Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Merkel Cell Polyomavirus infektion och upptäckt

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att infektera primära mänskliga dermal fibroblast med MCPyV. Protokollet omfattar isolering av dermal fibroblaster, utarbetande av MCPyV virioner, virusinfektion, immunofluorescens färgning och fluorescens in situ hybridisering. Detta protokoll kan förlängas karaktärisera MCPyV-host interaktioner och upptäcka andra celltyper som infectable av MCPyV.

Abstract

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infektion kan leda till Merkelcellskarcinom (MCC), en mycket aggressiv form av hudcancer. Mekanistiska studier att fullt ut undersöka MCPyV molekylärbiologi och onkogena mekanismer har hämmats av brist på tillräcklig cell kultur modeller. Här, beskriver vi en uppsättning protokoll för att utföra och att upptäcka MCPyV infektion i primära mänskliga hudceller. Protokollen beskriva isolering av mänskliga dermal fibroblaster, beredning av rekombinant MCPyV virioner och upptäckt av virusinfektion av både Immunofluorescerande (om) färgning och jordbaserad DNA-hybridisering kedjereaktion (HCR), som är en mycket känslig fluorescens i situ hybridisering (FISH) tillvägagångssätt. Protokoll som häri kan anpassas av intresserade forskare att identifiera andra celltyper eller cellinjer som stöder MCPyV infektion. Metoden beskrivs fisk kan också anpassas för att upptäcka låga nivåer av viral DNAs närvarande i den infektera mänskliga huden.

Introduction

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) är en liten, dubbelsträngat DNA-virus som har associerats med en sällsynt, men aggressiv hudcancer, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Dödligheten bland MCC, omkring 33%, överträffar av melanom3,4. MCPyV har en cirkulär genomet ~ 5 kb1,5 genomskärs av en icke-kodande regulatoriska region (NCRR) in i tidig och sen kodande regioner1. NCRR innehåller viral ursprung replikering (Ori) och dubbelriktad initiativtagare för viral transkription6,7. Tidiga regionen kodar tumör antigen proteiner som kallas stora T (LT), liten T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), samt en autoregulatory miRNA1,8,9,10. Sena regionen kodar den kapsid proteiner VP1 och VP211,12,13. LT och sT är de bäst studerade MCPyV proteinerna och har visat sig stödja den virala DNA-replikation och MCPyV-inducerad tumourigenesis5. Klonal integrering av MCPyV DNA i värd genomet, vilket har observerats i upp till 80% av MCCs, är sannolikt en kausal faktor för virus-positiv tumör utveckling14,15.

Incidensen av MCC har tredubblats under de senaste tjugo år16. Asymtomatisk MCPyV infektion är också utbredd i befolkningen17,18,19. Med det ökande antalet MCC diagnoser och den höga prevalensen av MCPyV infektion finns det ett behov att förbättra vår förståelse av viruset och dess onkogen potential. Många aspekter av MCPyV biologi och onkogena mekanismer är dock dåligt förstådd20. Detta beror till stor del MCPyV replikerar dåligt i etablerade cell linjer11,12,21,22,23 och, tills nyligen, hudceller kan stödja MCPyV infektionen hade inte upptäckt22. Mekanistiska studier att fullt ut undersöka MCPyV och dess samspel med värdceller har hämmats av brist på cellodlingssystem för att sprida virus5.

Vi upptäckte att primära mänskliga dermal fibroblaster (HDFs) isolerade från neonatal mänskliga förhud stöd robust MCPyV infektion både in vitro- och ex vivo24. Från denna studie etablerade vi den första cell kultur infektion modellen för MCPyV24. Bygga på detta modellsystem, visade vi att induktion av matrix metalloproteinas (MMP) gener av den WNT/β-catenin signalering utbildningsavsnitt och andra tillväxtfaktorer stimulerar MCPyV infektion. Vi hittade dessutom att FDA-godkända MEK antagonist trametinib effektivt hämmar MCPyV infektion5,25. Från dessa studier har etablerat vi också en uppsättning protokoll för att isolera mänskliga dermal fibroblaster24,25, förbereda MCPyV virioner11,12, utför MCPyV infektion på mänskliga dermal fibroblaster 24 , 25 och upptäcka MCPyV proteiner av om färgning26. Dessutom anpassat vi jordbaserad DNA hybridisering kedjereaktion (HCR) teknik27 för att utveckla en känslig fisk teknik (HCR-DNA fisk) för att upptäcka MCPyV DNA i infekterade mänskliga hudceller. Dessa nya metoder kommer att vara användbart för att studera den smittsamma cykeln av MCPyV as well as den cellulära svaren på MCPyV infektion. De naturliga reservoaren värdceller som upprätthåller MCPyV infektion och de celler som ger upphov till MCC tumörer förblir okänd. De tekniker som vi beskriver i detta manuskript skulle kunna tillämpas för att undersöka olika typer av mänskliga celler att identifiera både reservoar cellerna och ursprung av MCC tumörer. Våra etablerade metoder, såsom HCR-DNA fisk, kunde också vara anställd i upptäckt av andra DNA tumörvirus och karakterisering av värd-cell interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Human neonatal förhudarna erhölls från Penn Skin Disease Research Center. Vuxen mänskliga fibroblaster erhölls från kasserade normal hud efter operation. Alla protokoll godkändes av University of Pennsylvania institutionella Review Board.

1. isolering av mänskliga dermal fibroblaster

  1. Använda ett par sax för att trimma bort fett och subkutan vävnad från human neonatal Förhud och skära huden provet i halvor eller fjärdedelar.
  2. Inkubera vävnaden i 5 mL 10 mg/mL dispase II i PBS kompletteras med antibiotikum-antimycotic vid 4 ° C över natten.
  3. I en steril 10 cm skålen, noggrant skilja epidermis från dermal lager använder lokalt pincett.
  4. Överföring de resulterande dermal vävnaden till en 15 mL koniska rör innehållande 5 mL 2 mg/mL kollagenas typ IV i FBS-fri medium kompletteras med antibiotikum-antimycotic.
  5. Inkubera provet vid 37 ° C i 5% CO2 för 4-6 h med periodiska skakningar tills bara några makroskopiska vävnad aggregat återstår.
  6. Släppa enstaka celler från dermis genom pipettering upp och ner (triturating) kraftigt tio gånger med 10 mL pipett.
  7. Centrifugera vid 180 x g i 5 min, och kasta bort supernatanten.
  8. Tavla dissocierade celler DMEM medellång kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% L-glutamin vid 37 ° C i 5% CO2.

