Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ инфекции и обнаружения

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем протокол заразить первичного человека фибробластов дермы с MCPyV. Протокол включает изоляции фибробластов дермы, подготовка вирионы MCPyV, вирусной инфекции, иммунофлюоресценции окрашивание и флуоресценции в гибридизации situ. Этот протокол может быть продлено характеризующих MCPyV хост взаимодействий и открывать другие типы клеток заражаемые по MCPyV.

Abstract

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ (MCPyV) инфекция может приводить к Меркель карцинома (MCC), высоко агрессивной формой рака кожи. Механистический исследования полностью MCPyV молекулярной биологии и расследовать онкогенных механизмы сдерживаются отсутствием адекватных клетки культуры моделей. Здесь мы описывают набор протоколов для выполнения и обнаружения инфекции MCPyV клеток первичной человеческой кожи. Протоколы описывают изоляции фибробластов дермы, подготовка рекомбинантных MCPyV вирионов и обнаружения заражения вирусом, immunofluorescent окрашивание (КРП) и на месте ДНК гибридизации цепной реакции (HCR), которая очень чувствительна флуоресценции в situ гибридизация (рыба) подход. Протоколы здесь могут быть адаптированы заинтересованными исследователями для определения других типов клеток и клеточных линий, которые поддерживают MCPyV инфекции. Описанный подход рыбы также могут быть адаптированы для обнаружения низкий уровень вирусной ДНК в зараженных кожи человека.

Introduction

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ (MCPyV) является небольшой, двуцепочечной ДНК вируса, которая была связана с редким, но агрессивных кожи рак, Меркель клеток карциномы (MCC)1,2. MCC, около 33%, показатель смертности превышает меланомы3,4. MCPyV имеет циркулярный геном ~ 5 КБ1,5 пополам некодирующих регулирования региона (NCRR) в ранний и поздний кодирования регионах1. NCRR содержит вирусного происхождения репликации (ОРИ) и двунаправленный промоутеров для вирусных транскрипции6,7. Начале региона кодирует опухолевого антигена белки, называемые большой T (LT), небольшой T (ул), 57kT, альтернативные ORF LT (альт), а также ауторегуляторных Мирна1,8,9,10. Конце региона кодирует белки VP1 капсида и VP211,12,13. LT и sT являются наиболее изученных MCPyV белков и продемонстрировали для поддержки репликации вирусных ДНК и MCPyV индуцированной tumorigenesis5. Клоновых интеграция MCPyV ДНК в геном хост, который наблюдается в до 80% КЦС, скорее всего является причинным фактором для развития вируса позитивные опухоли14,15.

Распространенность MCC утроилось за последние двадцать лет16. Бессимптомной инфекции MCPyV также широко распространена в общей численности населения17,18,19. С увеличением числа диагнозов MCC и высокая распространенность инфекции MCPyV существует необходимость улучшить наше понимание вируса и его онкогенные потенциал. Однако многие аспекты MCPyV биологии и онкогенных механизмы остаются плохо понимали20. Это главным образом потому, что MCPyV реплицирует плохо в установленных клеток линии11,12,21,,2223 и, до недавнего времени, поддерживающие MCPyV клеток кожи инфекция не обнаружили22. Механистический исследования полностью расследовать MCPyV и его взаимодействие с клетки хозяина сдерживаются отсутствием системы культуры клеток для размножения вируса5.

Мы обнаружили, что первичный фибробластов дермы (HDFs) изолированы от новорожденных человека плоть поддержки надежных MCPyV инфекции как в пробирке и ex vivo24. Из этого исследования мы создали первый модель инфекции культуры клеток для MCPyV24. Опираясь на эту модель системы, мы показали, что индукция матрицы металлопротеиназы (СПП) генов WNT/β-катенина сигнальный путь и другие факторы роста стимулирует MCPyV инфекции. Кроме того мы обнаружили, что FDA утвержденных MEK антагонист trametinib эффективно подавляет MCPyV инфекции5,25. Из этих исследований мы также создали набор протоколов для изоляции фибробластов дермы24,25, подготовка MCPyV вирионы11,12, выполняя MCPyV инфекции на фибробластов дермы 24 , 25 и детектирования MCPyV белков, если окрашивание26. Кроме того мы адаптированы на месте ДНК гибридизации цепной реакции (HCR) технология27 для разработки высокочувствительных рыбы техника (HCR-ДНК рыбы) для обнаружения MCPyV ДНК в клетках, инфицированных кожи человека. Эти новые методы будет полезным для изучения инфекционных цикл MCPyV, а также клеточного ответа на инфекцию MCPyV. Клетки водохранилище природного хозяина, которые поддерживают MCPyV инфекции и клетки, которые порождают MCC опухоли остаются неизвестными. Изучить различные типы клеток человека для выявления водохранилище клетки и происхождения опухоли MCC могут применяться методы, которые мы опишем в этой рукописи. Наши установленные методы, такие как HCR-ДНК рыбы, также могут быть использованы в обнаружении других ДНК вирусов опухоли и характеристика принимающей ячейки взаимодействий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Человека новорожденных иммунохимические были получены от Пенн кожи болезни научно-исследовательский центр. Взрослый фибробластов были получены из выброшенных нормальной кожи после операции. Все протоколы были одобрены в университете Пенсильвании институциональных Наблюдательный Совет.

1. изоляция фибробластов дермы

  1. Использование ножницами обрезать жира и подкожной ткани от человека крайней плоти новорожденных и разрезать образец кожи в половины или четвертины.
  2. Инкубировать ткани в 5 мл 10 мг/мл dispase II в PBS, дополнена антибиотик противогрибковое на 4 ° C на ночь.
  3. В стерильные 10 см блюдо тщательно отделяют эпидермис от кожных слоев с помощью microdissection щипцами.
  4. Передача, результирующий кожной ткани до 15 мл конические трубка, содержащая коллагеназы 2 мг/мл 5 мл тип IV в FBS-свободной среде, дополнена антибиотик противогрибковое.
  5. Инкубируйте образца при 37 ° C в 5% CO2 для 4-6 ч с периодического встряхивания, до тех пор, пока всего несколько агрегатов макроскопических ткани остаются.
  6. Выпуск одной клетки из дермы, закупорить вверх и вниз (истирание) энергично десять раз с 10 мл пипетки.
  7. Центрифуга на 180 x g 5 минут и отбросить супернатант.
  8. Пластина диссоциированных клеток в среде DMEM дополнена плода теленка 10% сыворотки, 1% несущественные аминокислот и 1% L-глютамина при 37 ° C в 5% CO2.

2. рекомбинантный MCPyV вириона подготовка

  1. Дайджест 50 мкг плазмида pR17b (проведение MCPyV генома) с 250 U BamHI-HF в объеме 200 мкл (4 ч при 37 ° C) для разделения вирусного генома от вектора позвоночника (рис. 2).
  2. 1200 мкл буфера PB (дополнена 10 мкл 3 M NaAc, рН 5.2) переваривается ДНК и очищают свыше 2 алкалический спин столбцы (20 мкг ДНК емкости). Элюировать усваивается pR17b плазмиды от каждого столбца с 200 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, pH8.0, 1 мм ЭДТА).
  3. Подготовьте реакции перешнуровки в 50 мл пластиковых пробирок. Мкл 400 очищенный плазмидной ДНК из шага 2.2, 8.6 мл 1.05 x T4 лигаза буфера и 6 мкл лигаза высокой концентрации Т4. Инкубируйте на 16 ° C на ночь.
  4. Добавить 45 мл буфера PB (дополнена 10 мкл 3 M NaAc, рН 5.2) для перевязки и использовать вакуумный коллектор для загрузки через 2 колонки алкалический спина. Элюировать каждого столбца с 50 мкл буфера TE. Ожидаете доходность около 30 мкг ДНК.
  5. В конце второй половине дня/вечером, семян 6 x 106 293TT28 ячеек в 10 см блюдо содержащий DMEM среднего дополнена 10% плода телячьей сыворотки, 1% несущественные аминокислот и 1% L-глютамин без hygromycin б.
  6. Следующим утром, убедитесь, что клетки являются около 50% вырожденная. Transfect с помощью 66 мкл Реагента трансфекции (1.1 мкл/см2), 12 мкг повторно перевязаны MCPyV изолировать R17b ДНК от шаг 2.4, 8.4 мкг ST выражение плазмида pMtB и 9,6 мкг LT выражение плазмида pADL *29.
  7. Когда transfected клеток почти вырожденная, следующий день, trypsinize клетки и передавать их на 15 см блюдо для дальнейшего расширения.
  8. При необходимости взять небольшое количество клеток 293TT на расширение и выполнить если окрашивание для MCPyV LT (CM2B4) и VP1 (MCV VP1 кролик30) чтобы определить эффективность трансфекции. На данном этапе ядерная LT сигнала могут быть видны, но выражение VP1 вероятно не будет обнаружить.
  9. Когда 15 см блюдо становится почти притока (обычно 5-6 дней после первоначального трансфекции), перевести клетки на три блюда 15 см. Урожай клетки от 15 см блюда, когда они становятся почти вырожденная и следуйте ниже протокол урожай вируса.
    Примечание: При необходимости выполните контроль качества, если, как описано в шаге 2.8. Большинство клеток должно быть MCPyV LT и VP1 положительных на данном этапе.
  10. Урожай вируса, trypsinize клетки, спина на 180 x g 5 мин в RT и удалить супернатант. Добавьте один объём клетки Пелле DPBS-мг (DPBS с 9,5 мм MgCl2 и 1 x антибиотик противогрибковое). Затем добавьте сульфат аммония 25 мм (от 1 М рН 9 Стоковый раствор) следуют 0,5% X-100 Тритон (от 10% раствор), 0,1% Benzonase и 0,1% DNase АТФ-зависимые. Хорошо перемешайте и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
  11. Инкубировать смесь для 15 минут на льду, а затем добавить 0.17 объем 5 M NaCl. Смешать и инкубировать на льду еще 15 мин спин 10 мин на 12000 x g в центрифуге 4 ° С. Если супернатант не ясно, аккуратно перевернуть трубку и повторите шаг спиннинг. Супернатант передать новой трубки.
  12. Ресуспензируйте Пелле, используя один объем DPBS, дополненная 0.8 М NaCl и спина снова, как описано в шаге 2.11.
  13. Совместить supernatants из шага 2.11 и 2.12 и спина еще один раз, как описано в шаге 2.11.
  14. Вливают тонкой стенки 5 мл polyallomer трубы градиенты iodixanol от нижележащего (27%, а затем 33%, то 39%) ~0.7 мл шагов, используя шприц 3 мл оснащены длинной иглой или p1000 пипетки.
  15. Загрузка 3 мл осветленный вирус содержащих супернатант на подготовленный iodixanol градиент.
  16. Отжим для 3.5 h 234000 x g и 16 ° C в SW55ti ротора. Установите ускорение и замедление, медленно.
  17. После ultracentrifugation собирайте 12 фракций в силицированного трубы (Каждая фракция ~ 400 мкл).
  18. Анализировать дроби на наличие вируса dsDNA реагента и/или западную помарку для VP1 (MCV VP1 кролик30). Бассейн градиента дроби с пик dsDNA или VP1 содержание и характеризуют фондовой количественной ПЦР для расчета эквивалентных вирусного генома31. Хранить запас вириона MCPyV-80 ° c.

3. инфекции

  1. Поддерживать первичного кожного фибробластов в среде DMEM с 10% плода телячьей сыворотки, 1% несущественные аминокислот и 1% L-глютамина. Дойдя до слияния, разделения фибробластов 1:4 без отжима вниз.
    Примечание: Для наивысшей эффективности MCPyV инфекции, используйте основной фибробластов между проходы 5 и 12, которые активно деления во время покрытия.
  2. Заразить фибробластов дермы, аспирационная среднего и вымыть клетки с DPBS.
  3. Добавить 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА на блюдо и инкубировать при 37 ° C за 5-10 мин.
  4. Проверить под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки сходит блюдо.
  5. Добавить 10 мл среде DMEM/F12, содержащей 20 нг/мл EGF, bFGF 20 нг/мл и 3 мкм CHIR99021, все из которых стимулируют MCPyV инфекции24, чтобы блюдо и передачи решения клеток в 15 мл трубку.
  6. Спин вниз клетки на 180 x g за 2 мин и отбросить супернатант. Ресуспензируйте клеток в среде DMEM/F12 содержащей EGF 20 нг/мл, 20 нг/мл bFGF и 3мкм CHIR99021 на 2-4 x 10-4 клеток / мл.
  7. Семян 200 мкл суспензии клеток, дополнен с 1 мг/мл коллагеназы типа IV в каждой скважине 96-луночных плиты. Оттепель вириона акционерное MCPyV на льду. Добавьте 109 вирусного генома эквиваленты вирионы (исчисляемый шаг 2.18) MCPyV в 1 мкл iodixanol для каждой клетки 2500 до 5000, чтобы быть инфицированы.   Аккуратно коснитесь стороне пластины и место пластину в инкубаторе.
  8. После инкубации при 37 ° C в 5% CO2 для 48-72 ч, добавить 20% FBS в каждой скважине.
  9. Разрешить инфекции приступить при 37 ° C в 5% CO2 для 72-96 ч.

4. immunofluorescent окрашивание

  1. Исправьте клетки, полученные на шаге 3.9 с 3% параформальдегида в PBS на 20 мин.
  2. Вымойте клетки с PBS дважды.
  3. Инкубировать клетки в буфере блокирование/permeabilization (0.5% Тритон X-100, 3% BSA в PBS фильтруют через 0,22 мкм фильтром) в РТ за 1 час.
  4. Инкубировать клетки с следующих первичного антитела: мышь моноклонального анти MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) и кролика polyclonal анти MCPyV VP1 антитела (1: 2000), в РТ за 3 ч.
  5. Вымойте клетки с PBS три раза.
  6. Инкубировать клетки с вторичные антитела: Fluor 594 коза анти мыши IgG (1: 1000) и Fluor 488 коза анти кролик IgG (1: 500) в РТ за 1 ч.
  7. Вымойте клетки с PBS три раза.
  8. Counterstain клетки с 0,5 мкг/мл DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, дигидрохлорид).
  9. Coverslips крепление на стекло слайды и анализировать с помощью микроскопа Перевернутый флуоресценции.

5. на месте ДНК-ВСР

Примечание: Этот метод требует, чтобы клетки быть посеяны на coverslips. Для этой цели может активизировать инфекции условия, описанные выше (шаг 3) в формате 24-ну пластины.

  1. Исправить клетки культивировали на coverslips с 4% ПФА в PBS на 10 мин мыть coverslips дважды с PBS, затем относиться к ним с для разрушения клеток при температуре 4 ° C на ночь на 70% спирте.
    Примечание: Фиксированная образцы могут оставаться в этом состоянии в течение нескольких дней.
  2. Предварительно гибридизируйте образцы, заменив этанола с зонд гибридизации буфера и инкубации 60 мин на RT.
  3. Разбавить кислородных (1 мкм) (Таблица 1) в зонд гибридизации буферного раствора при разбавлении 1: 500 30 мин до окончания этапа предварительной гибридизации и Инкубируйте на 45 ° C.
  4. В конце инкубации Пипетка ~ 10 мкл разбавленного зонд смесь coverslip на скольжениях микроскопа. Место coverslips, стороны ячейки вниз, на их соответствующих капельки гибридизация зонда смесь. Уплотнение края и спиной coverslips слайды с либеральной количество резиновых цемента.
  5. Тепло слайды с добавил зонды на 94 ° C на 3 мин, установив слайды на плоской стороне блока тепла. Перенести слайды в увлажненные камеру и Инкубируйте на 45 ° C на ночь. Чтобы сделать простую камеру увлажненные, слегка Смочите стерильные салфетки с dH2O и место в нижней части пластиковый контейнер, который запечатывает с резиновой прокладкой.
    Примечание: Во время обогрева резиновый клей может пузыря кратко. Однако убедитесь, что печать не ломается.
  6. Тщательно удаляйте резиновые цемента с щипцами и место coverslips стороны ячейки вверх обратно в скважины 24-ну плиты. Мыть coverslips с буфером мыть зонд на RT три раза.
  7. Инкубировать coverslip в буфере амплификации (200 мкл в 24-ну пластин) на RT 30-60 мин.
  8. Тем временем, отжиг каждый из двух помечены олигонуклеотида заколки, признавая зонды (Таблица 1) в отдельных ПЦР труб путем нагрева до 94 ° C 90 s и охлаждения для RT 30 мин при защите от света. Смешайте две шпильки в буфере амплификации, каждый в разведении 1:50.
  9. Сделайте поверхность для реакции амплификации, растягивая парафин фильм над открытым лицом 24-ну пластина крышки. Пипетка 50-100 мкл капель смеси буфера шпильки/усилители на фильм парафин для каждого coverslip. Используйте щипцы для тщательно удалить coverslips из предварительного усиления решения. Сухой coverslip, касаясь края пористых одноразовые стереть и стороны ячейки вниз на усиление капли.
  10. Поместите крышку плита, проведение coverslips в увлажненные камеру и Инкубируйте на ночь на RT в темноте.
  11. Возвращение coverslips в скважинах еще раз. Проинкубируйте образцы с 5 x SSCT [5 x хлорида натрия цитрат натрия (SSC) 0,1% 20 анимации фильтруется через фильтр 0,22 мкм] содержащих 0,5 мкг/мл DAPI за 1 час на RT. стирать образцы дважды с 5 x SSCT на RT.
  12. Установите coverslips на скольжениях микроскопа. Анализировать клетки и изображения образцов с помощью микроскопа Перевернутый флуоресценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, описанный в этой рукописи позволили изоляции почти однородного населения HDFs (рис. 1). Как показали immunofluorescent окрашивание, почти 100% кожных клеток человека изолированы с помощью условий, описанных в настоящем протоколе были положительно витражи для фибробластов дермы маркеров, виментин и коллаген я24, но негативный для человека плоть кератиноцитов маркер K14 (рис. 1). Рисунок 2 показывает процесс создания MCPyV вирионы с помощью рекомбинантной MCPyV генома и образец вириона после ультрацентрифуга концентрации. После визуализации группы MCPyV вирионы сосредоточены в ядре градиента (отмечен стрелкой в рисунке 2B), было собрано 500 мкл фракций и была выполнена MCPyV ПЦР для выявления пик фракций. Пример данных анализа ПЦР показан на рис. 2C. В некоторых экспериментах образцы были также проанализированы с Западный blotting, используя VLP антитела кролика анти MCPyV (дополнительный рис. 1). Рисунок 3 показывает immunofluorescent цветного изображения HDFs, инфицированных MCPyV. Чтобы вручную определить положительные клетки, мы насчитали по крайней мере три случайных представления около 300 клеток. Мы считаем, клетки, которые являются LT позитивные, VP1 положительный, или LT и VP1 позитивные быть положительным для MCPyV инфекции. В экспериментах показано на рисунке 3свыше 30% клеток LT позитивные и более 10% VP1 положительный. MCPyV геномов, реплицируются в инфицированных клетках были обнаружены с помощью HCR-ДНК рыбы (рис. 4A) и Immunofluorescent-HCR-ДНК рыбы (Рисунок 4B). Хотя HCR-ДНК рыбы показывает локализации MCPyV ДНК в репликации фабрика (очагов) в Рисунок 4A, Immunofluorescent-HCR-ДНК рыбы методов позволяет одновременное обнаружение ДНК MCPyV и LT белка совместно локализации в репликации центров (Рисунок 4B). Изображения из рыбы immunofluorescent-HCR-ДНК показал, что этот метод может использоваться выявить совместно локализации вирусной ДНК и связанных вирусных белков.

Figure 1
Рисунок 1 . Фибробластов дермы, изолированы от новорожденных человека плоть. Кожные клетки человека, культивируемых в среде DMEM/F12 с 10% FBS окрашивали с использованием антител против виментин, коллаген I, или кератин 14 (K14). Клетки были также counterstained с DAPI. Бар, 50 мкм. Эта цифра была адаптирована из Рисунок S2 Лю et al., 201624. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Производство MCPyV вириона, с использованием рекомбинантного вирусного генома. (A) A плазмида карта pR17b (MCPyV генома плазмида). (B) представитель изображение образца вириона MCPyV собирают и очищают над градиентом. Стрелка показывает группы MCPyV вирионы сосредоточены в ядре градиента. (C) копии вирусного генома номер в каждом градиента фракции был количественно с помощью ПЦР. Основные градиента дроби (в нижней части диаграммы указаны номера, считая от верхней части градиента). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего (S.E.M.) трех технических повторяется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Фибробластов дермы поддерживают надежные инфекции, транскрипции и репликации MCPyV. Кожной фибробластов, изолированных от кожи человека лечили с MCPyV вирионов в среде DMEM F12 средних содержащей EGF, bFGF, CHIR99021 и коллагеназы IV на два дня. После смены свежие среде DMEM/F12, содержащей 20% FBS трех дней, клетки были иммуно витражи с использованием указанных антител и counterstained с DAPI. Многие из клеток не только выразили весьма LT и VP1, но также показать надежные MCPyV очаги репликации. Эта цифра была адаптирована из Рисунок 3 Лю et al., 201624. Масштаб бар, 50 м. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Обнаружение MCPyV в инфицированных клетках, с использованием методов рыбы. (A) кожных клеток человека культивировали в среде DMEM/F12, содержащей EGF, bFGF, CHIR99021 и коллагеназы тип IV относились с MCPyV за 2 дня. После изменения свежие среде DMEM/F12, содержащие FBS для 3 дней, клетки были подвергнуты анализу HCR-ДНК рыбы. Клетки были также counterstained с DAPI. (B) кожных клеток человека культивировали в средних содержащей EGF, bFGF, и CHIR99021 были либо необработанные (макет) или лечить (зараженных) с MCPyV, как описано в (A). Клетки были подвергнуты иммуно рыбы с помощью LT антитела и MCPyV специфических ДНК зонды до counterstaining с DAPI. ВПЧ 16 зонды были использованы в качестве отрицательного контроля. Линейки, 10 м. Эта цифра была адаптирована из Рисунок 4 Лю et al., 201624. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Имя датчика Последовательности
MCPyV зонд 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV зонд 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
ВПЧ зонд 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
ВПЧ зонд 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Зонд ВПЧ 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Зонд ВПЧ 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
ВПЧ зонд 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Таблица 1: Датчики, используемые в исследовании.

