bulgular farklı hasta örnekleri izole hücreler boyunca MCPyV enfeksiyonunda kullanılan hücre kalitesini denetlemek için sağlamıştır. Tüm insan dermal fibroblastlar yenidoğan cilt izole MCPyV DNA varlığı için MCPyV enfeksiyon rekombinant MCPyV virions ile tedavi öncesinde yokluğu sağlamak için qPCR tarafından değerlendirilmesi. Maksimum MCPyV enfeksiyon verimlilik elde etmek için alt MCPyV enfeksiyon verimliliği daha yüksek geçit fibroblastlar destek gibi taze yenidoğan insan sünnet derisi izole insan dermal fibroblastlar kullanmak önemlidir. Ayrıca, ne zaman paralel yetişkin cilt örneklerinden izole, fibroblastlar yenidoğan cilt örneklerinden çok daha yüksek MCPyV enfeksiyon verimliliği24desteklenen. Asla herhangi bir piyasada bulunan hücreler MCPyV enfeksiyon için test ettik. Ancak, biz daha yüksek geçit donma noktasında olmaları durumunda Ticari fibroblastlar izole hiçbir belirli neden diğer--dan aşağı olmalıdır bakın.

Biz de diğer hayvanlardan dermal fibroblastlar yalıtmak için burada açıklanan protokolü kullanılır. Örneğin, başarılı bir şekilde fare (Mus musculus), fare (Rattus norvegicus), Ağaç faresi (Tupaia Belangeri) ve rhesus makak (Macaca melez)25dermal fibroblastlar yalıtmak için protokol kullandık. İnsan hücrelerinde gözlemlediği gibi genç şempanzeler izole fibroblastlar büyük hayvanlar25ile karşılaştırıldığında çok daha verimli MCPyV enfeksiyon izin.

Geleneksel balık için karşılaştırıldığında, HCR-DNA ama viral genom24,27algılamak için son derece hassas yöntem basit bir balıktır. MCPyV çoğaltma merkezlerinden kolayca enfekte hücreleri çekirdekleri içinde az bir HPV belirli sonda (Şekil 4)24ile tedavi aynı örnekler tespit arka plan sinyal ile çok özel punctate foci olarak tespit edilebilir. Gelecekte, yaklaşım bu nedenle düşük-bereket MCPyV DNA enfekte insan deride mevcut algılamaya keşfedilmeyi. Aynı zamanda diğer DNA virüsleri izlemek için adapte olabilir. IMMUNO-balık immünfloresan boyama ile birleştirildiğinde, aynı anda viral DNA ve viral kodlanmış protein veya ana bilgisayar proteinler aynı hücrelerde (Şekil 4) mevcut algılamak için güçlü bir yöntem sağlar. Burada açıklanan protokolleri kullanarak en iyi sonuçları elde etmek için immünfloresan boyama ve HCR-DNA balık analiz için taze sabit örnekleri kullanmak en iyisidir. HCR-DNA balık analiz için sonda ve amplifikatör tekrarlanan dondurma ve çözme önlemek için küçük aliquots içinde-80 ° C'de muhafaza edilmelidir.

HDF hücre kültürü ve MCPyV enfeksiyon protokolü kullanarak, biz en iyi HDFs içinde MCPyV giriş, transkripsiyon ve çoğaltma desteği hücre büyüme koşulları araştırdı. EGF, bFGF ve uyarılması WNT sinyal yolu önemli ölçüde MCPyV enfeksiyon teşvik gibi büyüme faktörleri, HDFs o uygulamasıyla keşfettik. Gen ifade profil oluşturma bu büyüme faktörleri ve WNT yolu sinyal aktivasyonu ile stimülasyon birkaç genler matriks metalloproteinaz (MMP) ailesinin MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 ve 13, sağlam indüklenen, ortaya koymaktadır. Bu MMP enzimler hücre dışı matriks proteinleri aşağılayıcı yeteneğine sahip olduğundan, onlar ana hücrelerinin hücre dışı matriks kesintiye tarafından MCPyV enfeksiyon teşvik edebilir neden. Gerçekten de, HDFs collagenase tip IV ile tedavi, MMP ailesinin üyesi olan sağlam uyarır MCPyV enfeksiyonu (Şekil 3)24. Biz de bileşikler, MCPyV enfeksiyon üzerinde inhibitör etkisi için birkaç FDA onaylı kinaz inhibitörleri dahil olmak üzere bir dizi tarandı. Biz bu trametinib ortaya MEK1 ve MEK2 inhibitörü, önemli ölçüde MCPyV enfeksiyon24engeller. Diğerleri kullanın veya immün hastalarda MCPyV viral yük azaltmak MCPyV inhibitörü ilaç keşif platformu olarak bu enfeksiyon sistemi değiştirmek.

Özet olarak, yüksek verimli MCPyV enfeksiyon ulaşmak için bu protokoller, kötü aydınlatmak için bir platform anladım MCPyV bulaşıcı döngüsü ve oncogenic mekanizmaları MCPyV kaynaklı viral enfeksiyon bağlamında sağlar. Bu iletişim kuralları kümesi ek MCPyV keyfi insan hücre türleri ve mm hangi arızi MCPyV enfeksiyon tümör gelişmesine neden olabilir, özgün hücre keşfetmek için gelecek çalışmalarda uygulanan olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Enstitüsü) ve Dr. M. Celeste Simon (Pennsylvania Üniversitesi) reaktifler ve teknik destek sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Laboratuarlarımızda yararlı tartışma için üyeleri ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe (R01CA187718, R01CA148768 ve R01CA142723), ncı Kanser Merkezi Destek Grant (ncı P30 CA016520) ve Penn CFAR Ödülü (P30 AI 045008) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 144 Merkel hücre polyomavirus yalıtım dermal fibroblastlar enfeksiyon collagenase IV CHIR99021 immünfloresan boyama floresans in situ hibridizasyon in situ olarak DNA hibridizasyon zincirleme reaksiyon transkripsiyon çoğaltma
Merkel Hücresi Polyomavirus enfeksiyon ve algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter