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Medicine

Präklinische Modell von Hind Limb Ischemia in diabetischen Kaninchen

Published: June 2, 2019 doi: 10.3791/58964
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2,4, 1,5,6,7
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Division of Cardiology, University of Texas McGovern Medical School, 3Center for Laboratory Animal Medicine and Care, UT Health Science Center at Houston, 4Memorial Herman Heart and Vascular Center, Texas Medical Center, 5Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 6The Institute for Computational Engineering and Sciences, University of Texas at Austin, 7Institute for Biomaterials, Drug Delivery and Regenerative Medicine, University of Texas at Austin

Summary

Wir beschreiben ein chirurgisches Verfahren, das zur indufären Ischämie bei Kaninchen mit Hyperlipidämie und Diabetes eingesetzt wird. Diese Operation dient als präklinisches Modell für Erkrankungen der peripheren Arterienerkrankung bei Patienten. Die Angiographie wird auch als Mittel zur Messung des Ausmaßes der eingeführten Ischämie und der Wiederherstellung der Perfusion beschrieben.

Abstract

Periphere Gefäßerkrankungen sind ein weit verbreitetes klinisches Problem, das Millionen von Patienten weltweit betrifft. Eine wesentliche Folge der peripheren Gefäßerkrankungen ist die Entwicklung von Ischämie. In schweren Fällen können Patienten eine kritische Gliedmaßen entwickeln, bei der sie ständige Schmerzen und ein erhöhtes Risiko für eine Amputation der Gliedmaßen erfahren. Zu den aktuellen Therapien für periphere Ischämie gehören die Bypass-Chirurgie oder perkutane Eingriffe wie Angioplastik mit Stelzierung oder Atherektomie, um den Blutfluss wiederherzustellen. Diese Behandlungen scheitern jedoch oft an der fortgesetzten Progression von Gefäßerkrankungen oder Restenosen oder sind aufgrund der insgesamt schlechten Gesundheit des Patienten kontraindiziert. Ein vielversprechender möglicher Ansatz zur Behandlung von peripheren Ischämie ist die Induktion der therapeutischen Neovaskularisierung, um dem Patienten die Möglichkeit zu geben, eine Kollateralvaskulatur zu entwickeln. Dieses neu gebildete Netzwerk lindert die periphere Ischämie, indem es die Durchblutung des betroffenen Gebietes wiederherstellt. Das am häufigsten angewandte präklinische Modell für periphere Ischämie nutzt die Entstehung von Hinterbein Ischämie bei gesunden Kaninchen durch Oberschenkelardenliga. In der Vergangenheit gab es jedoch eine starke Trennung zwischen dem Erfolg präklinischer Studien und dem Scheitern klinischer Studien über die Behandlung von peripheren Ischämie. Gesunde Tiere haben in der Regel eine robuste Gefäßregeneration als Reaktion auf chirurgisch induzierte Ischämie, im Gegensatz zu der verminderten Vaskularität und Regeneration bei Patienten mit chronischer peripheren Ischämie. Hier beschreiben wir ein optimiertes Tiermodell für periphere Ischämie bei Kaninchen, das Hyperlipidämie und Diabetes umfasst. Dieses Modell hat die Kollateralbildung und die Blutdruck-Soche im Vergleich zu einem Modell mit einer höheren Cholesterindiät reduziert. So kann das Modell eine bessere Korrelation mit menschlichen Patienten mit kompromittierten Angiogenese aus den gemeinsamen Ko-Morbiditäten, die periphere Gefäßerkrankungen begleiten, bieten.

Introduction

Die periphere arterielle Erkrankung (PAD) ist eine häufige Durchblutungsstörung, bei der das Fortschreiten der atherosklerotischen Plaque-Bildung zu einer Verengung der Blutgefäße in den Gliedmaßen des Körpers führt. Der jüngste Anstieg der Risikofaktoren für Atherosklerose, darunter Diabetes, Fettleibigkeit und Inaktivität, hat zu einer zunehmenden Prävalenz von Gefäßerkrankungen 1 geführt. Derzeit wird geschätzt, dass 12% – 20% der Gesamtbevölkerung über 60 Jahre alt sind, eine arterielle Erkrankung an derPeripherie haben. Eine wichtige Folge der peripheren arteriellen Erkrankung ist die Entwicklung von peripheren Ischämie, die am häufigsten in den unteren Gliedmaßen zu finden ist. In schweren Fällen können Patienten eine kritische Gliedmaßen Ischämie entwickeln, ein Zustand, in dem es aufgrund fehlender Durchblutung ständige Schmerzen gibt. Patienten mit kritischer Gliedmaßen haben eine 50-prozentige Wahrscheinlichkeit, dass ein Gliedmaßen innerhalb eines Jahres nach der Diagnose amputiert wird. Darüber hinaus haben Patienten mit Diabetes eine höhere Inzidenz von peripheren arteriellen Erkrankungen und schlechterenErgebnissennach Eingriffen zur Revaskularisierung 3,4. Zu den aktuellen Therapien für periphere Ischämie gehören perkutane Eingriffe wie Atherektomie und Stachel-oder chirurgische Umgehung. Für viele Patienten bieten diese Behandlungen jedoch nur kurzfristige Vorteile und viele sind nicht gesund genug für größere chirurgische Eingriffe. In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches Tiermodell zur Erprobung neuer Behandlungen, die auf periphere Gefäßerkrankungen abzielen und die die Entstehung von peripheren Ischämie bei Kaninchen durch chirurgische Ligation im Kontext des diabetischen Krankheitszustandes einbezieht.

Das Modell der Hinterbein bei Kaninchen wird seit über einem halben Jahrhundert mit 5,6alsphysiologisches Modell für obstruktive Gefäßerkrankungen und präklinische Vorläufer menschlicher Studien eingesetzt. Kaninchen sind aufgrund der entwickelten Muskulatur des Knöchel-und Wadenmuskels oft eine bevorzugte Spezies für Studien an peripheren Ischämie, im Gegensatz zu herkömmlichen großen Tiermodellen, die ungulat sind (Tiere mit Hufen). Mehrere aktuelle Rezensionen haben sich mit der Verwendung dieses Modells und anderer bei der Modellierung von peripheren Gefäßerkrankungen bei Menschen7,8befasst. Ähnliche Modelle mit Hinterbein Ischämie bei Kaninchen wurden in präklinischen Studien zu Wachstumsfaktoren9,10, 11,12, 13,14, 15,16,17,18, 19,20,Gentherapie21,22,23, 24,25, 26, 27,28,29,30, 31,32, 33,34, 35,36,37, 38,39, 40,41, 42,43,44, undStammzellen45,46, 47,48, 49, 50 ,51für therapeutische Neovaskularisierung in den Gliedmaßen. Leider zeigten die klinischen Studien, die auf diese erfolgreichen Tierstudien folgten, keine signifikanten Vorteile für die Patienten52.

Eine vorgeschlagene Erklärung für den Grund für dieses translationale Versagen ist, dass der Zustand der peripheren Ischämie bei menschlichen Patienten eine ist, die Resistenz gegen angiogene Signale53,54,55 , 56 , 57 , 58 , 59. Mehrere Studien haben Mängel an angiogenen Signalwegen bei Diabetes und Hyperglykämie nachgewiesen. Diabetes und Hyperlipidämie führen zu einem Verlust von Heparansulfat-Proteoglykanen und einer Zunahme von Enzymen, die Heparansulfat schneiden, was einen potenziellen Mechanismus zur Resistenz gegen therapeutische Angiogenesis/Arteriogenese mit Wachstumsfaktoren darstellt. , 61. Ein wesentliches Merkmal eines Modells für periphere Ischämie sollte daher ein Aspekt der therapeutischen Resistenz sein, damit Therapien im Zusammenhang mit dem Krankheitszustand von menschlichen Patienten bewertet werden können.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Kaninchenmodell der peripheren Ischämie durch chirurgische Ligation der Oberschenkelarterien. In das Modell wird eine Lead-In-Phase mit der Induktion von Diabetes und Hyperlipidämie eingearbeitet. Wir verglich dieses Modell mit einem anderen Modell, das eine höhere Fettdiät ohne Diabetes beinhaltet, und stellten fest, dass das Modell mit Diabetes und niedrigerem Niveau an Hyperlipidämie effektiver bei der Verringerung des Blutgefäßwachstums war. Unser Modell kombiniert Fortschritte, die von verschiedenen Gruppen genutzt wurden, mit dem Ziel, eine praktische und standardisierte Methode zu bieten, um konsistente Ergebnisse in der Forschung an peripheren Gefäßerkrankungen zu erzielen.

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Protocol

Studien mit Tieren wurden mit Genehmigung der University of Texas in Austin und des UTHealth Science Center in Houston Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), dem Animal Care and Use Review Office (ACURO) der US-Armee durchgeführt. Medizinische Forschung und Materialkommandariat für Forschungsschutz, und in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien für die Tierpflege.

1. Einführung von Diabetes und Hyperlipidämie

  1. Übergang der neuseeländischen Kaninchen (4 – 6 Monate alt) von einer Tasse Alfalfa-Chow auf 0,1% Cholesterin im Laufe von vier Tagen. Für die Tage 1 – 5, verwenden Sie Standard-Chow, um Cholesterin-Kratien von 1:0, 3:1, 1:3 und 0:1, bzw.. Nach zwei Wochen auf 0,1% Cholesterinchow, veranlassen Kaninchen zu Diabetes mit alloxan Injektion, wie in den folgenden Schritten beschrieben
  2. Die Kaninchen mit 35 – 75 mg/mL Ketamin und 1 – 2 mg/mL acepromazine über subkutane Injektion und Prep für eine IV-Injektion durch die Einführung eines Katheters in die marginale linke Ohrenvene mit einem 22 g Katheter bestücken.
  3. Sammeln Sie einen Tropfen Blut von den Kaninchen über die Nabe des Ohrendasing-Katheters für die Baseline-Blutzuckerspiegel (BGL) Messung. Jeder Standard-Glucometer kann verwendet werden. Normale Glukosewerte für ein Kaninchen liegen typischerweise im Bereich von 80 bis 150 mg/dL.
  4. Mit einer Spritzpumpe Lega bei 100 mg/kg in Salz auf ein Volumen von 8 ml langsam über einen Zeitraum von 8 Minuten durch den Ohrenkatheter injizieren.
  5. Überprüfen Sie die BGL jede Stunde für die nächsten 12 Stunden mit einem Standard-Glucometer, um Hypoglykämie zu überwachen.
    1. Das Kaninchen in einen Reststrainer legen.
    2. Das Ohr mit 2,5% Lidocaine/2,5% Prilocaincreme betäuben.
    3. Mit einer 27 G-Nadel das Blut aus der seitlichen Ohrenvene nehmen und BGL mit einem Standardmesser messen.
  6. Messen Sie die BGL zwei Mal täglich für die ersten 7 Tage. Geben Sie den Kaninchen eine Insulinspritze, wenn die BGL 350 mg/dL erreicht oder überschreitet.
  7. Bereiten Sie eine 3-mm-Edelstahlkugel für die Implantation als Größenmarkierung während der Angiogramme vor dem Tag der Operation.
    1. Schneiden Sie ein 10-mm-Rundstück aus silastischen Blechen aus einem größeren Blech mit einem Biopsie-Punch.
    2. Montieren Sie die Kugel in der Mitte des Blattes mit klarem Silikondichtmittel.
    3. Den Ball mit dem Dichtmittel komplett bedecken. Das Dichtmittel für mindestens 24 Stunden heilen lassen.
    4. Legen Sie die Kugel in einen offenen 2 Zoll x 3 Zoll großen Polyethylen-Beutel mit niedriger Dichte und legen Sie sie in einen Sterilisationstasche, um mit Ethylen-Oxidgas sterilisiert zu werden.

2. Vorbereitung des Kaninchens auf die Operation

  1. Das Kaninchen mit 20 – 40 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Midazolam durch subkutane Injektion anstecken. Legen Sie das Kaninchen auf 1,5% – 3% Isoofluran (in der Regel 2%) Während der gesamten ersten Sedierung mit einer Maske. Geben Sie eine Injektion von Alfaxalone, um die Anästhesie durch eine intramuskuläre Injektion von 3 mg/kg aufrechtzuerhalten.
  2. Nach der Betäubung die Maske entfernen und ein gefesseltes Endotrachealrohr in die Atemwege geben und mit einem Ventilator verbinden. Verabreden Sie Isoofluran weiterhin mit 1,5% – 3%.
  3. Sammeln Sie Blut aus der zentralen Arterie aus beiden Ohren für eine Basischemie.
  4. Legen Sie einen 22 G-Ohrvinenkatheter in die seitliche Ohrenvene, damit die Lösung von Lactated Ringer während des chirurgischen Eingriffs tropfen soll. Alternativ kann auch normales Salz (0,9% Natriumchlorid) verwendet werden.
  5. Mit der seitlichen Vene im gegenüberliegenden Ohr einen Katheter in die Vene legen und Alfaxalone bei 6 mg/kg/h liefern.
  6. Um Schmerzen und Infektionsgefahr zu begrenzen, verabreichen Sie Buprenorphin (0,01 mg/kg) und Enrofloxacin (5 mg/kg) mit einer subkutanen Injektion mit einer 25 G-Nadel.
  7. Schneiden Sie die Haare am Hals, an den rechten und linken Innenhängen und zurück mit Clippers (#40 Klinge). Das Haar wird von hinten entfernt, um den Kontakt mit dem Erdungspolster zu halten.
  8. Legen Sie eine Blutdruckmanschette auf jeden der Hinterbeine und messen Sie den anfänglichen Blutdruck. Legen Sie die Manschette knapp unter das Knie mit der Sonde knapp über dem Hock auf die Seitenoberfläche.
  9. Positionieren Sie das Kaninchen auf dem Operationstisch auf dem Rücken und schrubben und drapieren Sie die Operationsseiten. Dazu gehören der Hals für den Zugang zur Arterieur und der innere rechte Oberschenkel für den Zugang zur Oberschenkelarterie. Führen Sie die Sterilisationsschrubbe mit abwechselnden Peeling von 2% Chlorhexidin und 70% Ethylalkohol durch. Wiederholen Sie diese dreimal, dann ein abschließendes Spray mit 2% Chlorhexidin Lösung.
  10. Legen Sie eine 3-mm-Edelstahlkugel, die in einem Polyethyanerbeutel mit geringer Dichte auf das rechte (geschrubbte) Bein in der Nähe des oberen Teils des Oberschenkels sterilisiert wurde, um als Größenbeweis bei Angiogramm-Messungen zu dienen. Legen Sie eine sterile Drape über das Bein bis zur Zeit der Operation. Lassen Sie die Kugel in der sterilen Plastiktüte während des ersten Angiogramms.

3. Angiographie

  1. Die richtige gemeinsame Carotid-Arterie aussetzen
    1. Mit einem Skalpell mit – Klinge einen 4 #15 5 cm langen Schnitt nur seitlich zur Luftröhre machen.
    2. Verwenden Sie stumpfen Abschnitte, um die Carotid-Arterie zu entlarven und öffnen Sie den Schnitt mit kleinen Weitlaner-Retraktoren. Isolieren Sie die Carotid-Arterie vorsichtig von der jugulären Ader und dem Vagusnerv. Typischerweise werden für die stumpfe Abtrüsur eine geschwungene Metzenbaum-Schere und eine gebogene Mückenhungitose verwendet. Achten Sie darauf, dass die Knorpelarterie von der Nerven-und Jugulavene vollständig getrennt wird, damit die Ligaturen nur die Arterie ligieren.
  2. Legen Sie eine Ligatur mit einer 4-0 Seidennaht an den proximalen und distalen Enden der exponierten Arterie. Mit dem Knoten eines Chirurgen, gefolgt von vier quadratischen Knoten, wird das distale Ende des Carotids abgezogen. Verwenden Sie am proximalen Ende einen Ligaloop, um ihn bei Bedarf straffen oder lockern zu lassen. Die Verwendung eines Ligaloop, der am proximalen Ende der exponierten Arterie platziert wird, kann helfen, den Einführer und Katheter zu sichern.
  3. Administer 500 IU von heparin durch die IV. Verwenden Sie etwa 0,5 ml von 1% Lidocain, die entlang des exponierten Carotids aufgetragen werden, um das Gefäß zu erweitern. Eine Behandlung reicht in der Regel aus, kann aber bei Bedarf wiederholt werden. Etwa auf halbem Weg durch die Carotid-Arterie mit einer Skalpell oder Iris-Schere schneiden, dann das 4-Zoll-Drahtzeiftzüge in die Arterie legen.
  4. Füttern Sie einen 0,14 Zoll x 185 cm langen Führungsdraht durch das Einsteckwerkzeug zur Aortenverzweigung am iliakischen Kamm in der absteigenden Aorta. Entfernen Sie das Einsteckwerkzeug und legen Sie einen 3F-Pigtail-angiographischen Katheter über den Draht.
  5. Vorwärts ist der Schweineschwank-Katheter 2 cm ungefähr zur Aortenverzweigung am iliakischen Kamm in der absteigenden Aorta.
  6. Positionieren Sie die Spitze des Katheters zwischen der siebten Lendenwirbelsäule und der ersten sakralen Wirbelsäule. Testen Sie die Lage des Katheters, indem Sie eine 2 – 4 ml Kontrastmittel manuell injizieren.
  7. Administer eine intraarterielle Injektion von 100 μg Nitroglycerin durch den Katheter, um die Vasodilation zu erhöhen.
  8. Administer 0,8 mL von 1% Lidocain an das Kaninchen durch den Katheter, um bei der Vasodilation während des Angiogramms zu helfen. Befestigen Sie die Schläuche für den Injektor an den Katheter und entfernen Sie Luftblasen in der Leitung. Mit dem automatisierten angiographischen Injektor durch den Katheter 8-9 ml Kontrastmittel einschleusen.
  9. Aufzeichnung von Serienbildern der Hinterbeine mit Hilfe von Angiographie.
    1. Stellen Sie den Power-Injektor so ein, dass er den Kontrast bei 3 mL/sec für insgesamt 8-9 mL einspritzt. Führen Sie die digitale Subtraktionsangiographie mit 6 Bildern pro Sekunde durch.
    2. Wählen Sie die erstellten Serienbilder aus und ändern Sie ein Foto jedes Angiogramms mit etwa-40% Einstellung, um das Aussehen des Knochens zu minimieren und ein vollständiges Bild der Gefäßdurchmischung mit Kontrast zu erfassen. Ein Beispiel Angiogramm des Gefäßflusses nach der Oberschenkelligation/.

4. Isolierung der Oberschenkelarterie

  1. Mit einem Skalpell (#15 Klinge) einen Längsschnitt in der Haut über der rechten Oberschenkelarterie machen. Achten Sie darauf, dass der Schnitt sich von dem Leistenband, das in der Gegend nur in der Nähe der Patella (ca. 6 cm) endet, nachrangt.
  2. Verwenden Sie stumpfe Sektion mit gebogenen Metzenbaum-Scheren oder einer gebogenen Mückenhemostat, um die Oberschenkelarterie zu entlarven.
  3. Verwenden Sie Weitlaner Retraktoren, um den Schnitt offen zu halten.
  4. Fügen Sie 0,5 ml von 1% Lidocain vor Ort hinzu, um Nervenreizungen zu reduzieren und die Vasodilation zu fördern.
  5. Setzen Sie stumpfe Abschnitte des Gewebes fort, um die gesamte Länge der Oberschenkelarterie zusammen mit allen Zweigen der Oberschenkelarterie zu befreien, einschließlich der minderwertigen Epigastrischen, tiefen Oberschenkelumfang, lateralen Umgehungsarterien und oberflächlichen Epigastrischen Arterien (Abbildung 2A) .
  6. Sekten Sie weiter entlang der poplitealen und saphenösen Arterien sowie der äußeren iliakischen Arterie(Abbildung 2A). Befeuchten Sie den Bereich regelmäßig mit Salz, um vor Gewebeschäden zu schützen. Wenn die stumpfe Sektion entlang der Oberschenkelrinne (zwischen den Muskeln) durchgeführt wird, ist es nicht notwendig, den Muskel zu schneiden.
  7. Die Arterie vorsichtig von der Vene und dem Nerv trennen, wie in Abbildung 2B, C. Ligieren Sie die Arterien, die durch das Diagramm mit 4,0 Seidenähten angezeigt werden, indem Sie zwei Krawatten mit genügend Platz zwischen ihnen platzieren, um die Arterie zu schneiden. Diese Krawatten werden mit einem Surge-Knoten durchgeführt, gefolgt von vier quadratischen Knoten.
  8. Schnitt zwischen den beiden Krawatten auf den ligatierten Arterien mit der kleinen Metzenbmau-Schere. Die Oberschenkelarterie von ihrem proximalen Ursprung als Zweig der äußeren iliakischen Arterie bis zu dem Punkt distal, wo sie zu den saphenösen und poplitealen Arterien verzweigt.

5. Angiographie wiederholen

  1. Verwenden Sie 4-0 Seidennaht, um das silastische Blech zu befestigen, mit 3-mm Edelstahlkugel am oberen Teil des Quadrizeps-Muskels. Ziehen Sie die Haut über den Ball, nachdem sie an Ort und Stelle ist.
  2. Administer eine intraarterielle Injektion von 100 μg Nitroglycerin durch den Katheter, um die Vasodilation zu erhöhen.
  3. Bei Bedarf weitere 0,8 mL Lidocain mit 1% Lidocain durch den Katheter verabreichen, um die Vasodilation während des Angiogramms zu unterstützen.
  4. Mit einem automatisierten angiographischen Injektor 8-9 ml von Kontrastmitteln einschlagen.
  5. Führen Sie Angiographie, wie in Schritt 3.9 beschrieben.

6. Wundabschaltung und-verwertung

  1. Den Katheter aus der rechten Arterie nehmen. Mit der 4:0-Seidenznaht, die bereits rund um die Arterie vorhanden ist, die Arterie abziehen.
  2. Suture beide Wunden geschlossen. Schließen Sie Muskel-und Unterkuschellagen mit 4-0 Polydioxanon oder 3-0 Polyglactin 910 auf einer Tupernadel (siehe Materialtabelle) in einem durchgehenden Nahtmuster. Schließen Sie die Haut mit 4-0 Polydioxanon oder 4-0 Polyglactin 910 auf einer umgekehrten Schneidnadel (siehe Materialtabelle) in einem vergrabenen, durchgehenden subkutizulären Nahtmuster.
    Hinweis: Wenn vorhanden, wird Polydioxanon für beide bevorzugt.
  3. Administer intradermale Injektionen von 0,25% Bupivacaine in der Nähe der Einschnitte mit einer Spritze mit einer 25 G-Nadel. Legen Sie die Nadel ein und spritzen Sie 0,5 ml, während die Nadel zurückgezogen wird. Geben Sie eine Injektion pro Seite der Wunde für den Schnitt am Hals (zwei Injektionen am Hals) und zwei Injektionen pro Seite der Wunde für den Schnitt am Bein (vier Injektionen auf dem Bein; insgesamt sechs Injektionen). Das injizierte Gesamtvolumen beträgt 3 mL (0,5 mL x 6 Injektionen).
  4. Administer subkutane Injektionen von 0,5 mg/kg Meloxicam und anhaltender Freigabe Buprenorphine bei 0,12 mg/kg.
  5. Überwachen Sie das Kaninchen, wie es sich von der Narkose erholt. Das Kaninchen beginnt automatisch zu schlucken, wenn es aus der Narkose erwacht. Sobald die Schluckreaktion auftritt, entfernen Sie das endotracheale Rohr. Eine enge Überwachung und thermische Unterstützung, bis das Kaninchen in der Lage ist, die Herz-Kreislauf-Funktion und die Körpertemperatur zu erhalten. Bringe das Kaninchen in sein Gehege zurück, sobald es in der Lage ist, zu ambulant zu sein.
  6. Verwenden Sie frisches Gemüse and/oder Spritzenfutter einer kritischen Pflege Diät zusammen mit subkutanen Salzspritzen, wenn das Kaninchen nicht verträgt chow nach der Operation. Kohl, Brokkoli, Blumenkohl, Karotten oder andere in saisonalen Gemüsesorten können verwendet werden. Das Gemüse verkleinern und vermischen, um dem Kaninchen bei der Rückkehr zum Essen zu helfen.

7. Überwachung

  1. Die Kaninchen alle zwei Wochen betäuben, um den Blutdruck auf beiden Beinen zu erhalten, wie in Schritt 2.8 beschrieben. Erntedankblut aus der zentralen Arterie des Ohres für den Einsatz in Blutchemie-Assays. Alternativ sollte man Blut aus der saphenösen Vene oder aus der Kopfhaut nehmen. Nehmen Sie etwa 2 mL an jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie für die Analyse eine Standard-Blutchemie-Tafel. Wenn nötig, fügen Sie Tests für Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL), Lipoprotein mit hoher Dichte (HDL) oder Hämoglobin A1c (HbA1c) hinzu.
  2. Nehmen Sie eine sehr geringe Menge Blut für BGL-Messungen.

8. Behandlung

  1. Zehn Spritzen mit Behandlung, Träger und Crosslinker zubereiten. Füllen Sie jede Spritze kurz vor der Anwendung mit 100 μL Kalziumsulfat-Gülle und dann 100 μL von 2% Natriumalginat mit Wachstumsfaktoren oder anderen Behandlungen, so dass das Alginat der Spitze der Spritze am nächsten ist.
  2. Verabschiedung der einen bereitet Injektion in den Muskel, bevor die Vorbereitung der nächsten. Dadurch verkürzt sich die Zeit, in der das Alginat mit dem Kalziumsulfat in der Spritze interagiert. Die Injektionen gleichmäßig auf beiden Seiten der Oberschenkelknochen aufrichten. Um einheitliche Injektionen zu erreichen, erstellen Sie ein Silikonblech mit Löchern, um die Injektion zu leiten, wie in anderen Studien 19 beschrieben. Diese lässt sich mit einem Biopsienstich leicht aufbereiten, um Löcher in handelsüblichen Silikonblechen zu schaffen.

9. Endpunkt-Angiographie, Euthanasie, Perfusionsfixierung und Gewebeernte

  1. Führen Sie am Endpunkttermin Angiographie aus, wie in Schritt 3 beschrieben, aber verwenden Sie die linke Carotid-Arterie für den Zugang.
  2. Nach der Angiographie, bewegen Sie das Tier an den Nekropsy-Tisch und führen Perfusionsfixierung, um die Hinterbeine Gewebe zu erhalten:
    1. Erhöhen Sie das Isoofluran auf 3% – 4% und führen Sie eine Zehenspose durch, um die Anästhesie zu bestätigen, dass die Anästhesie ausreichend tief ist.
    2. Administer 1000-2000 IU von heparin intravenös.
    3. Mit einem Skalpell mit #20 Klinge einen Schnitt entlang der Mittellinie des Felsenkäfigs und die Länge des Zwerchfells erstellen.
    4. Mit dem freigelegten Rippenkäfig die Rippen links von der Mittellinie mit Rippenschneidern schneiden. Verwenden Sie Weitlaner Retrektor, um das Herz zu entlarven.
    5. Die Pumpe mit Ausgangsrohr mit einem Innendurchmesser von einem Zoll von 8 Zoll und einer 18G-Nadel am Ende aufstellen. Die Linie mit Salz vorladen und mindestens 600 ml Salz und Formalin in separaten Behältern für die Perfusion zubereiten lassen.
    6. Legen Sie die mit der Pumpe verbundene 18 G-Nadel über die Spitze des Herzens in die linke Herzkammer ein. Eine weitere 18-G-Nadel (ungebunden an irgendetwas) in das rechte Atrium einlegen und Blut in den Abzug der Nekropsisch-Tabelle fließen lassen.
    7. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um den Fluss von etwa 500 ml Salz in das Herz zu steuern. Verwenden Sie eine Pumpeneinstellung, um 110 mL/min zu fließen.
    8. Sobald die Flüssigkeit aus dem Herzen klar ist, bewegen Sie die Schläuche aus dem Salzreservoir zu einem mit einer 10% Formalin-Lösung gefüllten. Das Twittern tritt in allen vier Gliedmaßen auf, wenn die Perfusion richtig funktioniert. Pumpen Sie etwa 500 ml Formalin-Lösung in die linke Herzkammer.
    9. Schalten Sie die Pumpe ab und entfernen Sie die Nadeln vom Herzen.
  3. Entfernen Sie beide Hinterbeine an der Hüfte, indem Sie das Hüftgelenk mit einem Skalpell mit #20 Klinge umschneiden. Verwenden Sie einen kleinen Rippenschneider, um die Gliedmaßen zu entfernen. Verwenden Sie das nicht-ischämische Glied als Kontrolle.
  4. Die Gliedmaßen 24 h bei 4 ° C in Formalin lagern und dann in 70% Ethanol bei 4 ° C lagern.
  5. Für die histologische Analyse nehmen Sie mehrere Biopsien aus den Gliedmaßen. Wir haben acht 6-mm-Biopsien verwendet, die in den Regionen über den Oberschenkel und das Kalb in beiden Gliedmaßen aufgenommen wurden.
    NOTE: Während Knöchelblutdruckmessung und Angiographie sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Messung der Wiederherstellung des Blutflusses, können andere Methoden verwendet werden, um die Genesung der Tiere zu verfolgen, einschließlich Doppler-Ultraschall, Laser-Doppler-Bildgebung, Infrarot Die Thermografie62, Mikrosphäre,bestimmtdie Perfusion 63, 64, die Computertomographie (CT)-Bildgebung und die Magnetresonanztomographie (MRT) 65.

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Representative Results

Nach der Induktion von Diabetes und der Einleitung der Cholesterindiät von 0,1% betrug das Gesamtcholesterin für die Kaninchen mit Diabetes und Cholesterindiät 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 männliche Kaninchen), die im Durchschnitt die Zeitpunkte und Kaninchen hatten. Der BGL-Wert für diese Kaninchen betrug 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 männliche Kaninchen). Ein Zeitverlauf für Blutchemikalien und Beinblutdruckverhältnisse in einem typischen Kaninchen wird in Abbildung 3 im Vergleich zu Kaninchen mit einer höheren Cholesterindiät (1% Cholesterin) gezeigt. Bei nicht-diabetischen Tieren, auch bei höherem Cholesterin, stellten wir fest, dass sich der Blutdruck im ischämischen Gliedmaßen und die Vaskularität in den Angiogrammen am letzten Zeitpunkt erhöht haben (Abbildung3). Auch die Tiere auf der höheren Cholesterin-/Fett-Diät zeigten einen erhöhten Lipoprotein-A-Gehalt, was auf Stress für die Leber hindeutet. So führte Diabetes mit niedrigerem Cholesterinspiegel zu mehr kompromittierter Durchblutung am Studiendendpunkt. Histologisch gibt es Veränderungen in der Muskelstruktur imEinklang mit Ödemen und ischämischen Schäden an einigen Standorten Abbildung 4. In einigen Fällen kann man Veränderungen in den Muskelfasern durch die Ischämie beobachten. Dies lässt sich als Verlust oder Störung der Muskelfasern in der histologischen Analyse beobachten, wie bei einigen Hinterbeinen Ischämie-Modelle bei Mäusen beobachtet wurden. Es ist jedoch darauf bedacht, diese Veränderungen von histologischen Artefakten der Gewebeverarbeitung zu unterscheiden. Immunfärbung für PECAM und αSMA kann verwendet werden, um die Anzahl der Gefäße und größeren Gefäße in den Gewebeabschnitten zu identifizieren (Abbildung4). Insgesamt führte das Modell mit Diabetes mit einer niedrigeren Cholesterindiät wiederholbare Defizite im Blutdruck und Vaskularisierung über das höhere Cholesterin-Diät-Modell ohne Diabetes.

Figure 1
Abbildung 1: Angiogramme für den Hintern Gliedmaßen eines diabetischen und nicht-diabetischen Kaninchens vor der Operation, nach der Operation und nach der Genesung für 70 Tage nach der Oberschenkelardenliga und Exzision. (A) Angiogramm der ischämischen Gliedmaßen (links) und der kontralateralen Kontrollglib (rechts). (B) Vergrößerungsbild des ischämischen Gliedmaßen am Ort der Ligation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Einführung der Schwunggelbischämie bei Kaninchen durch Oberschenkelardenliga und-exzision. (A) Illustration der Gefäßanatomie des Kaninchenrindes. Legen Sie die Bindungen an allen Punkten, die markiert sind, um die Arterien zu ligieren. Modifiziert und mit Erlaubnis71. (B) Chirurgisches Feld, das den Schnitt vor der Ligation auf die Oberschenkelarterie zeigt. C) Frauenarterien mit Ligationen, die zur induzierten Hinterbeine Ischämie führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Typischer Blutdruck und Blutchemie für die Kaninchen mit Hinterbeine im Laufe des Modells. Die Diabetic/MC-Gruppe wurde zu Diabetes veranlasst und mit einer Cholesterindiät von 0,1 Prozent versehen. Die Gruppe Non-Diabetic/HC erhielt eine Cholesterindiät von 1%. BGL = Blut-Glukose-Level. TC = Total Cholesterin. LIPA = Lipoprotein (a). BP = Blutdruckverhältnis zwischen ischämischem und nicht-ischämischem Glied. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Histologische Analyse des Muskels des Hinterbeines bei diabetischen Kaninchen 70 Tage nach der Oberschenkelliga. H & E-Färbung sowie immunhistochemische Färbung für den endothelialen Marker, PECAM, und Gefäßglatter Muskelzellen-Marker, α SMA, wurde durchgeführt. Gewebeproben wurden aus dem ischämischen Glied und dem nicht-ischämischen konklalateralen Kontrollglib biopsiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Wir haben ein präklinisches Modell zur induzierten Hinterbeine bei Kaninchen mit Diabetes und Hyperlipidämie vorgestellt. In vielen Studien gibt es Unklarheiten zu der Technik, mit der bei Kaninchen eine Hinterbundsteinischämie hergestellt wird. Bei Mäusen ist die Schwere und Genesung von Hinterbein Ischämie stark abhängig von der Lage, an der die Ligation und die Technik zur Ischiere eingesetzt werden. Die Bedeutung der Technik, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, ist, dass sie die konsequente Induktion von Ischämie ermöglicht, die sich nach 8 Wochen bei Diabetikern nicht vollständig erholt. Vor allem, wenn die Tiere eine höhere Cholesterin-und Fettdiät erhielten, konnten sie sich auf nahezu Grundwerte des Blutdruckverhältnisses der Gliedmaßen erholen. Außerdem hatten die Tiere auf der höheren Fettdiät Veränderungen in Leberenzymen, die auf Leberschäden hindeuteten. So scheint das diabetische Modell mit einem niedrigeren Cholesterin-/Fettgehalt ein konsequenteres und relevanteres Modell der chronischen Ischämie im Gliedmaßen zu sein.

In diesem Modell können vier wesentliche Schritte hervorgehoben werden, darunter die Induktion von Diabetes, Angiographie, chirurgische Ligation der Oberschenkelarterien und die Anwendung der Behandlung. Unter diesen Schritten war die Induktion von Diabetes einer der kritischsten Schritte und einer, der für jedes Labor eine weitere Optimierung erfordern kann. Die Rate der Alloxan-Injektion ist ein wichtiger Faktor, der die Toxizität und Wirksamkeit der Induktion von Diabetes durch Alloxan bei Kaninchen verändert. Wenn Alloxan zu schnell injiziert wurde, verursachte es Instabilität in der BGL und Tod in den Kaninchen. Dies kann manchmal als Hypoglykämie beobachtet werden, die nicht durch Injektionen von Dextrose-Lösungen oder in anderen Fällen extrem hohe BGL gelöst wird. Wenn die Kaninchen zu langsam injiziert werden, werden sie oft nicht Diabetikerin. Es ist möglich, dass dieser Parameter für Kaninchen aus verschiedenen Quellen optimiert werden muss. Kaninchen werden in der Regel hyperglykämisch für 1-3 h, aber die BGL wird dann beginnen zu fallen. Daher wird in der Regel kein Insulin am Tag der Diabetes-Induktion verabreicht. Sinkt die BGL jedoch in den ersten 24 Stunden unter 100 mg/dL, kann sie durch die Injektion von 10,0 mL von 5% Dextrose-Lösung subkutan oder durch die Umstellung der Wasserversorgung auf eine 10%-Dextrose-Lösung (typischerweise über Nacht ist ausreichend) erhöht werden. Wenn Insulin verabreicht wird, wird ein zusätzlicher BGL-Test durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Glukosegehalt nicht zu niedrig sinkt. Die Insulinreaktion variiert oft für jedes Kaninchen. So werden einzelne Dosiergeräte eingesetzt, um die BGL zu normalisieren, basierend darauf, wie das Kaninchen auf das Insulin reagiert. Diabetes wird typischerweise nach 2-3 Tagen nach der Alloxan-Injektion induziert.

Als präklinisches Modell von peripheren Gefäßerkrankungen und Gliedmaßen hat das präsentierte Modell einige potenzielle Einschränkungen. Die Induktion von Diabetes mit Alloxan führt zu einer schnellen Entwicklung von Typ-I-Diabetes. Dies steht im Gegensatz zu der chronischen Entwicklung von Typ-II-Diabetes, die bei menschlichen Patienten am häufigsten vorkommt. Darüber hinaus wird die Ischämie durch chirurgische Ligation akut entwickelt und nicht durch die chronische Entwicklung von Gefäßerkrankungen und atherosklerotischen Plaques. Eine grundlegende Einschränkung der Verwendung von Kaninchen ist ihre Zerbrechlichkeit als Tiermodell. Die Tiere vertragen nur eine begrenzte Menge an Hyperlipidämie in Kombination mit Typ-I-Diabetes und die Optimierung der maximalen Krankheitszahl, ohne dass das Tier sterben musste, war ein wichtiges Ziel bei der Erstellung dieses Protokolls. Unsere Gruppe hat vermutet, dass Patienten mit peripheren Ischämie therapeutische Resistenzen gegen angiogene Wachstumsfaktoren entwickeln und dass dies eine wichtige Rolle beim Scheitern von wachstumsfaktorbasierten TherapeutikafürIschämie 66 spielen kann. Zu diesem Zweck haben wir einen Verlust an der Oberfläche Proteoglykane und eine Zunahme der Heparanase in Tier-und Menschengewebeproben 55,58, 67,68, 69,70gezeigt . Es ist unbekannt, ob das hier beschriebene Kaninchenmodell Wachstumsfaktorresistenz zeigt, obwohl die Beobachtung, dass es längerfristige Ischämie mit Diabetes und moderatem Hyperlipidmia-Modell im Vergleich zum hohen Hyperlipidmien-Modell vermuten lassen würde. Es gibt ein gewisses Defizit im Revaskularierungsprozess.

Für die Aufnahme von Behandlungen in das Modell ist es wichtig, nach der Induktion von Ischämie eine Erholungsphase zu haben, um die akute Heilungsphase ohne Eingriff durchführen zu können. Wenn in dieser Zeit Therapien verabreicht werden, wäre die Reaktion relevanter, um die Reaktion auf akute Ischämie zu verbessern als auf die chronische Ischämie, die periphere Gefäßerkrankungen kennzeichnet. Ein solches Modell kann für akute ischämische Verletzungen bei Traumata oder Thrombosen relevant sein, würde aber wahrscheinlich keine gute Korrelation mit chronischer Ischämie bieten. Angesichts der schlechten Korrelation zwischen positiven Ergebnissen in präklinischen Modellen der Ischämie bei gesunden Tieren und den Ergebnissen klinischer Studien ist die Aufnahme von Diabetes oder einem anderen Faktor, der die Gefäßregeneration reduziert, für den Versuch, Rekapitulation der Gliedmaßen Ischämie beim Menschen für die Schaffung zukünftiger Therapien.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren bestätigen dankenswerterweise die Finanzierung durch das vom Verteidigungsministerium vermittelte Forschungsprogramm (DOD CDMRP); W81XWH-16-1-0582) zu ABB und RS. Die Autoren bestätigen auch die Finanzierung durch die American Heart Association (17IRG33410888), Der DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) und die National Institutes of Health (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) bis ABB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Henry Schein Medical 1537468 / 1531434 250 mL bag / 1000 mL irrigation btl
1 mL Syringe VWR BD309628
10 mL Syringe VWR BD309695
10% Formalin Fisher-Scientific 23-245684
18G Needle VWR 89219-294
20G Needle VWR 89219-340
25G Needle VWR 89219-290
27G Needle VWR 89219-288
5 mL Syringe VWR BD309646
5% Dextrose Patterson Veterinary 07-800-9689
Acepromazine Patterson Veterinary VEDC207
Alfaxalone Patterson Veterinary 07-891-6051
Alginate Sigma-Aldrich PHR1471-1G
Alloxan Monohydrate Sigma-Aldrich A7413
Angiography Equipment Toshiba Infinix-i
Angiography Injector Medrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594 Thermo Fisher Scientific A-11032 Secondary Antibody for IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary Antibody for IHC
a-SMA Antibody Abcam ab5694 Primary Antibody for IHC
Baytril Bayer Animal Health 724089904201 Enrofloxacin
Blood Chemistry Panel IDEXX 2616 Rabbit Panel
Blood Pressure Cuff WelchAllyn Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7
Blood Pressure Monitor Vmed Technology Vmed Vet-Dop2
Bupivacaine Henry Schein Medical 6023287
Buprenorphine Patterson Veterinary 42023017905
Buprenorphine SR ZooPharm
Calcium Sulfate CB Minerals Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC
Chlorhexidine Scrub Patterson Veterinary 07-888-4598
Chloroform Fisher-Scientific C298-4
Cholesterol Sigma-Aldrich C8503
DAPI Thermo Fisher Scientific 62248
Ear Vein Catheter Patterson Veterinary SR-OX165 Surflo IV catheters
Endotracheal tube Patterson Veterinary Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size
Glucometer Amazon B001A67WH2 Accu-Chek Aviva
Glucometer Test Strips McKesson Medical-Surgical 788222 Accu-Chek Aviva Plus
Guidewire Boston Scientific 39122-01
Hair Clippers Amazon B000CQZI3Q Oster #40 blade
Heating Pad Cincinnati Subzero 273
Heating Pad Pump Gaymar Gaymar T/Pump
Hemostat Fine Science Tools 13009-12 Curved Mosquito Hemostat
Heparin Patterson Veterinary
Insertion Tool Merit Medical Systems MAP550 metal wire insertion tool
Insulin HPB Pharmacy Novalin R & Novalin N
Insulin Syringes McKesson Medical-Surgical 942674
Introducer Cook Medical G28954 3F Check Flo Performer Introducer
Isoflurane Henry Schein Medical 1100734
Ketamine Patterson Veterinary 856440301
Lactated Ringers McKesson Medical-Surgical 186662
Lidocaine McKesson Medical-Surgical 239936
Lidocaine/Prilocaine cream McKesson Medical-Surgical 761240
Ligaloop V. Mueller CH117 / CH116 White Mini / Yellow Mini
Mazola Corn Oil Amazon B0049IIVCI
Medrad Syringe McKesson Medical-Surgical 346920 150 mL
Meloxicam Patterson Veterinary
Metal ball sutures Ethicon-Johnson & Johnson K891H 4-0 silk C-1 30"
Metzenbaum Scissors Fine Science Tools 14019-13
Midazolam Henry Schein Medical 1215470
Nitroglycerin McKesson Medical-Surgical 927528
PECAM Antibody Novus Biologicals NB600-562 Primary Antibody for IHC
Perfusion Pump Masterflex
Pigtail Catheter Merit Medical Systems 1310-21-0053 3F pigtail
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129271 4-0 taper RB-1 (needle comes on suture)
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129031 4-0 reverse cutting FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) suture Butler 7233-41 3-0 taper RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) suture McKesson 104373 4-0 reverse cutting FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa) LabDiet 5321
Rabbit Restrainer VWR 10718-000
Rib Cutters V. Mueller
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade Fine Science Tools 10015-00 #15 blade
Silk Sutures Ethicon-Johnson & Johnson A183H 4-0 silk ties 18"
Stainless Steel Ball McMaster-Carr 1598K23 3-mm diameter
Surgical Drapes Gepco 8204S
Syringe Pump DRE Veterinary Versaflow VF-300
Visipaque contrast media McKesson Medical-Surgical 509055
Weitlaner Retractor Fine Science Tools 17012-13

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References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  3. Shammas, A. N., et al. Limb Outcomes Following Lower Extremity Endovascular Revascularization in Patients With and Without Diabetes Mellitus. Journal of Endovascular Therapy. 24 (3), 376-382 (2017).
  4. Tunstall-Pedoe, H., Peters, S. A. E., Woodward, M., Struthers, A. D., Belch, J. J. F. Twenty-Year Predictors of Peripheral Arterial Disease Compared With Coronary Heart Disease in the Scottish Heart Health Extended Cohort (SHHEC). Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
  5. Whiteley, H. J., Stoner, H. B., Threlfall, C. J. The effect of hind limb ischaemia on the physiological activity of rabbit skin). British Journal of Experimental Pathology. 34 (4), 365-375 (1953).
  6. Longland, C. J. Collateral circulation in the limb. Postgraduate Medical Journal. 29 (335), 456-458 (1953).
  7. Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 773-780 (2004).
  8. Krishna, S. M., Omer, S. M., Golledge, J. Evaluation of the clinical relevance and limitations of current pre-clinical models of peripheral artery disease. Clinical Science (London. 130 (3), 127-150 (2016).
  9. Zhou, J., et al. Therapeutic angiogenesis using basic fibroblast growth factor in combination with a collagen matrix in chronic hindlimb ischemia). ScientificWorldJournal. , 652794 (2012).
  10. Prochazka, V., et al. Therapeutic Potential of Adipose-Derived Therapeutic Factor Concentrate for Treating Critical Limb Ischemia. Cell Transplantation. 25 (9), 1623-1633 (2016).
  11. Cao, R., et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2. Nature Medicine. 9 (5), 604-613 (2003).
  12. Doi, K., et al. Enhanced angiogenesis by gelatin hydrogels incorporating basic fibroblast growth factor in rabbit model of hind limb ischemia. Heart and Vessels. 22 (2), 104-108 (2007).
  13. Nitta, N., et al. Vascular regeneration by pinpoint delivery of growth factors using a microcatheter reservoir system in a rabbit hind-limb ischemia model. Experimental and Therapeutic. 4 (2), 201-204 (2012).
  14. Karatzas, A., et al. NGF promotes hemodynamic recovery in a rabbit hindlimb ischemic model through trkA- and VEGFR2-dependent pathways. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 62 (3), 270-277 (2013).
  15. Stachel, G., et al. SDF-1 fused to a fractalkine stalk and a GPI anchor enables functional neovascularization. Stem Cells. 31 (9), 1795-1805 (2013).
  16. Asahara, T., et al. Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. Circulation. 92, 365 (1995).
  17. Morishita, R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human recombinant hepatocyte growth factor in rabbit hind limb ischemia model as cytokine supplement therapy. Hypertension. 33 (6), 1379-1384 (1999).
  18. Walder, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor augments muscle blood flow and function in a rabbit model of chronic hindlimb ischemia. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 27 (1), 91-98 (1996).
  19. Anderson, E. M., et al. VEGF and IGF Delivered from Alginate Hydrogels Promote Stable Perfusion Recovery in Ischemic Hind Limbs of Aged Mice and Young Rabbits. Journal of Vascular Research. 54 (5), 288-298 (2017).
  20. Xie, J., et al. Induction of angiogenesis by controlled delivery of vascular endothelial growth factor using nanoparticles. Cardiovascular Therapeutics. 31 (3), e12-e18 (2013).
  21. Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
  22. Ohara, N., et al. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in a rabbit model of hind limb ischemia. Gene Therapy. 8 (11), 837-845 (2001).
  23. Pyun, W. B., et al. Naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor induces collateral artery augmentation in a rabbit model of limb ischemia. Gene Therapy. 17 (12), 1442-1452 (2010).
  24. Kupatt, C., et al. Cotransfection of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-B via recombinant adeno-associated virus resolves chronic ischemic malperfusion role of vessel maturation. Journal of the American College of Cardiology. 56 (5), 414-422 (2010).
  25. Olea, F. D., et al. but not single, VEGF gene transfer affords protection against ischemic muscle lesions in rabbits with hindlimb ischemia. Gene Therapy. 16 (6), 716-723 (2009).
  26. Pinkenburg, O., et al. Recombinant adeno-associated virus-based gene transfer of cathelicidin induces therapeutic neovascularization preferentially via potent collateral growth. Human Gene Therapy. 20 (2), 159-167 (2009).
  27. Katsu, M., et al. Ex vivo gene delivery of ephrin-B2 induces development of functional collateral vessels in a rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 49 (1), 192-198 (2009).
  28. Korpisalo, P., et al. Therapeutic angiogenesis with placental growth factor improves exercise tolerance of ischaemic rabbit hindlimbs. Cardiovascular Research. 80 (2), 263-270 (2008).
  29. Chen, F., Tan, Z., Dong, C. Y., Chen, X., Guo, S. F. Adeno-associated virus vectors simultaneously encoding VEGF and angiopoietin-1 enhances neovascularization in ischemic rabbit hind-limbs. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (4), 493-502 (2007).
  30. Kobayashi, K., et al. Combination of in vivo angiopoietin-1 gene transfer and autologous bone marrow cell implantation for functional therapeutic angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (7), 1465-1472 (2006).
  31. Lee, J. U., et al. A novel adenoviral gutless vector encoding sphingosine kinase promotes arteriogenesis and improves perfusion in a rabbit hindlimb ischemia model. Coronary Artery Disease. 16 (7), 451-456 (2005).
  32. Nishikage, S., et al. In vivo electroporation enhances plasmid-based gene transfer of basic fibroblast growth factor for the treatment of ischemic limb. Journal of Surgical Research. 120 (1), 37-46 (2004).
  33. Ishii, S., et al. Appropriate control of ex vivo gene therapy delivering basic fibroblast growth factor promotes successful and safe development of collateral vessels in rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 39 (3), 629-638 (2004).
  34. Tokunaga, N., et al. Adrenomedullin gene transfer induces therapeutic angiogenesis in a rabbit model of chronic hind limb ischemia: benefits of a novel nonviral vector, gelatin. Circulation. 109 (4), 526-531 (2004).
  35. Yamauchi, A., et al. Pre-administration of angiopoietin-1 followed by VEGF induces functional and mature vascular formation in a rabbit ischemic model. Journal of Gene Medicine. 5 (11), 994-1004 (2003).
  36. Zhong, J., et al. Neovascularization of ischemic tissues by gene delivery of the extracellular matrix protein Del-1. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 30-41 (2003).
  37. Shyu, K. G., Chang, H., Isner, J. M. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hindlimb ischemia. Life Sciences. 73 (5), 563-579 (2003).
  38. Kasahara, H., et al. Biodegradable gelatin hydrogel potentiates the angiogenic effect of fibroblast growth factor 4 plasmid in rabbit hindlimb ischemia. The Journal of the American College of Cardiology. 41 (6), 1056-1062 (2003).
  39. Rissanen, T. T., et al. Fibroblast growth factor 4 induces vascular permeability, angiogenesis and arteriogenesis in a rabbit hindlimb ischemia model. FASEB Journal. 17 (1), 100-102 (2003).
  40. Taniyama, Y., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat and rabbit hindlimb ischemia models: preclinical study for treatment of peripheral arterial disease. Gene Therapy. 8 (3), 181-189 (2001).
  41. Vincent, K. A., et al. Angiogenesis is induced in a rabbit model of hindlimb ischemia by naked DNA encoding an HIF-1alpha/VP16 hybrid transcription factor. Circulation. 102 (18), 2255-2261 (2000).
  42. Gowdak, L. H., et al. Induction of angiogenesis by cationic lipid-mediated VEGF165 gene transfer in the rabbit ischemic hindlimb model. Journal of Vascular Surgery. 32 (2), 343-352 (2000).
  43. Shyu, K. G., Manor, O., Magner, M., Yancopoulos, G. D., Isner, J. M. Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb. Circulation. 98 (19), 2081-2087 (1998).
  44. Witzenbichler, B., et al. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C/VEGF-2) promotes angiogenesis in the setting of tissue ischemia. The American Journal of Pathology. 153 (2), 381-394 (1998).
  45. Prochazka, V., et al. The Role of miR-126 in Critical Limb Ischemia Treatment Using Adipose-Derived Stem Cell Therapeutic Factor Concentrate and Extracellular Matrix Microparticles. Medical Science Monitor. 24, 511-522 (2018).
  46. Wang, J., et al. A cellular delivery system fabricated with autologous BMSCs and collagen scaffold enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (6), 1438-1447 (2012).
  47. Hao, C., et al. Therapeutic angiogenesis by autologous adipose-derived regenerative cells: comparison with bone marrow mononuclear cells. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 307 (6), H869-H879 (2014).
  48. Nemoto, M., et al. Adequate Selection of a Therapeutic Site Enables Efficient Development of Collateral Vessels in Angiogenic Treatment With Bone Marrow Mononuclear Cells. Journal of the American Heart Association. 4 (9), (2015).
  49. Mikami, S., et al. Autologous bone-marrow mesenchymal stem cell implantation and endothelial function in a rabbit ischemic limb model. PLoS One. 8 (7), (2013).
  50. Wang, S., et al. Transplantation of vascular endothelial growth factor 165transfected endothelial progenitor cells for the treatment of limb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 4967-4974 (2015).
  51. Yin, T., et al. Genetically modified human placentaderived mesenchymal stem cells with FGF2 and PDGFBB enhance neovascularization in a model of hindlimb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5093-5099 (2015).
  52. Annex, B. H. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischaemia. Nature Reviews Cardiology. 10 (7), 387-396 (2013).
  53. Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
  54. Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
  55. Monteforte, A. J., et al. Glypican-1 nanoliposomes for potentiating growth factor activity in therapeutic angiogenesis. Biomaterials. 94, 45-56 (2016).
  56. Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
  57. Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomaterialia. 42, 56-65 (2016).
  58. Das, S., Singh, G., Baker, A. B. Overcoming disease-induced growth factor resistance in therapeutic angiogenesis using recombinant co-receptors delivered by a liposomal system. Biomaterials. 35 (1), 196-205 (2014).
  59. Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2014).
  60. Shafat, I., Ilan, N., Zoabi, S., Vlodavsky, I., Nakhoul, F. Heparanase levels are elevated in the urine and plasma of type 2 diabetes patients and associate with blood glucose levels. PLoS One. 6 (2), (2011).
  61. Wang, Y., et al. Endothelial cell heparanase taken up by cardiomyocytes regulates lipoprotein lipase transfer to the coronary lumen after diabetes. Diabetes. 63 (8), 2643-2655 (2014).
  62. Fan, C. L., et al. Therapeutic angiogenesis by intramuscular injection of fibrin particles into ischaemic hindlimbs. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 33 (7), 617-622 (2006).
  63. Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Interventional Radiology. 16 (7), 991-998 (2005).
  64. Gowdak, L. H., et al. Adenovirus-mediated VEGF(121) gene transfer stimulates angiogenesis in normoperfused skeletal muscle and preserves tissue perfusion after induction of ischemia. Circulation. 102 (121), 565-571 (2000).
  65. Zhang, H., Wang, X., Guan, M., Li, C., Luo, L. Skeletal muscle evaluation by MRI in a rabbit model of acute ischaemia. The British Journal of Radiology. 86 (1026), 20120042 (2013).
  66. Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
  67. Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
  68. Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomateriala. 42, 56-65 (2016).
  69. Baker, A. B., et al. Regulation of heparanase expression in coronary artery disease in diabetic, hyperlipidemic swine. Atherosclerosis. 213 (2), 436-442 (2010).
  70. Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind Limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
  71. Popesko, P., Rajtová, V., Ji Horák, A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals. , Wolfe Publishing. London. (1992).

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Präklinische Modell von Hind Limb Ischemia in diabetischen Kaninchen
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Sligar, A. D., Howe, G., Goldman, J., Felli, P., Karanam, V., Smalling, R. W., Baker, A. B. Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits. J. Vis. Exp. (148), e58964, doi:10.3791/58964 (2019).

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