Supplemental Figure 1
Дополнительные рисунок 1. Скрининг градиента фракции Iodixanol MCPyV VP1. MCPyV инфицированные клетки лизированы и подвергается Iodixanol градиент фракционирования. Основные градиента фракций (чисел, считая от нижней части градиента в этом эксперименте, указаны в верхней части цифра) были подвергнуты Вестерн-блот анализ для выявления VP1. 10 мкл образцы каждой фракции были скорректированы для 1 x краска нагрузки с 5% конечной концентрации 2-меркаптоэтанол и кратко нагревают до 65 ° C. Образцы были разделены на 4-12% гель бис трис и смыл на нитроцеллюлозы. Западный blotting было проведено в TBST с обезжиренного сухого молока, с использованием кролика анти MCPyV VLP антисыворотка разводят 1: 5000. По запросу предоставляется антисыворотки. 50 kDa стандарт (который переносит аналогично 47 кДа MCPyV VP1 мономера) помечен звездочкой. В изображении показано сокращение образца была неполной и связанных дисульфидными VP1 мультимеры очевидны. Использование Дитиотреитол или более высоких температурах денатурации может привести к более полное сокращение видов VP1 мономера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, описанные выше, включая изоляции фибробластов дермы из ткани кожи человека, подготовка рекомбинантных MCPyV вирионов, заражения культивируемых клеток, immunofluorescent окрашивание и чувствительным методом рыбы адаптирован из HCR технологии, которая следует включить исследователей для анализа MCPyV инфекции27. Одним из наиболее важных шагов для достижения MCPyV инфекции в пробирке является производство препаратов высокого титра вириона. Используя протокол для приготовления рекомбинантных MCPyV вирионов, описанных здесь, мы достигаем вирусный титры 10 копий геномов12 мл растворителя11,idoxanol12. Эти высокий титр MCPyV препараты позволило нам определить HDFs как тип ячейки только первичный кожи до настоящего времени появления поддержать полное MCPyV инфекции цикл24.

Изоляция свежие фибробластов дермы с использованием протокола, описанные в этой рукописи позволяет нам контролировать качество ячеек, которые используются в MCPyV инфекции экспериментировать и обеспечить согласованность результатов клетки изолированы от разных пациентов образцов. Все фибробластов дермы, изолированы от новорожденных кожи следует оценивать наличие MCPyV ДНК путем ПЦР для обеспечения отсутствия MCPyV инфекции до лечения с рекомбинантным MCPyV вирионов. С целью получения максимальной эффективности MCPyV инфекции, важно использовать фибробластов дермы, свежезаваренным изолированы от новорожденных плоть человека как выше проход фибробластов поддержки ниже MCPyV инфекции эффективность. Кроме того когда изолированные параллельно от взрослых кожных проб, фибробласты из новорожденных кожи образцов поддерживает гораздо выше MCPyV инфекции эффективность24. Мы никогда не испытывал любого коммерчески доступных ячеек для MCPyV инфекции. Однако мы видим, что нет особых причин, что коммерчески изолированные фибробластов должно быть хуже другой чем если они выше проход точке замерзания.

Мы также использовали протокол, описанные здесь, чтобы изолировать фибробласты дермы от других животных. Например мы использовали протокол успешно изолировать фибробласты дермы от мышь (Mus musculus), Рац (Rattus Омар), дерево бурозубка (Tupaia Belangeri) и резус макака (Macaca мулатка)25. Как отмечалось в клетках человека, фибробласты, изолированных от молодых шимпанзе позволили намного эффективнее MCPyV инфекции, по сравнению с взрослыми животных25.

По сравнению с традиционными РЫБНЫМИ, HCR-ДНК рыбы является простой, но весьма чувствительный метод для обнаружения вирусных геномов24,27. Центры MCPyV репликации могут быть легко обнаружены в ядрах инфицированных клеток как весьма специфический пунктата очагов, с практически нет фонового сигнала, обнаружены в том же образцах, относились с ВПЧ конкретного ПЭП (рис. 4)24. В будущем подход, поэтому могут быть изучены для обнаружения низкого обилие MCPyV ДНК в коже инфицированного человека. Это также может быть адаптирована для мониторинга других ДНК вирусов. В сочетании с immunofluorescent окрашивание, иммуно рыба обеспечивает мощный метод для одновременно обнаружения вирусных ДНК и вирусных закодированные белка или принимающей белков, присутствующих в тех же ячейках (рис. 4). Для получения оптимальных результатов, используя протоколы, описанные здесь, это лучше использовать свежую фиксированной образцы для immunofluorescent окраски и анализа ВСР-ДНК рыбы. Для анализа ВСР-ДНК рыбы датчики и усилители должны храниться в-80 ° C в небольших аликвоты избегать повторного замораживания и оттаивания.

Используя ХДФ клеточной культуры и MCPyV инфекции протокол, мы изучили условия роста клеток, которые лучше поддерживают запись MCPyV, транскрипции и репликации в файловую систему HDFs. Мы обнаружили, что лечение HDFs с факторы роста, такие как EGF, bFGF и стимуляции сигнальный путь WNT значительно способствовать MCPyV инфекции. Ген выражение профилирования показывает, что при стимуляции с этими факторами роста и активации сигнальный путь WNT, несколько генов матрицы металлопротеиназы (СПП) семьи, в том числе ММП1, 3, 7, 9, 10, 11 и 13, были надежно индуцированной. Потому что эти ферменты MMP способны разлагать белков внеклеточного матрикса, мы потому, что они могут стимулировать MCPyV инфекции, нарушая внеклеточного матрикса клеток хозяина. Действительно рассматривая HDFs с коллагеназы типа IV, членом семьи ММП, энергично стимулирует MCPyV инфекции (рис. 3)24. Мы также проверку массива соединений, в том числе несколько ингибитора киназы, FDA утвержденных, ингибирующее действие на MCPyV инфекции. Мы обнаружили, что trametinib, ингибитор MEK1 и MEK2, резко тормозит MCPyV инфекции24. Другие могут использовать или изменить этот инфекции системы как платформа обнаружения наркотиков для MCPyV ингибиторы, уменьшающие MCPyV вирусную нагрузку у пациентов с иммунодефицитом.

Таким образом эти протоколы для достижения высокоэффективных MCPyV инфекции обеспечивают платформу для выяснения плохо понимают инфекционные цикл MCPyV и MCPyV индуцированной онкогенных механизмов в контексте вирусной инфекции. Этот набор протоколов могут применяться в будущих исследований для изучения дополнительных MCPyV разрешительной типы клеток человека и оригинальные клетки MCC, в котором случайные MCPyV инфекции может привести к развитию опухоли.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Meenhard Херлин (Wistar институт) и д-р м. Селеста Симон (Университет штата Пенсильвания) для предоставления реагентов и технической поддержки. Мы также благодарим членов нашей лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (НИЗ) гранты (R01CA187718, R01CA148768 и R01CA142723), NCI рака центр поддержки Грант (NCI Р30 CA016520) и Пенн CFAR премии (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 144 Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ изоляции фибробласты дермы инфекции коллагеназа IV CHIR99021 immunofluorescent окрашивание флуоресценции в гибридизации situ на месте цепной реакции ДНК гибридизации транскрипция репликация
Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ инфекции и обнаружения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter