Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Измерение на форму и размер частиц ила, иммобилизованных в Агаре с открытым исходным кодом программного конвейера

doi: 10.3791/58963 Published: January 30, 2019

Summary

Размер и форма частиц ила являются важными параметрами, которые измеряются с помощью различных методов. Неточности возникают от нерепрезентативная выборка, субоптимальный изображения и параметры субъективного анализа. Чтобы свести к минимуму эти ошибки и облегчения измерения, мы представляем протокол, указав каждый шаг, в том числе открытым исходным кодом программного конвейера.

Abstract

Экспериментальная биореакторов, например те обработки сточных вод, содержат частицы, размер и форма которого являются важными параметрами. Например размер и форму хлопьев ила может указывать условия в микромасштабные, а также непосредственно влияют на насколько хорошо Ил оседает в отстойник.

Размер частиц и формы являются оба измерения, ошибочно «простой». Многие тонкие вопросы, зачастую нерешенными в неофициальных протоколов, могут возникнуть, когда выборки, обработки изображений и анализа частиц. Методы выборки может быть искажена или не обеспечивают достаточно статистической мощности. Образцы, сами могут быть плохо сохранились или претерпевают изменения во время иммобилизации. Изображения не может быть достаточно высокого качества; перекрывающиеся частицы, глубина резкости, масштаб и различных шума можно все производят плохие результаты. Плохо указанного анализа можно ввести предвзятости, например, производимый вручную изображения ограничивание и сегментации.

Доступность и производительность желательно вместе с воспроизводимостью. Метод доступным, высокая пропускная способность может позволить более частое измерение частиц, производить много изображений, содержащих тысячи частиц. Метод, который использует недорогие реактивы, общие рассечения микроскопа и свободно доступных открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа позволяет повторяемые, доступной, воспроизводимые и частично автоматизированных экспериментальные результаты. Кроме того продукт такого метода может быть хорошо отформатированный, четкие и легко понять, программное обеспечение для анализа данных, облегчения анализов в лаборатории и обмена данными между лабораториями.

Мы представляем протокол, который подробно описаны шаги, необходимые для производства такой продукции, включая: отбор проб, образец подготовки и иммобилизации в агар, приобретения цифровых изображений, анализ цифровых изображений и примеры конкретного эксперимента рисунок поколения от результаты анализа. Мы также включили конвейера анализа данных открытым исходным кодом поддерживают этот протокол.

Introduction

Этот метод предназначен для предоставления четко, повторяемые и частично автоматизированный метод для определения размера и формы распределения частиц в биореакторах, особенно те, которые содержат ила хлопьев и аэробных гранул1 , 2. обоснование этого метода были для повышения доступности, простоты, пропускная способность, и повторяемость наших существующих собственных протоколов3,4, облегчения измерения частиц для других и содействовать обмену и Сравнение данных.

Существует две широкие категории анализа измерения частиц - прямой визуализации и логически выведенная методы, с помощью таких качеств, как рассеяние света5. Хотя логически выведенная методы могут быть автоматизированы и имеют большой пропускной способности, оборудование стоит дорого. Кроме того хотя логически выведенная методы можно точно определить эквивалентный размер частиц6, они не дают подробную форму информации7.

Из-за необходимости данных фигуры на прямых изображений основе наш метод. Хотя существуют некоторые методы визуализации высокой пропускной способности, они традиционно требовали дорогостоящих коммерческих аппаратных или пользовательские построен решения8,9. Использовать общие, доступного аппаратного и программного обеспечения, что, хотя страдает от снижения пропускной способности, производит гораздо больше изображений частиц, чем минимально необходимой для многих анализов10был разработан наш метод.

Существующие протоколы, может не указывать важные выборки и изображения приобретение шаги. Другие протоколы могут указать вручную, которые вводят субъективные уклоном (такие как ad hoc Бинаризация11). Четко определенный метод, определяющий выборки, иммобилизации и изображения приобретение шаги, в сочетании с свободно доступных анализ программного обеспечения позволит повысить в лаборатории анализа изображений и сравнение между лабораториями. Основная цель настоящего Протокола заключается в рабочий процесс и инструменты, которые должны привести к воспроизводимость результатов от различных лабораторий для того же образца.