2. rekombinant MCPyV virion förberedelse

  1. Digest 50 µg pR17b plasmid (bära MCPyV genomet) med 250 U av BamHI-HF i en 200 µL volym (4 h vid 37 ° C) att skilja det virala genomet från vector ryggraden (figur 2).
  2. Tillsätt 1200 µL buffert PB (kompletteras med 10 µL 3 M NaAc, pH 5.2) i smält DNA och rena över 2 miniprep spin kolumner (20 µg DNA kapacitet). Eluera de smälta pR17b plasmiden från varje kolumn med 200 µL TE buffert (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Förbereda ligering reaktionen i en 50 mL centrifugrör. Tillsätt 400 µL av renat plasmid DNA från steg 2.2, 8,6 mL 1,05 x T4 ligase buffert och 6 µL av hög koncentration T4 ligase. Inkubera vid 16 ° C över natten.
  4. Tillsätt 45 mL buffert PB (kompletteras med 10 µL 3 M NaAc, pH 5.2) till ligering och använda ett vakuum samlingsrör för att ladda genom 2 miniprep spin kolumner. Eluera varje kolumn med 50 µL av TE buffert. Räkna med en avkastning på cirka 30 µg av DNA.
  5. I slutet av eftermiddagen/kvällen, utsäde 6 x 106 293TT28 celler i en 10 cm skålen innehållande DMEM medium kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% L-glutamin utan hygromycin B.
  6. Nästa morgon, se till att cellerna är ca 50% konfluenta. Transfect med 66 µL transfection reagens (1.1 µL/cm2), 12 µg åter sammanskrivna MCPyV isolera R17b DNA från steg 2,4, 8,4 µg av ST uttryck plasmiden pMtB och 9,6 µg LT uttryck plasmid pADL *29.
  7. När de transfekterade cellerna är nästan konfluenta, följande dag, trypsinize cellerna och överföra dem till en 15 cm parabolantenn för fortsatt expansion.
  8. Alternativt ta ett litet antal 293TT celler vid expansion och utföra om färgning för MCPyV LT (CM2B4) och VP1 (MCV VP1 kanin30) att fastställa transfection effektivitet. I detta skede, nukleära LT signalen kan vara synliga men VP1 uttryck förmodligen inte kommer att upptäckas.
  9. När 15 cm skålen blir nästan konfluenta (vanligen 5-6 dagar efter första transfection), överför cellerna till tre 15 cm rätter. Skörda cellerna från de 15 cm rätterna när de blir nästan konfluenta och följa virus skörd protokollet nedan.
    Obs: Du kan också utföra kvalitetskontroll om som beskrivs i steg 2,8. De flesta av cellerna bör både MCPyV LT och VP1 positiv i detta skede.
  10. För att skörda viruset, trypsinize celler, snurra vid 180 x g i 5 min på RT och avlägsna supernatanten. Lägga till en pellet cellvolym DPBS-mg (DPBS med 9,5 mM MgCl2 och 1 x antibiotikum-antimycotic). Lägg sedan till 25 mM ammoniumsulfat (från 1 M pH 9 stamlösning) följt av 0,5% Triton x-100 (från en 10% stamlösning), 0,1% bensonas och 0,1% av en ATP-beroende DNAS. Blanda väl och inkubera vid 37 ° C under natten.
  11. Inkubera blandningen för 15 min på is och sedan lägga till 0.17 volym 5 M NaCl. Blanda och inkubera på is för en annan 15 min. Spin i 10 min vid 12 000 x g i en 4 ° C centrifug. Om supernatanten inte är klart, försiktigt Invertera röret och upprepa detta spinning. Överför supernatanten till en ny tub.
  12. Återsuspendera pelleten med en volym av DPBS kompletterat med 0.8 M NaCl och snurra igen, enligt beskrivningen i steg 2.11.
  13. Kombinera supernatanterna från steg 2.11 och 2.12, och snurra en gång som beskrivs i steg 2.11.
  14. Häll lutningar av iodixanol i tunnväggiga 5 mL polyallomer rör av underlaying (27%, 33% och sedan 39%) ~0.7 mL steg med en 3 mL spruta försedd med en lång nål eller p1000 pipett.
  15. Fyll 3 mL skirat virusinnehållande supernatanten på beredda iodixanol övertoningen.
  16. Snurra för 3,5 h vid 234,000 x g och 16 ° C i en SW55ti rotor. Ange den acceleration och retardation sakta.
  17. Efter ultracentrifugering, samla 12 fraktioner i silikoniserad rör (respektive fraktion är ~ 400 µL).
  18. Analysera fraktioner för förekomsten av virus av dsDNA reagens eller Western blot för VP1 (MCV VP1 kanin30). Pool gradient fraktioner med peak dsDNA eller VP1 halten och karakterisera beståndet av kvantitativa PCR att beräkna det virala genom motsvarande31. Lagra MCPyV virion lager vid-80 ° C.

3. infektion

  1. Upprätthålla primära mänskliga dermal fibroblaster i DMEM med 10% fetalt kalvserum, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% L-glutamin. När du når sammanflödet, split fibroblaster 1:4 utan spinning ner.
    Obs: För högsta MCPyV infektion effektivitet, använda primära fibroblaster mellan passager 5 och 12 som aktivt delar sig vid tidpunkten för plätering.
  2. För att infektera mänskliga dermal fibroblaster, sug ut mediet och tvätta cellerna med DPBS.
  3. Tillsätt 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA till skålen och inkubera vid 37 ° C i 5-10 min.
  4. Kolla under mikroskopet se till att cellerna kommer från skålen.
  5. Tillsätt 10 mL av DMEM/F12 medium innehållande 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF och 3 µM CHIR99021, alla stimulera MCPyV infektion24, till skålen och överför cell lösningen till en 15 mL tub.
  6. Snurra ner cellerna vid 180 x g i 2 min, och kasta bort supernatanten. Att resuspendera cellerna i DMEM/F12 medium innehållande 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF och 3µM CHIR99021 på 2-4 x 104 celler per mL.
  7. Utsäde 200 µL cellsuspension kompletteras med 1 mg/mL kollagenas typ IV i varje brunn av en plattan med 96 brunnar. Tina MCPyV virion lager på is. Lägga till 109 virusgenom motsvarigheter till MCPyV virioner (beräknade i steg 2.18) per 1 µL iodixanol för varje 2 500 till 5000 celler infekterade.   Tryck på sidan av plattan försiktigt och placera plattan i inkubatorn.
  8. Efter inkubation vid 37 ° C i 5% CO2 för 48-72 h, lägga 20% FBS till varje brunn.
  9. Tillåta infektionen fortsätta vid 37 ° C i 5% CO2 för 72-96 h.

4. Immunofluorescerande färgning

  1. Fixa celler som erhölls i steg 3,9 med 3% PARAFORMALDEHYD i PBS i 20 min.
  2. Tvätta cellerna med PBS två gånger.
  3. Inkubera cellerna i blockering/permeabilisering buffert (0,5% Triton x-100, 3% BSA i PBS filtrerat genom 0,22 µm filter) på RT för 1 h.
  4. Inkubera cellerna med följande primära antikroppar: mus monoklonal anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) och kanin polyklonala anti-MCPyV VP1-antikropp (1: 2000), på RT för 3 h.
  5. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
  6. Inkubera cellerna med sekundära antikropparna: Fluor 594 get antimus IgG (1: 1000) och Fluor 488 get anti-kanin IgG (1: 500) på RT för 1 h.
  7. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
  8. Counterstain cellerna med 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid).
  9. Mount coverslips på glas glider och analysera med hjälp av en inverterad fluorescens Mikroskop.

5. In situ DNA-HCR

Obs: Denna teknik kräver att celler vara seedad på coverslips. För detta ändamål kan infektion förhållandena som beskrivs ovan (steg 3) skalas upp till 24-well platta format.

  1. Fixa celler odlade på coverslips med 4% PFA i PBS för 10 min. Tvätta coverslips två gånger med PBS och sedan behandla dem med 70% etanol till permeabilize cellerna vid 4 ° C över natten.
    Obs: Fasta prover kan förbli i detta tillstånd i flera dagar.
  2. Pre hybridisera prover genom att ersätta etanol med sonden hybridisering buffert och inkubation för 60 min på RT.
  3. Späd probe(s) (1 µM) (tabell 1) i sonden hybridisering buffert lösning på 1: 500 utspädning 30 min före slutet av steget före hybridisering och inkubera vid 45 ° C.
  4. I slutet av inkubationer, tillsätt ~ 10 μL av den utspädda sond mix per täckglas på objektglas. Plats coverslips, cell-sidan nedåt, på deras respektive droppar av hybridisering sonden blanda. Försegla kanterna och ryggen på coverslips till bilder med en liberal belopp av gummi cement.
  5. Värma glasen med extra sonder vid 94 ° C för 3 min genom att ställa in bilderna på den platta sidan av en värme-block. Överföra bilder till en fuktig kammare och inkubera vid 45 ° C över natten. För att göra en enkel befuktade kammare, fukta det sterila pappersdukar med dH2O och Lägg i botten av en plastbehållare som tätar med en gummitätning.
    Obs: Under värme gummi cement kan bubbla kort. Men se till att tätningen inte bryter.
  6. Noggrant skala bort gummi cement med pincett och placera den coverslips cell-sidan upp tillbaka i brunnar i en 24-bra platta. Tvätta coverslips med sonden tvättbuffert på RT tre gånger.
  7. Inkubera i täckglas i förstärkning bufferten (200 µL i 24 brunnar) på RT 30-60 min.
  8. Under tiden glödga var och en av de två märkta oligonukleotiden hårnålar erkänner sonderna (tabell 1) i separat PCR-rören genom uppvärmning till 94 ° C för 90 s och kylning till RT för 30 min samtidigt skyddas från ljus. Blanda de två hårnålar i förstärkning buffert, var och en vid en spädning på 1:50.
  9. Göra en yta för amplifiering reaktionen genom stretching paraffin filma över öppna ansiktet av 24-well platta lock. Överför med pipett 50-100 µL droppar av hårnål/förstärkning buffert blandningen på paraffin filma för varje täckglas. Använd tången för att försiktigt coverslips från före förstärkning lösningen. Torka täckglaset genom att röra vid kanten till en porös disponibla torka, och placera cell-sida ner på förstärkning droplet-programmet.
  10. Placera plattan locket håller coverslips in i en fuktig kammare och inkubera över natten vid RT i mörkret.
  11. Återgå till coverslips till brunnar igen. Inkubera proverna med 5 x SSCT [5 x natriumklorid natriumcitrat (SSC) 0,1% Tween-20 filtreras genom ett 0,22 µm filter] innehållande 0,5 µg/mL DAPI för 1 h på RT. tvätta av prov två gånger med 5 x SSCT på RT.
  12. Montera coverslips på objektglas. Analysera cellerna och bild de prover som genom en inverterad fluorescens Mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet beskrivs i detta manuskript tillåtna isolering av en nästan homogen befolkning på HDFs (figur 1). Som framgår av Immunofluorescerande färgning, färgas nästan 100% av den mänskliga dermal celler isolerade med de villkor som beskrivs i detta protokoll var positivt för dermal fibroblast markörer, vimentin och kollagen jag24, men negativ för mänskliga förhud keratinocyter markör K14 (figur 1). Figur 2 visar generera MCPyV virioner med rekombinant MCPyV arvsmassa och en virion prov efter ultracentrifugen koncentration. Efter visualisera bandet av MCPyV virioner koncentrerade i kärnan av övertoningen (markerad med en pil i bild 2B), samlades 500 µL fraktioner och MCPyV qPCR utfördes för att identifiera peak fraktioner. Ett exempel av qPCR analysdata visas i figur 2C. I några andra experiment analyserades proverna också med Western blotting använder en kanin-anti-MCPyV VLP antikropp (kompletterande Figur1). Figur 3 visar Immunofluorescerande färgade bilder av HDFs infekterade med MCPyV. För att manuellt kvantifiera positiva celler, räknade vi minst tre slumpmässiga utsikt över ca 300 celler. Vi anser att celler som LT positiva, VP1 positiva, eller både LT och VP1 positivt att vara positivt för MCPyV infektion. I de experiment som visas i figur 3, 30% av cellerna är över LT positiva och mer än 10% är VP1 positiva. MCPyV arvsmassan replikeras i de infektera cellerna upptäcktes med hjälp av både den HCR-DNA (figur 4A) och Immunofluorescent-HCR-DNA fisk (figur 4B). Medan fisken HCR-DNA avslöjar localizationen av MCPyV DNA finns i replikering fabriken (foci) i figur 4A, Immunofluorescent-HCR-DNA fisk metoder tillåter samtidiga upptäckt av både MCPyV DNA och LT protein Co lokalisera vid replikering centrerar (figur 4B). Bilder från Immunofluorescerande-HCR-DNA fisk visade att denna teknik kan användas för att avslöja samtidig lokalisering av virus-DNA och det associerade virala proteinet.

Figure 1
Figur 1 . Mänskliga dermal fibroblaster isolerade från neonatal mänskliga förhud. Mänskliga dermal celler odlade i DMEM/F12 medium kompletteras med 10% FBS var målat med antikroppar mot vimentin, kollagen I, eller keratin 14 (K14). Cellerna var också counterstained med DAPI. Bar, 50 µm. Denna siffra var anpassad från Figur S2 av Liu et al., 201624. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Produktion av MCPyV virion använder rekombinant virusgenom. (A) A plasmid karta över pR17b (MCPyV genomet plasmid). (B) en representativ bild av en MCPyV virion prov skördas och renat över en övertoning. Pilen markerar bandet av MCPyV virioner koncentrerad till kärnan i övertoningen. (C) det virala genom exemplaret nummer i varje övertoning bråkdel kvantifierades med qPCR. Core gradient fraktioner (nummer, räknat från toppen av lutningen anges längst ned i diagrammet). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (S.E.M.) av tre tekniska repetitioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Mänskliga dermal fibroblaster stödja robust MCPyV infektion, transkription och replikering. Dermal fibroblaster isolerade från mänsklig hud behandlades med MCPyV virioner DMEM F12 medium innehållande EGF, bFGF, CHIR99021 och kollagenas IV för två dagar. Efter byte till färska DMEM/F12 medium innehållande 20% celler FBS för tre dagar, var immuno-färgade med de angivna antikropparna och counterstained med DAPI. Många av cellerna inte bara har starkt uttryckt LT och VP1 men också Visa robust MCPyV replikering foci. Denna siffra var anpassad från figur 3 för Liu et al., 201624. Skala bar, 50 m. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Påvisande av MCPyV i infekterade celler med fisk tekniker. (A) mänskliga dermal celler odlade i DMEM/F12 som innehåller EGF, bFGF, CHIR99021 och kollagenas typ IV behandlades med MCPyV för 2 dagar. Efter byte till färska DMEM/F12 som innehåller FBS för 3 dagar, utsattes celler för HCR-DNA fisk analys. Cellerna var också counterstained med DAPI. (B) mänskliga dermal celler odlade i medium innehållande EGF, bFGF, och CHIR99021 var antingen obehandlade (Mock) eller behandlats (infekterade) med MCPyV som beskrivs i (A). Celler utsattes för immuno-fisk med LT antikropp och MCPyV-specifika DNA-prober innan counterstaining med DAPI. HPV16 sonder användes som en negativ kontroll. Skalstapeln, 10 m. Denna siffra var anpassad från figur 4 av Liu et al., 201624. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sonden namn Sekvenser
MCPyV sond 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sond 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sond 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sond 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonden 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sond 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sond 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabell 1: Sonder används i studien.

Supplemental Figure 1
Kompletterande figur 1. Screening Iodixanol gradient fraktioner för MCPyV VP1. MCPyV-infekterade celler var lyserat och utsätts för Iodixanol gradient fraktionering. Core gradient fraktioner (nummer, räknat från botten av övertoningen i detta experiment, anges överst i figuren) utsattes för Western blot-analys för att upptäcka VP1. 10 µL prov av respektive fraktion justerades till 1 x belastning färgämne med en slutlig koncentration av 5% av 2-merkaptoetanol och kort uppvärmd till 65 ° C. Proverna skildes på en 4-12% bis-Tris gel och utplånas på nitrocellulosa. Western blotting genomfördes i TBST med nonfat torr mjölk med hjälp av en kanin-anti-MCPyV VLP antiserum utspätt 1: 5000. Antiserumet finns tillgänglig på begäran. De 50 kDa standard (som migrerar på samma sätt till de 47 kDa MCPyV VP1 monomer) markeras med en asterisk. I bilden visas, prov minskning var ofullständig och disulfid-länkade VP1 multimers är uppenbara. Användning av Ditiotreitol eller högre denaturering temperaturer kan resultera i mer komplett minskning av VP1 monomer arten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder som beskrivs ovan, inklusive isolering av dermal fibroblaster från mänsklig hudvävnad, beredning av rekombinant MCPyV virioner, infektion i odlade celler, Immunofluorescerande färgning och en känslig fisk metod anpassad från HCR-teknik, som bör göra det möjligt för forskare att analysera MCPyV infektion27. En av de viktigaste stegen till att uppnå MCPyV infektion in vitro-är produktionen av hög-titer virion preparat. Använder protokollet för beredning av rekombinant MCPyV virioner beskrivs här, uppnå vi viral titrar av 1012 genomet kopior per mL idoxanol lösningsmedel11,12. Dessa hög-titer MCPyV preparat tillät oss att identifiera HDFs som endast primära hud celltyp hittills som verkar stödja full MCPyV infektionen cykel24.

Isolera färska mänskliga dermal fibroblaster med hjälp av protokollet som beskrivs i detta manuskript har gett oss att kontrollera kvaliteten på cellerna som används i MCPyV infektion experimentera och säkerställa konsekvens av resultaten över celler som isolerats från olika patientprover. Alla mänskliga dermal fibroblaster isolerade från neonatal hud bör bedömas för förekomst av MCPyV DNA av qPCR att säkerställa frånvaro av MCPyV infektion innan behandling med rekombinant MCPyV virioner. För att erhålla maximal MCPyV infektion effektivitet, är det viktigt att använda mänskliga dermal fibroblaster isolerade nymalen från neonatal mänskliga Förhud som högre passage fibroblaster stöd lägre MCPyV infektion effektivitetsvinster. Ytterligare, när isolerad parallellt från vuxen hud prover, fibroblaster från neonatal hud prover stöds mycket högre MCPyV infektion effektivitet24. Vi har aldrig testat någon kommersiellt tillgängliga celler för MCPyV infektion. Vi ser dock ingen specifik anledning att kommersiellt isolerade fibroblaster bör vara sämre än om de är högre passage vid tidpunkten för frysning.

Vi har också använt det protokoll som beskrivs här för att isolera dermal fibroblaster från andra djur. Till exempel har vi använt protokollet att framgångsrikt isolera dermal fibroblaster från mus (Mus musculus), råttan (Rattus norvegicus), tree argbigga (Tupaia Belangeri) och rhesus Makaker (Macaca mulatta)25. Som observerats i mänskliga celler, fibroblaster isolerade från yngre schimpanser får mycket effektivare MCPyV infektion jämfört med de äldsta djur25.

HCR-DNA fisk jämfört med traditionella fisk, och är en enkel, men mycket känslig metod för att upptäcka virala genomer24,27. Centrerar av MCPyV replikering kan lätt upptäckas i kärnor av infekterade celler som mycket specifika punktuell foci, med liten eller ingen bakgrund signal upptäckt i samma prover behandlade med en HPV specifika sonden (figur 4)24. Metoden kan i framtiden, därför undersökas för att upptäcka låg-överflöd MCPyV DNA i infekterade mänsklig hud. Det skulle också kunna anpassas att övervaka andra DNA-virus. Kombination med Immunofluorescerande färgning, ger immuno-fisken en kraftfull metod för att samtidigt upptäcka virus-DNA och viral kodat protein eller värd proteiner närvarande i samma celler (figur 4). För att erhålla optimal resultaten med de protokoll som beskrivs här, är det bäst att använda färska fasta prover för Immunofluorescerande färgning och HCR-DNA fisk analys. För HCR-DNA fisk analys, ska de sonder och förstärkare förvaras i-80 ° C i små portioner för att undvika upprepad frysning och upptining.

Med hjälp av HDF cellkultur och MCPyV infektion protokoll, utforskade vi cell tillväxten villkorar som bäst stöder MCPyV inträde, transkription och replikering i HDFs. Vi upptäckte att behandling av HDFs med tillväxtfaktorer, såsom EGF, bFGF och stimulering av WNT-signalering vägen betydligt främja MCPyV infektion. Gen uttryck profilering avslöjar att vid stimulering med dessa tillväxtfaktorer och aktivering av WNT signalering utbildningsavsnitt, flera gener av matrix metalloproteinas (MMP) familjen, inklusive MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 och 13, förmåddes kraftfullt. Eftersom dessa MMP enzymer är kapabla att försämra extracellulära matrix proteiner, därför vi att de kan stimulera MCPyV infektion genom att störa den extracellular matrisen av vara värdcellerna. Faktiskt, att behandla HDFs med kollagenas typ IV, en medlem av familjen MMP, kraftfullt stimulerar MCPyV infektion (figur 3)24. Vi har också en rad föreningar, inklusive flera FDA-godkända kinashämmare, för hämmande effekt på MCPyV infektion. Vi upptäckte att trametinib, en MEK1 och MEK2 hämmare, hämmar dramatiskt MCPyV infektion24. Andra kan använda eller modifiera detta infektion system som drug discovery plattform för MCPyV-hämmare som minskar MCPyV virusbelastningen hos immunsupprimerade patienter.

Sammanfattningsvis ger dessa protokoll för att uppnå högeffektiva MCPyV infektion en plattform för att belysa de dåligt förstått MCPyV smittsamma cykel och MCPyV-inducerad onkogena mekanismer i samband med virusinfektion. Denna uppsättning protokoll skulle kunna tillämpas i framtida studier att utforska ytterligare MCPyV-tillåtande mänsklig celltyper, och de ursprungliga cellerna av MCC, som tillfälliga MCPyV infektion kan leda till tumörutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Meenhard Herlyn (Wistar Institute) och Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) för att tillhandahålla reagens och teknisk support. Vi tackar också ledamöterna i våra laboratorier för bra diskussion. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) bidragen (R01CA187718, R01CA148768 och R01CA142723), NCI Cancer Center stöd beviljande (NCI P30 CA016520) och Penn CFAR award (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

Immunologi och infektion fråga 144 Merkel cell polyomavirus isolering dermal fibroblaster infektion kollagenas IV CHIR99021 Immunofluorescerande färgning fluorescens i situ hybridisering jordbaserad DNA-hybridisering kedjereaktion transkription replikering
Merkel Cell Polyomavirus infektion och upptäckt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter