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형태와 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인 Agar에 움직일 활성된 슬러지 입자의 크기 측정

doi: 10.3791/58963 Published: January 30, 2019

Summary

활성된 슬러지 입자의 형태와 크기는 다양 한 방법을 사용 하 여 측정 하는 중요 한 매개 변수. 부정확 비 대표 샘플링, 차선 이미지 및 주관적인 분석 매개 변수에서 발생 한다. 이러한 오류를 최소화 하 고 쉽게 측정, 우리는 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인을 포함 하 여 모든 단계를 지정 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

그 치료 폐수 등 실험적인 bioreactors 입자의 크기와 모양이 중요 한 매개 변수를 포함 합니다. 예를 들어 크기와 활성된 슬러지 flocs의 모양 수는 눈금에서 조건을 나타내고 슬러지는 헤어 청 징 제에서 침전 하는 얼마나 잘에 직접적인 영향을 합니다.

입자 크기와 모양 모두 misleadingly '간단한' 측정 있습니다. 많은 미묘한 문제가, 종종 비공식 프로토콜에 unaddressed 샘플링, 이미징, 및 입자를 분석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 샘플링 방법 편견 수 있습니다 또는 충분 한 통계적 인 힘을 제공 하지. 샘플 스스로 가난 하 게 유지 될 수 있습니다 또는 동원 정지 하는 동안 변경 받 다. 이미지는 충분 한 품질;의 않을 수 있습니다. 겹치는 입자, 분야, 확대율, 그리고 다양 한 잡음의 깊이 수 모든 결과가 가난한. 잘못 지정 된 분석 편견, 수동 이미지 임계 처리 및 시장 세분화에 의해 생산 등 발생할 수 있습니다.

경제성 및 처리량 재현성 함께 바람직한 있습니다. 저렴 한 가격, 높은 처리량 방법 더 자주 입자 측정, 입자의 수천을 포함 하는 많은 이미지를 설정할 수 있습니다. 저렴 한 시 약, 일반적인 해 현미경, 그리고 자유롭게 사용할 수 오픈 소스 분석 소프트웨어를 사용 하는 방법에 반복, 액세스할 수, 재현, 부분적으로 자동화 된 실험 결과 수 있습니다. 또한, 이러한 방법의 제품 잘 서식, 정의 그리고 데이터 분석 소프트웨어, 실험실 내에서 분석 및 실험실 사이 공유 하는 데이터를 완화 하 여 쉽게 이해할 수 있습니다.

우리는 이러한 제품을 생산 하는 데 필요한 단계를 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시 포함: 샘플링, 샘플 준비 및 동원 정지 천, 디지털 이미지 수집, 디지털 이미지 분석과 실험 관련 그림 생성의 예는 분석 결과입니다. 우리는 또한이 프로토콜을 지원 하기 위해 오픈 소스 데이터 분석 파이프라인 포함.

Introduction

이 방법의 목적은 특히 활성된 슬러지 flocs 및 에어로빅과 립1 를 포함 하는 생물 반응 기에서 입자의 크기와 모양 분포를 결정 하기 위한 잘 정의 된, 반복, 그리고 부분적으로 자동화 된 방법을 제공 하는 , 2.이 방법은 뒤에 있는 근거 경제성, 단순, 처리량, 향상 하 고 우리의 기존 사내 프로토콜3,4, 반복성, 다른 입자 측정 및 공유를 용이 하 게 하 고 데이터의 비교입니다.

두 개의 광범위 한 카테고리의 입자 측정 분석-산란5같은 자질을 사용 하 여 직접 이미징 및 날개 식 방법 있다. 날개 식 방법과 자동화 될 수 있다 큰 처리량, 비록 장비는 비싸다. 더하여, 날개 식 방법을 정확 하 게 입자6의 동일한 크기를 확인할 수 있습니다, 하는 동안 그들은 제공 하지 않습니다 자세한 모양 정보7.

셰이프 데이터에 대 한 필요 때문에 우리는 기반으로 우리의 방법을 직접 영상. 높은 처리량 이미징 방법 몇 가지 존재 하는 동안 그들은 전통적으로 비싼 상용 하드웨어 또는 사용자 지정 구축된 솔루션8,9를 요구 했다. 우리의 방법은 일반적인, 저렴 한 하드웨어 및 처리량, 감소에서 고통 비록 많은 분석10에 필요한 최소 보다 훨씬 더 많은 입자 이미지를 생성 하는 소프트웨어를 개발 되었습니다.

중요 한 샘플링 및 이미지 수집 단계 기존 프로토콜 지정 하지 않을 수 있습니다. 다른 프로토콜 (예: ad hoc 임계 처리11) 주관적인 편견을 소개 하는 수동 단계를 지정할 수 있습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 분석 소프트웨어와 결합 된 샘플링, 동원 정지 및 이미지 수집 단계를 지정 하는 잘 정의 된 메서드는 실험실 내에서 이미지 분석 및 실험실 비교 강화할 것 이다. 이 프로토콜의 주요 목표는 워크플로 및 동일한 샘플에 대 한 다른 실험실에서 재현 가능한 결과를 이끌어야 하는 도구를 제공.

이미지 분석 과정을 정상화, 외 인기 있는 데이터 분석 패키지13,14, 완화 실험이이 파이프라인에 의해 생성 하는 데이터 사용을 위해 적당 한 잘 정의 된, 잘 서식 파일12 에 기록 된 특정 분석 (예: 사용자 지정 그림 세대)와 연구소 간에 공유 촉진 데이터입니다.

이 프로토콜은 특히 입자 모양 데이터, 날개 식 방법에 대 한 액세스를 필요가 없습니다, 그들의 자신의 이미지 분석 파이프라인을 개발 하 고 그들의 데이터를 다른 사용자와 쉽게 공유 하고자 하고자 하지 않습니다 연구자에 대 한 제안

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Protocol

1. 입자 분석에 대 한 샘플을 수집

  1. 통계 분석10 에 대 한 충분 한 입자를 생산할 예정 이다 특정 원자로 대 한 샘플 볼륨을 결정 (> 500) 입자 중복을 피하고 있는 동안.
    1. 혼합된 액의 샘플 당 0.5 ~ 2 mL의 범위는 250와 5000 mg/l. 사이 혼합된 액 일시 중지 고체 (MLSS)와 활성된 슬러지 샘플에 대 한 충분 한 가정
    2. 그렇지 않으면, 3 테스트 한 천 배지 0.5, 2, 및 샘플 (2.7 통해 1.2 단계)의 5 mL을 사용 하 여 준비 합니다.
    3. 시각적으로 견적을 (해당 되는 경우) 샘플 볼륨 최고의 단계 1.1에에서 나열 된 조건에 맞는.
    4. 입자는 여전히 0.5 mL 샘플에 대 한 중복 추가 0.5, 1 및 2 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수를 0.5 mL 샘플 단계 2.1 전에 희석 해야 합니다 결정을 희석 3 0.5 mL 샘플 1.1.2와 1.1.3 단계를 반복 합니다.
      참고: 단계 1.1 − 1.1.4 실험 당 한 번 수행만 필요 또는 원자로 내용을 변경 등 후속 측정 더 이상 나열 된 기준을 충족 하는 경우에 1.1 단계.
  2. 잡아 ~ 40 mL 비 커 또는 50 mL 원심 분리기 튜브, 부드럽게 혼합 하 고 즉시 15ml 원심 관으로 잘 혼합된 잡아의 결정된 샘플 볼륨을 붓는에 의해 원자로의 잘 혼합된 부분에서 대표적인 샘플을 취득. 정한 단계 1.1.4 필요한 샘플을 희석.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플 최대 48 시간 동안 냉장 (4 ° C)에서 저장 될 수 있습니다. 샘플을 동결 하지 않습니다.
    주의: 일반적인 보존 미디어 (예: 포름알데히드/formamide) 적합 하지 않습니다. 오픈 컨테이너와 함께에서 접시의 큰 표면 영역 열 광원, 그리고 잠재적으로 가난 하 게 통풍이 현미경 설치 프로그램에서 이미지 품질에 작은 이익을 위해 불필요 하 게 위험 조건 생산.

2. 준비 스테인드, 고정 입자에의 한 천 배지

  1. 1% (w/v) 메 틸 렌 블루의 5 µ L 각 샘플을 다음 모자를 더하고 부드럽게 혼합 3 최소 시간에 반전. 실 온에서 30 분 더 이상 하지만 적어도 5 얼룩을 샘플 수 있습니다.
  2. 이온된 수 한 천 7.5% (w/v)의 샘플 당 약 10 mL를 준비 합니다.
    참고: 한 천 미리 생산 고 소독 하는 경우에, 불명확 하 게 저장 될 수 있습니다. Agarose 대체 될 수 있습니다, 하지만 실질적으로 이미지를 개선 하지 않습니다.
  3. 전자 레인지 또는 물 목욕을 사용 하 여 한 천 녹과 약간 사용 하기 전에 냉각 수 있습니다. 천이 완전히 녹아 쉽게 따른다 확인 합니다. 한 천의 단단한 소 품질 이미지 다르게, 얼룩 것입니다.
  4. 원심 분리기 튜브 6.5 및 9 mL 사이 총 튜브 볼륨을가지고 충분 한 녹은 7.5% (w/v) 한 전송.
  5. 원심 분리기 튜브를 개괄 하 고 부드럽게 혼합을 3 번 이상 반전.
  6. 자신을 멀리 또는 후드 모자를 가리키는 동안 뚜껑을 엽니다. 관 내용을 부드럽게 흔들어 전체, 부드러운 코팅과 입자의 시각적으로 균일 한 분포를 달성 하기 위해 요리 100 m m 플라스틱 페 트리 접시에 붓으십시오.
    주의:는 agar에서 열 튜브에 약간의 압력을 생성할 수 있습니다. 이 종종 가청 히스를 생성 하 고 뜨거운 agar의 작은 방울을 추방 하는.
  7. 접시는 agar 굳은 때까지, 5 분 이상 실 온에서 냉각 수 있습니다.
    참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 스토어 도금 거꾸로 하 고 냉장 (4 ° C)에서 최대 48 시간 동안 (예, 봉인 비닐 봉지에에서 또는 파라핀 영화) 밀봉.

3. stereomicroscope와 디지털 카메라를 사용 하 여 입자 이미지 획득

  1. 10 x 20 x 확대를 할 수는 stereomicroscope의 현미경 스테이지 발견된 격판덮개 얼굴을 놓습니다. 심지어, 확산 조명 LED 조명 스탠드 또는 가벼운 접시 같은 장비를 사용 하 여 샘플을 아래에서 밝히는.
  2. 오픈 이미지 캡처 소프트웨어, 사진, 현미경 빛 경로 설정 되어 있는지 확인 하 고 카메라 목록에서 적절 한 카메라 클릭 합니다.
  3. 나타나도록 여러 입자 초점면에 소프트웨어에 큰, 잘 정의 된 가장자리와 현미경을 조정 합니다. 10-20 x의 확대를 사용 하 여 상대적으로 깊은 초점 평면을 유지 하면서 입자를 측정.
    1. 일시적으로 한 천 배지를 제거 하 고 무대에는 마이크로미터를 놓습니다. 마이크로 미터에 눈금 표시 이미지 캡처 소프트웨어에 크게 집중 될 때까지 잘 초점을 조정 합니다.
    2. 이전 보정 하는 경우 현재 배율에 대 한 마이크로 비율에 있는 픽셀을 기록 합니다.
      1. 클릭 하 여 확대/축소를 100%로 설정 확대 > 실제 크기 를 선택 하 고 옵션 > 보정 다음 0 및 200 µ m 졸업식에 중심 수직 막대는 마이크로 미터의 긴 축 따라 주요 뷰포트에서 빨간 교정 바 정렬. 보정 대화 상자에서 현재 확대 수준과 200 µ m의 실제 길이 입력 합니다.
    3. 만약 이미 보정 메뉴 모음에서 선택 확대 하 고 선택 현재 확대율 레벨 보정을 확인.
      1. 선택 측정 > 라인 > 임의의 . 0 졸업은 마이크로 미터의 긴 축 교차 클릭 하십시오. 200와 긴 축에 교차로에서 다시를 클릭 합니다. A 정확한 교정 표시 약 200 µ m. 삭제 선을 그것을 눌러 삭제를 클릭 하 고 확인 상자에서 를 누르면.
        참고: 카메라 및 교정 선택에 대 한 지시는이 하드웨어를 위해 사용 되는 소프트웨어를 특정. 비슷한 기능 다른 이미징 소프트웨어에서 사용할 수 있어야. 목표는 미크론 비율 정확한 입자 크기 측정에 대 한 이미지의 픽셀을 결정 하는.
  4. 한 천 배지를 장착 하 고 이미징 소프트웨어에 최대 세부 사항을 달성 하기 위해 정밀한 초점을 조정.
  5. 최대 이미지 품질 달성 이미징 소프트웨어를 조정 합니다.
    1. 비트 깊이 카메라 사이드바의 비트 깊이 패널에서 라디오 버튼을 선택 하 여 허용 되는 최대 값을 늘립니다. 카메라 사이드바의 색상/회색 패널에서 적절 한 라디오 단추를 선택 하 여 회색 음영 이미지를 수집 하는 소프트웨어를 설정 합니다.
    2. 노출과 히스토그램 사이 모든 오픈 사이드바 패널을 축소 합니다. 1.0으로 이득을 감소 하 고 깨끗 한 이미지에에서 나타납니다 뷰포트 히스토그램 히스토그램 상자의 양쪽 끝으로 잘립니다 하지 배포로 나타날 때까지 때까지 노출을 증가.
    3. 피하기 위하여 히스토그램과 부족을 조정 합니다. 카메라 측면 표시줄의 막대 그래프 패널에서 최저 값 밖에 그냥 히스토그램의 왼쪽된 경계 및 높은 값 밖에 그냥 오른쪽 경계를 밀어.
  6. 저장 이미지는 압축 되지 않은 TIFF이미지 메타 데이터에 배율 정보를 포함 하 여, 사용 하는 파일 > 다른 이름으로 저장 TIFF 형식을 선택 하 고 되도록 교정 정보 저장 상자 대화 상자 확인 합니다.
    참고: 저장 공간 보정을 포함 하는 이미지 메타 데이터 수집 프로그램 간에 달라질 수 있습니다. 피지15, 파이프라인에 의해 사용 하는 기본 소프트웨어 가장 일반적인 이체를 이해 한다. 중요 한 정보를 기록 하는 픽셀 높이, 너비, 및 관련된 장치입니다.
  7. 어느 모바일 단계를 사용 하 여 또는 수동으로 접시 자체를 이동, 이전 이미지를 왼쪽에서 오른쪽과 오른쪽에서 왼쪽으로 사이 격판덮개; 아래로 이동 하는 경로 다음 중복 되지 않는 다른 지역 선택 로 알려진 ' lawnmower 검색 무늬 '. 3.6 단계를 반복 하 여 충분 한 이미지 캡처 적어도 500 시각적으로 예상된 입자, 더는 더 나은 생산 됩니다.
    참고: 대안 패턴 (예:., 원형, 임의의) 허용 하지만 보고 되어야 한다. 디지털 봉합 생산 통해 모자이크에 조합에 대 한 여러 개의 겹치는 이미지 획득 결과 파일 크기는 크게 다운스트림 처리와 바느질에서 유물을 방해 소개 될 수 있습니다 하 고 현재 권장 되지 않습니다.
  8. 잠재적인 후속 이미징에 대 한 이미지 분석 후 때까지 접시를 유지 합니다. 마지막 영상, 후 생물 폐기물에 대 한 적절 한 폐기.

4. 측정 하 고 분석 하는 입자 실루엣

  1. 필요한 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 설치
    1. 피지를 설치 (지침에 국립 보건원의 ImageJ v1.52e의 향상된 된 버전: https://imagej.net/Fiji/Downloads
    2. 지침에 따라 이미 존재 하지 않을 경우 git를 설치: https://git-scm.com/downloads
    3. Git 저장소16을 복제 하 여 입자 분석 코드를 취득 합니다.
      1. 명령줄에 입력 하 여 코드의 최신 버전을 검색:
        git 클론 https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
        1. 분석 코드 다음 README.md 텍스트 파일에 있는 지침은 복제 저장소의 최상위 디렉터리에 설치 합니다.
          참고: git을 사용 하는, 최신 버전의 코드를 자동으로 검색 됩니다. Git를 사용할 수 없는 경우 그것은 또한에서 릴리스 페이지에 zip 파일로 코드 다운로드 수: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
    4. 선택적 매개 변수와 함께 처리 하는 디렉터리를 나열 하는 텍스트 파일을 편집 합니다. 매개 변수 및 예제 목록에 대 한 예/분석 하위 디렉터리를 참조 하십시오.
  2. 입력 하 여 명령줄에서 분석을 실행 합니다.
    < 피지-경로 > \ImageJ-win64.exe-콘솔-매크로 SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
    여기서 < 피지-경로 > ImageJ win64.exe가 있는 디렉토리와 < paramsfile > 분석 설치를 설명 하는 텍스트 파일의 위치는
    참고: 실행 파일의 이름을 달라질 수 있습니다, 따라서 운영 체제 피지에 설치. 수와 이미지의 크기에 따라 분석 시간 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 그리고 자동으로 실행 됩니다.
  3. 품질 관리 검사를 수행
    1. 지정 된 출력 디렉터리의 오버레이 하위 디렉터리에 있는 품질 관리 파일을 검사 합니다. 스 퓨 리 어스, 누락, 그리고 저조한 캡처된 입자, 모든 배경 일치 하지 않는 회색된 윤곽선으로 명백한 이미지 note 같은 예제 그림 3 을 참조 하십시오. 입자 자료는 이제 실험 관련 분석 그림 생성에 대 한 준비.
  4. 유명한 파일 및/또는 입자 무시 하 Id 분석 코드에 지정 하 여 전체 접시 또는 개별 입자를 거부 합니다. 예제/검열 관련 연구 및 Python 코드 저장소에서를 참조 하십시오.
  5. 각 이미지에 지정 된 출력 디렉터리의 결과 하위 디렉터리에 깔끔한12 쉼표로 구분 된 텍스트 파일 저장에 대 한 이미지 분석 결과 사용 하 여 실험 구체적인 수치를 생성 합니다. 결과 파일을 읽는 방법의 예제를 보려면 예제/인물/R 및 예/인물/파이썬 하위 디렉터리를 참조 하십시오.

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Representative Results

생성 된 파일
그림 1 에 나와 있는 프로세스 분석 이미지 당 두 개의 파일을 생산할 예정 이다. 첫 번째 파일은 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 텍스트 파일 개별 입자에 해당 하는 각 행과 열 영역, 순환 성, 견고성 등 다양 한 입자 통계 설명 ImageJ 수동17에 정의 된. 예제 CSV 파일 추가 정보 및 예제/데이터 디렉터리에 포함 됩니다.

Figure 1
그림 1: 프로토콜의 4 개 주요 단계를 설명 하는 그래픽 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

두 번째 파일 GIF 이미지 파일을 오버레이 그림2 원래 식별 반투명 지역 대표 이미지 입자와 품질 관리 (QC)에 사용 하기 위해 만들어진 것입니다. 입자 식별 및 세그먼트화의 품질 신속 하 게 수동으로 평가 다음 수 있습니다. 입자 임계 처리 방법 이지만 완벽 한18, 그림 2 는 수락 가능한 결과의 한 예로 제공 됩니다. 품질 이미지 탈환, 하거나 충분 한 데이터를 사용할 수, 단순히에서 제거 추가 처리 될 수 합니다.

Figure 2
그림 2: 품질 관리 (QC) gif 이미지 분석 파이프라인에 의해 생성의 예. 주요 이미지 15 x의 확대입니다. 발췌는 디지털 이미지에서 개별 입자를 식별 하는 숫자를 표시 하도록 확대 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

QC 이미지를 평가할 때 가지 세 가지 일반적인 오류 발견
1. 입자 경계에 정확 하 게 준수 하는 실패
2입니다. 입자를 식별 하기 위해 실패
3. 유물 포함을 인해: 비 입자 구성 요소 (예: 거품), 또는 임계 처리에서 오류

이 오류의 예는 그림 3에서 설명 됩니다. 불 쌍 한 입자 경계 식별 및 세그먼트화 종종 입자 사이 그림 3a에서보듯이-죽음의 결과 이다. 불 쌍 한 조명 입자 (그림 3b, 파란색 단색 원)와 인 위 거짓 입자 (그림 3b, 빨간 점선된 원) 식별 하 두 실패 발생할 수 있습니다. 비 입자 문제가, 거품, 원생 동물, 균 류, 등 metazoans, 같은 그림 3 c에서 tardigrade 또한 가짜로로 식별할 수 있습니다 입자.

Figure 3
그림 3: 품질 관리 분석 하는 동안 검색 하는 일반적인 오류. () 불 쌍 한 입자 경계 탐지. (b) 스 퓨 리 어스 입자 (빨강 파선된 타원) 그리고 돌아가려면된 입자 (블루 솔리드 타원). (c) 비-이물질 개체입니다. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

전체 이미지를 거부 하는 것이 쉽습니다. 그러나, 그것은 품질 관리 이미지에 입자 식별자를 사용 하 여 (그림 2, 삽입) 개별 입자를 거부 하. 이 방식은 특히 유용 문제 (비 입자 포함) 등 기타 유용한 이미지에서의 경우 그림 3 c. 예 하의 이렇게 재현할 수 및 보고 방식에 포함 됩니다 github 저장소의 예제/검열 디렉토리.

작은 최소 직경 지정 된 경우 (< 10 픽셀), 이미지 노이즈를 가짜로 입자로 식별 될 수 있습니다. 이러한 경우에, 이미지 수 여전히 허용 있을 수 있습니다 추가 다운스트림 분석은 제거 하는 때 그들의 존재. 미만 ~ 200 픽셀19의 입자를 구성 하는 경우으로 셰이프 데이터 회의론으로 처리 한다.

그림 세대
이미지 분석에서 결과 CSV 파일 깔끔한12 및 수 있습니다 쉽게 결합 하 고 분석 연구원의 선호 하는 소프트웨어 패키지에 (ggplot2와 파이썬 또는 dplyr22 seaborn21 팬더20 같은23 r에서). 그러나, 필요한 정확한 그림 유형 연구 질문 및 결과 반드시 달라 집니다. 가능한 그림의 예 (그림 4) 아래 포함 되어 있으며 CSV 파일에서 그것을 생성 하기 위해 해당 코드를 사용할 수 github16에.

Figure 4
그림 4: 실험 관련 그림 이미지 파이프라인에 의해 생성 하는 CSV 데이터에서 생성의 예. 이 예제에서는 시간이 지남에 따라 두 실험 원자로 사이 입자 분포는 표시 하 고 연구원에 의해 질적 메타 데이터와 결합. 생성 코드 및 데이터에 대 한 예/인물/R을 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이미지 분석 시스템은 상당히 강력 하 고 불 쌍 한 이미지 제거 되도록 품질 관리 조치는, 비록 샘플링, 접시 준비, 및 이미지 수집에 특정 문제에 적절 한 관심을 향상 시킬 수 모두 데이터의 정확도의 비율 이미지 품질을 전달 합니다.

샘플링 농도
대표 하는 샘플 촬영 되었습니다 가정, 가장 중요 한 단계는 충분 한 입자는 입자 겹치는 그리 집중 하는 동안 대표9 와 효율적인 분석을 위한 존재입니다.

이 총 중단된 한 고체의 넓은 범위에 약 0.5 ~ 2 mL의 혼합된 액에 대응 있다 하지만 실험 관련 결정 할 수 있습니다. 지나치게 집중의 예는 지나치게-희석, 그리고 적절 한 입자 농도 기준으로 그림 5 에 나와 있습니다. 얼룩은 또한 영향을 입자 농도. -희석 지나치게 스테인드, 모호한 입자 밑 희석 최적의 임계 처리에 대 한 충분 한 대비와 입자를 생산 하지 않을 수 있습니다 발생할 수 있습니다.

Figure 5
그림 5: 참조 이미지 표시 입자 농도 너무 집중, 허용, 및 지나치게 희석. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

염료 농도
얼룩 샘플에 추가 금액은 중요 하 고 정확한 금액 sludges 사이 다를 수 있습니다. 샘플의 0.5 ~ 2 mL 당 1% (w/v) 메 틸 렌 블루의 약 5 µ L '출혈'과 입자의 모양을 왜곡 없이 임계 처리에 대 한 충분 한 대비를 제공 합니다.

거기는 아무 단일 이상적인 농도; 명암과 선명도 사이의 균형을 선택 해야 합니다. 그림 6 에서는 슬러지의 2 mL 당 1% 메 틸 렌 블루의 5, 25 및 50 µ L로 얼룩진 3 샘플에서이 거래를 보여 줍니다. 이 거래와 무게 때 가끔 저조한 대조 입자 (그림 6a) 이다 선호 제대로 확인할 blob (그림 6c).

Figure 6
그림 6: 증가 얼룩 농도 입자 대비 향상 하지만 관찰된 경계 왜곡. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

플레이트 스토리지
동원 정지, 후 적어도 3 일 동안 냉장 (4 ° C)에서 접시를 저장할 수 있습니다. 이것은 보수 기간 동안 그것은 성장과 염료 확산 오염 발생 합니다. 접시 아래에 설명 된 문제를 표시 하지 아직도 3 일 후에 몇 군데 있습니다. 너무 오랫동안 저장 하는 경우 기존 입자 수 있습니다 계속 성장 하 고 것입니다 그림 7a에서 볼 수 있는 얼룩의 색조를 유지 하면서 다른 입자의 초점면에 나타납니다. 곰 팡이 포자와 같은 표면 오염 물질 또한 스토리지의 긴 기간 후에 성장할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 얼룩의 색상을 차지 하지 것입니다 하 고 그림 7b에서 볼 수 있듯이 다른 초점 평면에 나타납니다. 경우에 따라 자라 난 또는 얼룩의 발생 여부 불분명, 같은 그림 7b의 아래와 그림 7 c의 센터 이다. 원인에 그 등 접시는 그것의 유용한 수명을 넘어 세 표시

Figure 7
그림 7: 참조 이미지 자라 난 접시의 유용한 수명을 넘어 저장 된 신호를 보여주는. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

접시 준비
육체적으로 준비 하는 한 천 배지-지나치게 두꺼운 천 및 과도 한 소용돌이와 관련 된 두 가지 문제가 있다. 첫 번째 경우 (그림 8), 입자 대부분 초점에 입자의 이미지를 취득 하 고 어려운 다양 한 깊이에 중단 될.

Figure 8
그림 8: 과도 한 양의 agar 사용 하 여 모호한 입자 결과로 초점면 보다 두꺼운 샘플을 생산할 예정 이다. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

두 번째 경우에서 접시의 다른 섹션에서 결과 바이어 싱 입자 (그림 9a)의 비 균등 분포를 생성 소용돌이 (그림 9b, c. 일반적으로, 더 이상 7 mL agar의 100 mm 페 트리 접시를 커버 하는 데 필요한 하 고만 부드러운 손 동작 균등 하 게 요리를 커버 하는 데 필요한.

Figure 9
그림 9: 접시 준비 하는 동안 지나치게 격렬 한 소용돌이 비 균일 입자 분포 (a), 바이어 싱 쪽으로 더 큰 (b)와 (c) 입자 작은 접시의 섹션으로 표시 됩니다. 접시는 100 밀리미터 직경, 현미경 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

현미경 이미징
품질에 영향을 미치는 두 가지 주요 이미지 수집 문제 있다. 첫 번째 문제는 대부분 입자의 초점면에 있는 보장 합니다. 낮은 확대에 조차 많은 활성된 슬러지 입자의 크기는 조 악한 초점을 약간 조정 없이 많은 입자 것 약간 초점, 부정확 한 입자 측정을 소개. 이미지가는 100% 완벽 하 게 초점을 맞춘 입자; 포함 됩니다. 그림 8그림 5b 가난 하 고 수락 가능한 초점의 각각 예입니다.

노출 수준 구성 두 번째 주요 문제. 손실 된 데이터와 가난한 세분화11이미지 결과 제대로 노출. 또한, 염료의 고대비 데이터의 유효 동적 범위 감소, 좁은 막대 그래프를 생성할 수 있습니다. 불 쌍 한 노출 방지와 동적 범위를 증가 하는 이미지를 캡처 전에 히스토그램의 상위 및 하위 범위를 조정할 수 있다. 예의, 아래, 그리고 허용 노출 포함 됩니다 아래 그림10에서.

Figure 10
그림 10: 참조 이미지 보여주는 가난 하 고 허용 이미지 노출입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 방법의 장점은 그것 제공 하는 전체 프로세스를 포괄 하는 특정 조건입니다. 또한, 우리는 소프트웨어 파이프라인 내에서 실험실 분석을 완화 하 고 추진 연구실 사이 비교 데이터 제공. 이 방법의 주요 한계는 그 초점을 맞춘 모든 입자를 계속 필요가 방지 높은 배율, 작은 작은 크기-특히 filamentous 구조와 입자에 대 한 자사의 유틸리티 제한. 이 방법의 미래 방향 고급 이미지 분석 기법 (특히 소음 감소24,25, 높은 동적 범위 이미징, 초점 스태킹26,27및 기계 학습을 통합할 수 있는 보조 임계 처리, 세분화, 및 분류28 주요 이미지 수집 개선 기계 단계8 을 제어 하 고 '전체 접시' 모자이크 아카이브 생성 소프트웨어를 통합할 것 이다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 국립 과학 재단 CBET 1336544에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

피지, R 및 파이썬 로고 다음 상표 정책에 따라 사용 됩니다.
파이썬: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ 에 나열 된 참조에 의해 SA 4.0 라이센스 당: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
피지: https://imagej.net/Licensing

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bleach solution Chlorox 31009 For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap Corning 430790 Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask Corning 4980-50 Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle Kimble-Chase 14395-50 Or otherwise sufficient for agar handling
Agar BD 214010 Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software N/A N/A R or Python are suggested
Deionized water N/A N/A Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer N/A N/A Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive Seagate STEB5000100 Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI NIH version 1.51d Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT Open Source version 2.19.1 or later Available at: https://git-scm.com/
Image capture software ToupView version 3.7.5177 Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage OMAX A512 Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue Fisher M291-100 Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera OMAX A35140U Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer OMAX A36CALM1 Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm Fisher FB0875712 1 per sample.
PPE N/A N/A Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro NCSU version 0.2.1 Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope Nikon SMZ-2T Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.

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References

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형태와 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인 Agar에 움직일 활성된 슬러지 입자의 크기 측정
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Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).More

Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).

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