Отдельно от нормализации процесса анализа изображения, данные, подготовленные этот трубопровод записывается в четко определенных, хорошо отформатированный файл12 , пригодные для использования популярных данных анализа пакетов13,14, ослабление эксперимент конкретные анализы (например, пользовательские рисунок поколения) и облегчения обмена данными между лабораториями.

Этот протокол особенно предлагается для исследователей, которые требуют данные фигуры частиц, не имеют доступа к логически выведенная методы, не хотите, чтобы развивать свои собственные изображения анализа трубопровода и хотели бы поделиться своими данными легко с другими

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. сбор образцов для анализа частиц

  1. Определить объем образца для конкретных реакторов, которые будут производить достаточно частиц для статистического анализа10 (> 500) избегая дублирования частиц.
    1. Предположим, что диапазон от 0,5 до 2 мл на образце смешанной ликер достаточно для проб ила с смешанной ликер приостановлено твердых (MLSS) между 250 и 5000 мг/л.
    2. В противном случае Подготовьте три плиты агара тест, используя 0.5, 2 и 5 мл образца (шаги 1.2 через 2.7).
    3. Визуально определить, какие (если имеются) лучший образец тома удовлетворяют критериям, перечисленные на этапе 1.1.
    4. Если частицы по-прежнему перекрываются для образца 0,5 мл, повторите шаги 1.1.2 и 1.1.3 с трех образцов 0,5 мл разбавляют добавлен 0,5, 1 и 2 мл фосфатный буфер для определения степени, в какой 0,5 мл образца должны быть разбавлен до шаг 2.1.
      Примечание: Шаги 1.1 − 1.1.4 должны выполняться только один раз за эксперимент, или если реактор содержание изменений, таким образом, что последующие измерения больше не отвечают критериям, указанным в шаге 1.1.
  2. Приобрести репрезентативной выборки из перемешанных часть реактора, хватая ~ 40 мл в стакан или 50 мл пластиковых пробирок, нежно смешивания и сразу же заливки образца определяется объем перемешанных самосхвата в пластиковых пробирок 15мл. Разбавьте образца, необходимо, как определяется шагом 1.1.4.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и образец может храниться в холодильнике (4 ° C) до 48 часов. Не замораживать образца.
    Предупреждение: Общий сохранение СМИ (например, формальдегид/формамид) не подходят. Большая площадь поверхности пластины, в сочетании с открытым контейнером, тепло от источника света и потенциально плохо вентилируемых микроскопии установки производят излишне опасные условия для мало пользы в качество изображения.

2. Подготовьте плиты агара окрашенных, подвижности частиц

  1. 5 мкл Метиленовый синий 1% (w/v) для каждого образца, затем крышки и осторожно перевернуть на 3 наименее раз перемешать. Разрешить образцы пятно для по крайней мере 5, но не более 30 минут при комнатной температуре.
  2. Подготовьте примерно 10 мл на сэмпл 7,5% (w/v) агар в деионизированной воде.
    Примечание: Агар может производиться досрочно и хранится бесконечно, если стерилизацию. Агарозы может быть заменен, но не существенно улучшить изображения.
  3. Расплавьте агар с помощью микроволновой печи или водой ванну и слегка охладите перед использованием. Обеспечить агар полностью растаял и льет легко. Твердые шарики агар будет по-разному, пятно, производство низкое качество изображения.
  4. Передачи достаточных расплавленный агар 7,5% (w/v), для пластиковых пробирок довести объем всего трубки до между 6.5 и 9 мл.
  5. Повторение пробирок и осторожно перевернуть по крайней мере 3 раза смешивать.
  6. Отмечая крышку от себя или в капюшоне, откройте крышку. Залейте содержимое трубки в 100 мм пластиковая Петри блюдо во время осторожно тряся блюдо для достижения полной, гладкие покрытия и визуально равномерное распределение частиц.
    Предупреждение: Тепла от агар может производить небольшое избыточное давление в трубе. Это часто производит слышен свист и имеет потенциал, чтобы изгнать маленькие капельки горячей агара.
  7. Разрешить пластины остыть при комнатной температуре в течение по крайней мере 5 минут, до тех пор, пока агар затвердевает.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Магазин покрытием перевернутый и опечатаны (например, в герметизации пластиковый пакет или с парафином фильм) на срок до 48 часов в холодильнике (4 ° C).

3. получить частицы изображения с помощью стереомикроскопом и цифровой камеры

  1. Место открытые пластины лицом вверх на микроскопа стереомикроскопом способны 10 x 20 x увеличение. Освещают образца ниже даже, рассеянный свет, с использованием оборудования, таких как светодиодные подсветки Стенд или подсветки номерного знака.
  2. Откройте программное обеспечение захвата изображения, убедитесь, что на пути света микроскоп для фотои нажмите на соответствующую камеру из списка камеры.
  3. Отрегулируйте Микроскоп, так что несколько частиц появляются в программном обеспечении в фокальной плоскости с большой, четко определенными краями. Используйте масштаб x 10-20 для измерения частиц при сохранении относительно глубоких фокальной плоскости.
    1. Временно удалить пластину агар и место микрометра на сцене. Отрегулируйте фокус штраф, до тех пор, пока выпускные на микрометра появляются четко обозначенных в программное обеспечение захвата изображения.
    2. Если калибровка не ранее, запишите пиксель микро соотношение для текущего масштаба.
      1. Установить масштаб 100%, нажав Zoom > фактический размер и выберите опции > Калибровка затем выравнивание панели красный калибровки в основные просмотра вдоль длинной оси микрометра, с вертикальные полосы, сосредоточены на 0 и 200 мкм градации. В диалоговом окне калибровки введите текущий уровень увеличения и фактическую длину 200 мкм.
    3. Если уже калиброванные выберите масштаб из строки меню, и выберите текущий масштаб уровня и подтверждения калибровки.
      1. Выберите измерения > линия > произвольных линии. Нажмите на пересечении 0 градации и длинной оси микрометра. Снова нажмите на пересечении в 200 и длинные оси. A правильной калибровки должно отображаться примерно 200 µm. удалить строку, нажав на него, нажатие удалить и нажмите Да в окне подтверждения.
        Примечание: Инструкции для выбора камеры и калибровки являются специфическими для программного обеспечения, используемого для данного оборудования. Аналогичные функции должны быть доступны в других изображений. Цель заключается в том, чтобы определить пикселя микрон соотношение изображения для измерения размера точной частиц.
  4. Замените пластину агар и настроить фокус штраф для достижения максимальной детализации в визуализации программного обеспечения.
  5. Отрегулируйте изображений программное обеспечение, так что качество изображения максимум достигается.
    1. Увеличьте разрядность максимальное значение разрешено, выбрав кнопку-переключатель на панели Битовую глубину боковой панели камеры . Установите программное обеспечение для получения изображения в оттенках серого, выбрав соответствующий переключатель на панели Серый цвет боковой панели камеры .
    2. Сверните все открытые боковой панели между воздействием и гистограммы. Уменьшить коэффициент усиления до 1.0 и увеличить экспозицию, пока не появится четкое изображение в видовом экране и до тех пор, пока появится гистограмма как распределение, которое не закреплены на концах поля гистограммы.
    3. Настройте гистограмму чтобы избежать над и недодержки. В панели гистограммы боковой панели камеры слайд левая граница гистограмма просто вне наименьшие значения и правая граница просто за пределами высшие ценности.
  6. Сохранить изображение как несжатые TIFF, включая увеличение информацию в метаданных изображения, используя Файл > Сохранить как диалоговое окно, выбрав формат TIFF и обеспечение того, чтобы поле сохранить информацию калибровки проверяется.
    Примечание: Сохранение метаданных изображения, включая пространственные калибровки, может варьироваться между приобретение программы. Фиджи15, базового программного обеспечения, используемого в конвейер, понимает наиболее распространенные варианты. Важная информация для записи является пикселей высота, ширина и связанные устройства.
  7. С помощью либо мобильная сцена или ручное перемещение пластину, сам, выберите другую область, которая не перекрываются предыдущих изображений, следуя по пути, который переключается между слева направо и справа налево как один движется вниз плита; также известен как «газонокосилку шаблон поиска». Повторите шаг 3,6 до тех пор, пока достаточно изображений производится захватить по меньшей мере 500 визуально оценкам частицы, более лучше.
    Примечание: Альтернативные шаблоны (например., циркуляр, случайные) являются приемлемыми, но должно быть сообщено. Приобретение нескольких перекрывающихся изображений для комбинации в мозаику через цифровой сшивание производит итоговый размер файла, который значительно препятствует последующей обработки и артефакты из строчки могут быть введены и в настоящее время не рекомендуется.
  8. Сохраняют пластины до тех пор пока после анализа изображений для потенциальных последующей обработки изображений. После окончательной обработки изображений, отбросить как подходящие для биологических отходов.

4. измерения и анализа частиц силуэты

  1. Установка пакетов программного обеспечения анализа необходимых изображений
    1. Установить Фиджи (расширенная версия национальных институтов здравоохранения ImageJ v1.52e следуя инструкциям в: https://imagej.net/Fiji/Downloads
    2. Установить git, если еще не установлены, следуя инструкциям на: https://git-scm.com/downloads
    3. Получить код анализа частиц от клонирования репозитория git16.
      1. В командной строке получить последнюю версию кода, введя:
        git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
        1. Установите следующий код анализа, инструкции в текстовом файле README.md найти в каталоге верхнего уровня клонированного репозитория.
          Примечание: Использование git является предпочтительным, поскольку он будет автоматически получить последнюю версию кода. Если git не доступно, это также можно скачать код zip-файл на странице выпуска на: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
    4. Измените текстовый файл со списком каталогов для обработки, а также необязательные параметры. Обратитесь к подкаталог примеров/анализ для списка параметров и примеры.
  2. Запустите анализ на командной строке, введя:
    < Фиджи-путь > \ImageJ-win64.exe--консоли - макрос < paramsfile > SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis
    где < Фиджи путь > — это каталог, в котором находится ImageJ-win64.exe и < paramsfile > местоположение текстового файла, описывающий настройки анализа
    Примечание: Имя исполняемого файла может отличаться, в зависимости от операционной системы Фиджи установлен на. В зависимости от количества и размера изображений анализ может занять несколько минут до часов и будет запускаться автоматически.
  3. Выполните проверку контроля качества
    1. Просмотрите файлы контроля качества, расположенный в подкаталоге оверлея в указанный выходной каталог. Обратите внимание на изображения с ложные, пропущенных и плохо захваченные частицы, все ясно как затененный контуры, которые не соответствуют фон. Для примеров таких обратитесь к рис . Данные частицы теперь готовы для анализа конкретного эксперимента рисунок поколения.
  4. Отвергать весь пластин или индивидуальных частиц, указав в анализ кода отметил файлов и/или частиц идентификаторов игнорироваться. Обратитесь к примеры/цензура в репозитории для соответствующих R и Python кода.
  5. Генерировать конкретные цифры эксперимент с использованием результатов анализа изображения, для каждого изображения хранятся в АККУРАТНЫЕ12 запятыми текстовый файл в подкаталог результатов в указанный выходной каталог. Обратитесь к примеры/цифры/R и примеры/цифры/Python подкаталоги для примеров о том, как читать файлы результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Файлы, созданные
Этот процесс показан на рисунке 1 будет производить два файлов для каждого изображения проанализированы. Первый файл — запятая запятыми значения (CSV) текстовый файл, где каждая строка соответствует отдельных частиц и столбцы описывают различные метрики частиц как области, цикличность и солидность и определено в ручной ImageJ17. Пример CSV-файлы включены, справочная информация, а также в справочнике примеры данных.

Figure 1
Рисунок 1: Описание четырех основных этапов протокола графический рабочий процесс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Второй файл предназначен для использования в контроля качества (КК) и изображения GIF файла которого оверлеи оригинальные изображения с полупрозрачным представляющих регионы определены частицы, как показано на рисунке 2. Можно затем быстро вручную оценить качество идентификации частиц и сегментации. Хотя метод ограничивание не частиц является идеальным18, на рисунке 2 представлен как пример приемлемого результата. Плохое качество изображения может быть отбит, или если имеется достаточно данных, просто удалены из дальнейшей обработки.

Figure 2
Рисунок 2: Пример контроля качества (QC) gif, генерируемые изображения анализа трубопровода. Увеличение основного изображения 15 x. Выдержка цифровой масштаб чтобы показать номера идентификации индивидуальных частиц в изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

При оценке качества изображения, существует три распространенных ошибок найдено:
1. неспособность точно соответствовать границам частиц
2. в случае выявления частиц
3. артефакт включение должное либо: компоненты-частиц (например, пузыри), или ошибки в порог

Примеры этих ошибок приведены на рисунке 3. Бедные частиц границы идентификации и сегментация между частицами часто является результатом чрезмерно смерти, как показано на рис 3А. Плохое освещение могут привести к как неспособность выявить частиц (рис. 3Б, синий твердых круг) и артефакт ложных частиц (рис. 3Б, красной пунктирной окружности). Non частица вопрос, как пузыри, простейших, грибков и размером, такие как тихоходки на рис. 3 c может также быть ложный определены как частицы.

Figure 3
Рисунок 3: Распространенные ошибки, обнаруженные в ходе анализа КК. () обнаружения границ бедных частиц. (b) ложные частицы (красная пунктирная эллипс) и сегментацией частиц (синий твердых эллипс). (c) иностранных частицы объект. Увеличение 15 x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Это легче отклонить все изображение. Однако, это можно использовать идентификатор частиц в изображении КК (рис. 2, вставкой) отклонить отдельные частицы. Этот подход особенно полезен, когда есть несколько вопросов, в противном случае полезные изображения (например, включение-частиц) рис. 3 c. Примеры делать так воспроизводимость и отчетные образом включены в справочнике примеры/цензура хранилище github.

Когда указан маленький минимальный диаметр (< 10 пикселов), шум изображения могут быть ложный определены как частицы. В тех случаях, изображение может быть по-прежнему приниматься при далее вниз по течению анализ удаляет их присутствие. В качестве ориентира данные фигуры должны рассматриваться с скептицизмом когда частицы состоят из менее ~ 200 пикселей19.

Рисунок поколение
CSV-файлы, вытекающие из анализа изображений Tidy12 и могут быть легко объединены и проанализированы в исследователь предпочтительный программного пакета (например20 панд с seaborn21 22 Python или dplyr с ggplot223 в R). Однако с вопросами исследований и результат обязательно поменяет необходимый тип точную цифру. Пример возможной Рисунок приведен ниже (Рисунок 4) и соответствующий код для создания из CSV-файлов доступна на github16.

Figure 4
Рисунок 4: Пример конкретного эксперимента рисунок создается из данных CSV, производимые изображения трубопровода. В этом примере распределения частиц между двух экспериментальных реакторов со временем отображаются и в сочетании с качественной метаданных, отмечает исследователь. Смотрите примеры/цифры/R для генерации кода и данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя системы анализа изображений достаточно надежными и КК шаги для обеспечения бедных изображения удаляются, надлежащее внимание конкретным вопросам в выборки, пластины подготовки и загрузки изображений может повысить точность данных и доли изображения, передавая КК.

Концентрация выборки
Предполагая, что получения репрезентативной выборки, наиболее важным шагом является обеспечение достаточных частицы настоящий представитель9 и эффективного анализа, хотя не настолько сосредоточены, что частицы перекрываются.

Это соответствует приблизительно 0,5-2 мл смешанных спиртных напитков в широком диапазоне общего взвешенных веществ, но эксперимент конкретного определения могут быть необходимы. Примеры слишком концентрированной, чрезмерно - разбавленный, и концентрации частиц соответствующие приводятся в рисунке 5 в качестве ссылки. Окрашивания зависит также от концентрации частиц. Чрезмерная разрежения может привести к чрезмерно окрашенные, размытые частиц в то время как заместитель разрежения не может производить частицы с достаточным контрастом для оптимального порога.

Figure 5
Рисунок 5: Ссылка изображений показаны концентрации частиц, которые слишком концентрированный, приемлемыми и чрезмерно разбавленным. Увеличение 15 x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Концентрации красителя
Количество пятен, добавлен в образец имеет решающее значение и правильная сумма может варьироваться от шлама. Примерно 5 мкл 1% (w/v) Метиленовый синий 0,5 до 2 мл образца обеспечивает достаточного контраста для ограничивание не вызывая «кровь» и затемняя формы частиц.

Нет одного идеального концентрации; необходимо выбрать баланс между контрастность и четкость. Рисунок 6 иллюстрирует этот компромисс в трех пробах, окрашенных с 5, 25 и 50 мкл Метиленовый синий 1% 2 мл осадка. При взвешивании этот компромисс, иногда плохо контрастными частиц (рис. 6a) предпочтительнее, чем плохо различимыми капли (рис. 6 c).

Figure 6
Рисунок 6: Увеличение пятно концентрации улучшает контрастность частиц, но также искажает наблюдаемых границы. Увеличение 15 x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Тарелка хранения
После иммобилизации пластины может храниться в холодильнике (4 ° C) в течение 3 дней. Это консервативной период, в течение которого маловероятно, что произойдет заражение роста и окрашивания диффузии. Пластины, не показывая какой-либо из проблем, описанных ниже еще может быть imaged после 3 дней. При хранении слишком долго, существующие частицы могут продолжать расти и будет появляться в фокальной плоскости других частиц, сохраняя оттенок пятно, как видно из рис. 7a. Поверхностные загрязнители, например грибковых спор, может расти после длительного хранения. Эти вообще не будет занимать цвета пятно и будет отображаться в другой плоскости фокуса, как можно увидеть в рисунке 7b. В некоторых случаях это неясно ли дисбактериоз или распространение пятно произошло, таких, как центр рис. 7 cи в нижней части Рисунок 7b . Независимо от причины пятна, такие как те, указать, что пластины в возрасте за пределами ее полезной жизни

Figure 7
Рисунок 7: Ссылка изображения, иллюстрирующие разрастание, сигнализации, что плита был сохранен за пределами ее полезной жизни. Увеличение 15 x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Подготовка пластины
Есть две проблемы, связанные с физической подготовкой плиты агара - слишком толстые агар и чрезмерной закрученной. В первом случае (рис. 8) частицы становятся приостановлено на различных глубинах, что делает его трудно получить изображения с большинством частиц в фокусе.

Figure 8
Рисунок 8: С помощью чрезмерное количество агар будет производить образец толще, чем фокальной плоскости, что приводит к размытым частиц. Увеличение 15 x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Во втором случае, закрученной производит неравномерное распределение частиц (рис. 9а), стабилизатор результаты из разных секций пластины (рис. 9b, c. Как правило не более чем 7 мл агар обязан покрыть чашку Петри 100 мм и только движениями нежные руки необходимо равномерно покрыть блюдо.

Figure 9
Рисунок 9: Чрезмерно активные закрученного во время подготовки плита будет отображаться как неравномерного распределения частиц (), стабилизатор разделы пластины к больше (b) и меньше распределения частиц (c). Тарелка диаметром 100 мм, микроскопии 15 x увеличенное. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Микроскопических изображений
Существует два основных изображений приобретение вопросов, затрагивающих качество. Первый выпуск обеспечение того, что большинство частиц в фокальной плоскости. Даже при низком увеличении размер многих частиц ила такова, что без незначительные корректировки в грубой фокус, многие частицы будет слегка не в фокусе, представляя неточной частиц измерения. Изображение не будет содержать идеально сосредоточены 100% частиц; Рисунок 8 и Рисунок 5b являются соответствующие примеры деятельности бедных и приемлемым.

Уровни воздействия являются второй основной вопрос. Плохо подвергается изображения приводят к потере данных и бедных сегментации11. Кроме того высокая контрастность краситель может производить узкая гистограмма, снижение эффективного динамический диапазон данных. Верхняя и нижняя границы гистограммы может быть скорректирована до захвата изображения для предотвращения плохого воздействия и увеличить динамический диапазон. Примеры из над, под и приемлемые воздействия включены ниже на рисунке 10.

Figure 10
Рисунок 10: Ссылка изображений показаны бедных и приемлемый образ воздействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Преимущества этого метода являются, что он предоставляет конкретные критерии, охватывающих весь процесс. Кроме того мы предоставили программного конвейера ослабление в лаборатории анализа и содействия сопоставимости между лаборатории данных. Главным недостатком этого метода является необходимость сохранить все частицы сосредоточены предотвращает высоких увеличениях, ограничивая его полезности для частиц с небольшой незначительные размеры - особенно нитевидные структуры. Будущие направления данного метода могут включать методы анализа передовых изображения (специально шума снижения24,25, высокий динамический диапазон изображений, Фокус штабелирование26,27и машинное обучение помощь бинаризация, сегментации и классификации28. Улучшение приобретение основных изображений будет включать программное обеспечение для контроля механических этапов8 и производить «целую тарелку» мозаика архивов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грант от национального фонда науки CBET 1336544.

Фиджи, R и Python логотипы используются в соответствии с следующую политику товарного знака:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , согласно лицензии CC-BY-SA 4.0, перечисленные в: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Фиджи: https://imagej.net/Licensing

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bleach solution Chlorox 31009 For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap Corning 430790 Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask Corning 4980-50 Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle Kimble-Chase 14395-50 Or otherwise sufficient for agar handling
Agar BD 214010 Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software N/A N/A R or Python are suggested
Deionized water N/A N/A Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer N/A N/A Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive Seagate STEB5000100 Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI NIH version 1.51d Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT Open Source version 2.19.1 or later Available at: https://git-scm.com/
Image capture software ToupView version 3.7.5177 Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage OMAX A512 Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue Fisher M291-100 Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera OMAX A35140U Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer OMAX A36CALM1 Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm Fisher FB0875712 1 per sample.
PPE N/A N/A Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro NCSU version 0.2.1 Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope Nikon SMZ-2T Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167, (6), 1622-1640 (2012).
  2. Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26, (5), 411-423 (2008).
  3. Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004).
  4. Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012).
  5. Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91, (1), 168-175 (2001).
  6. Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7, (3), Available from: http://www.aapspharmscitech.org E1-E14 (2006).
  7. Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
  8. Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9, (2), e88977 (2014).
  9. Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15, (1), 64 (2016).
  10. Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70, (4), 2420-2428 (2004).
  11. Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16, (4), 639-667 (2010).
  12. Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59, (10), (2014).
  13. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. Available from: http://www.r-project.org (2017).
  14. van Rossum, G. Python tutorial. Amsterdam. CS-R9526 (1995).
  15. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018).
  17. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. National Institute of Health. (2012).
  18. Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13, (1), 146-166 (2004).
  19. Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
  20. McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. 51-56 (2010).
  21. Waskom, M., et al. seaborn: v0.5.0 (November 2014). (2014).
  22. Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016).
  23. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer-Verlag. New York. Available from: http://ggplot2.org (2009).
  24. Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18, (2), 91-128 (2004).
  25. Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256, (3), 231-236 (2014).
  26. Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. 225-232 (2012).
  27. Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3, (1), Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ 170-184 (2009).
  28. Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. 1-8 (2007).
Измерение на форму и размер частиц ила, иммобилизованных в Агаре с открытым исходным кодом программного конвейера
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).More

Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter