Summary
高脂血症と糖尿病のウサギに末梢虚血を誘導するために用いられる外科的処置について述べる。この手術は、患者における末梢動脈疾患において経験される状態の前臨床モデルとして作用する。血管造影はまた、導入された虚血及び灌流の回復の程度を測定するための手段としても説明する。
Abstract
末梢血管疾患は、世界中の数百万人の患者に影響を与える広範な臨床問題である。末梢血管疾患の主要な結果は、虚血の発症である。重度の症例では、患者は、絶え間ない痛みと四肢切断のリスクの増加を経験する重篤な四肢虚血を発症する可能性がある。末梢虚血のための現在の治療法は、バイパス手術または血流を回復するためにステントまたは atherectomy を用いた血管形成術などの経皮的介入を含む。しかし、これらの治療は、しばしば、血管疾患の継続的な進行、または再狭窄、または患者の全体的な不健康のために禁忌であることに失敗する。末梢虚血を治療する有望な潜在的アプローチは、患者が副血管系を開発することを可能にする治療的新生血管の誘導を伴う。この新たに形成されたネットワークは、患部に灌流を戻すことによって末梢虚血を軽減する。末梢虚血のための最も頻繁に使用される前臨床モデルは、大腿動脈結紮を介して健常ウサギにおける後肢虚血の作成を利用する。しかし、過去においては、前臨床試験の成功と末梢虚血の治療に関する臨床試験の失敗との間には、強い断絶がありました。健康な動物は、一般に、慢性末梢虚血の患者における減少した血管および再生とは対照的に、外科的に誘発された虚血に応答して、ロバストな血管再生を有する。ここでは、高脂血症や糖尿病を含むウサギの末梢虚血に最適な動物モデルについて述べる。このモデルはより高いコレステロールの食事を持つモデルと比較して担保形成および血圧の回復を減らした。従って、このモデルは、末梢血管疾患に付随する共通の合併症からの感染した血管新生を有するヒト患者とのより良好な相関を提供し得る。
Introduction
末梢動脈疾患 (PAD) は、アテローム硬化性プラーク形成の進行が身体の四肢における血管の狭窄につながる一般的な循環障害である。動脈硬化の危険因子の最近の増加は、糖尿病、肥満、および非活動性を含む、血管疾患1の罹患率の増加につながっている。現在、60歳以上の一般人口の 12% ~ 20% が末梢動脈疾患2を有すると推定されている。末梢動脈疾患の主要な結果は末梢虚血の発達であり、最も一般的に下肢に見られる。重症例では、患者は、重篤な四肢虚血、血流の不足による一定の痛みがある状態を発症することができる。重要な四肢虚血を有する患者は、診断の1年以内に1つの四肢を切断する可能性が 50% である。さらに、糖尿病患者は、末梢動脈疾患の発生率が高く、血管再生3,4の介入後により貧しい転帰を有する。末梢虚血のための現在の治療法は、atherectomy およびステントまたは外科的バイパスなどの経皮的介入を含む。しかし、多くの患者にとって、これらの治療は短期的な利益をもたらすだけであり、多くは主要な外科的処置のために十分に健康ではありません。本研究では、糖尿病状態の文脈における外科的結紮によるウサギの末梢虚血の発生を組み込んだ末梢血管疾患を標的とする新たな治療法を試験するための前臨床動物モデルについて述べる。
ウサギにおける後肢虚血モデルは、半世紀5,6にわたってヒト研究に対する閉塞性血管疾患および前臨床前駆体の生理学的モデルとして使用されてきた。ウサギはしばしば足首とふくらはぎの筋肉の発達した筋肉による末梢虚血の研究のための好ましい種であります, ungulates されている一般的な大型動物モデルとは対照的に (蹄と動物).いくつかの最近のレビューは、人間の7,8の末梢血管疾患のモデル化にこのモデルと他の人の使用に対処しています。ウサギにおける後肢虚血を用いた類似モデルは、成長因子9、10、11、12、13、14の前臨床試験で使用され、 15、16、17、18、19、20、遺伝子治療21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、および幹細胞45、46、47、48、49、50 、51は四肢における治療的血管新生についての。残念なことに、これらの成功した動物研究に従った臨床試験は、患者52にとって有意な利益を示さなかった。
この翻訳不全の理由の一つの示唆された説明は、ヒト患者における末梢虚血の状態が、血管新生シグナル53、54、55に対する耐性を含むものであることである、56,57,58,59いくつかの研究は、糖尿病および高血糖の血管新生シグナル伝達経路の欠陥を示している。糖尿病および高脂血症は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの消失と、ヘパラン硫酸を切断する酵素の増加につながり、成長因子を持つ治療的血管新生/arteriogenesis に対する耐性の可能性のある機構を提示する60,61. したがって、末梢虚血のためのモデルの重要な特徴は、治療がヒト患者に存在する病状の文脈において評価され得るように治癒性の態様を含むべきである。
本研究では、大腿動脈の外科的結紮による末梢虚血のウサギモデルについて述べる。糖尿病や高脂血症の誘導によるリードイン期間がモデルに組み込まれています。このモデルを、糖尿病を伴わない高脂肪食を組み込んだ別のモデルと比較し、糖尿病のモデルと高脂血症のレベルが血管の成長を抑えるのに有効であることを発見しました。当社のモデルは、別々のグループによって使用されてきた進歩を組み合わせたもので、末梢血管疾患研究において一貫した結果を得るための実用的で標準的な方法を提供することを目的としています
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物を含む研究は、オースティンのテキサス大学とヒューストンの UTHealth 科学センター (IACUC)、米国陸軍の動物ケアと使用レビューオフィス (ACURO) の承認を得て行われました研究保護の医学研究と物資コマンドオフィス, 動物ケアのための NIH ガイドラインに従って.
1. 糖尿病・高脂血症の誘発
- 標準アルファルファの1カップから 0.1% までの4日間の間にコレステロールのチョウにニュージーランドのウサギ (4-6 ヶ月) を移行してください。1 ~ 5 日の間は、標準のチョウを1:0、3:1、1:1、1:3、0:1 のコレステロールの比率にそれぞれ使用してください。0.1% コレステロールのチョウに2週間後、以下の手順で説明されるようにアロキサン注射を使用して糖尿病にウサギを誘導する
- 22グラムのカテーテルを使用して周辺の左耳静脈にカテーテルを導入することにより、35-75 mg/mL のケタミンと 1-2 mg/mL の対するアセプロマジンを使用して、皮下注射および IV 注入の準備を介してウサギを鎮静させる。
- ベースライン血糖値 (BGL) 測定のための耳静脈カテーテルのハブを介してウサギからの血液の一滴を収集する。任意の標準グルコメーターを使用できます。ウサギの通常のグルコースレベルは、典型的には80〜 150 mg/dL の範囲である。
- 100 mg/kg でアロキサンを注入して、耳カテーテルを通して 8 mL の容積に、シリンジを使用して8分間にゆっくりと10ミリリットルの量に再構成した。
- 低血糖を監視するために標準的なグルコメーターを使用して次の 12 h のために、1時間ごとに BGL をチェックしてください。
- ウサギを拘束具に入れます。
- 2.5% リドカイン/2.5% プリロカインクリームで耳を麻酔。
- 27グラムの針を使用して横耳静脈から血液を取り、標準メーターを使用して BGL を測定します。
- 最初の7日間は、BGL を1日2回測定します。BGL が 350 mg/dL に達するか、または超えた場合、ウサギにインスリンの注射を与えます。
- 手術の日前に血管の間にサイズのマーカーとして注入のための 3 mm のステンレス鋼の球を準備しなさい。
- 生検パンチを使用して、より大きなシートから10mm の円形のシラスティックをカットします。
- クリアシリコーンシーラントを使用してシートの中央にボールをマウントします。
- 完全にシール材でボールをカバーしています。シーリング材を24時間以上硬化させます。
- 開いた2インチ x 3 インチの低密度ポリエチレン袋にボールを置き、エチレンオキサイドガスで滅菌する滅菌バッグに入れます。
2. 手術用ウサギの作製
- 麻酔は、皮下注射によって20〜 40mg/kg のケタミンと 2mg/kg ミダゾラムを使用してウサギを投与する。ウサギを 1.5% に置きなさい– 3% イソフルラン (通常 2%)マスクを使用して最初の鎮静を通して。3 mg/kg の筋肉内注射を介して麻酔を維持するために alfaxalone の注射を与えます.
- 麻酔をしたら、マスクを外し、カフされた気管内チューブを気道に挿入し、人工呼吸器に接続します。1.5% – 3% でイソフルランを管理し続けます。
- ベースライン化学パネルのいずれかの耳から中央動脈から血液を収集します。.
- Lactated の解決のための横の耳の静脈に 22 G の耳の静脈のカテーテルを外科プロシージャ中置く。あるいは、通常の食塩水 (0.9% 塩化ナトリウム) を使用することができる。
- 反対側の耳の横静脈を使用して、静脈にカテーテルを置き、6 mg/kg/h で alfaxalone を提供します。 alfaxalone を 8 mg/kg/h に徐々に増加させながら、イソフルランを準備期間中に 0.6% に減少させる。
- 痛みや感染のリスクを制限するには、25 G 針で皮下注射を使用してブプレノルフィン (0.01 mg/kg) およびエンロフロキサシン (5mg/kg) を投与する。
- 首の毛、左右の太もも、そしてバリカン (#40 ブレード) を使用して背中をトリムします。髪は、接地パッドとの接触を維持するために、背面から除去されます。
- それぞれの後肢に血圧カフを配置し、初期血圧を測定する。側面のホックのすぐ上の調査と膝のすぐ下に袖口を置きなさい。
- 背中の手術台にウサギを置き、手術部位をスクラブしてドレープします。これには、大腿動脈へのアクセスに使用される頸部の頸動脈アクセスの首と右大腿部が含まれます。2% クロルヘキシジンおよび 70% エチルアルコールを交互にスクラブして滅菌スクラブを行います。これを3回繰り返し、次に 2% クロルヘキシジン溶液で最終スプレーを適用します。
- 低密度 polyethyene 袋の中で滅菌された 3 mm ステンレス鋼球を、大腿上部近くの右 (スクラブ) 脚の上に置き、血管造影図測定時のサイズ基準としての役割を果たします。手術の時まで脚に無菌のドレープを置きます。最初の血管造影図中に、滅菌プラスチックバッグの内側にボールを残します。
3. 血管造影
- 右の共通頚動脈を露出させる
- #15 の刃が付いているメスを使用して気管のちょうど横に 4-5 cm の長い切り傷を作りなさい。
- 頸動脈を露出させ、小さい Weitlaner のレトラクターを使用して切開を開けるために鈍い解剖を使用しなさい。慎重に頚静脈と迷走神経から頸動脈を分離します。.典型的には、湾曲した Metzenbaum はさみと湾曲した蚊の hemostat が鈍い解離のために使用される。結紮が動脈のみに合字になるように、神経と頚静脈から頚動脈を完全に分離してください。
- 露出した動脈の近位および遠位端に4-0 シルク縫合糸を使用して合字を配置する。外科医の結び目と4つの正方形の結び目に続く頸動脈の遠位端を結んでください。近位端で、ligaloop を使用して必要に応じて締め付けたり緩めたりすることができます。露出された動脈の近位端に配置された ligaloop の使用は、導入器およびカテーテルを固定するのを助けることができる。
- IV を通して500のヘパリンの IU を管理しなさい。露出した頸動脈に沿って塗布された約 0.5 mL の 1% リドカインを使用して、血管を拡張する。通常は1つの処理で十分ですが、必要に応じて繰り返すことができます。メスか虹彩はさみを使用して頸動脈を通っておよそ半分の方法で切り、次に4インチのワイヤー挿入用具を動脈に置く。
- 0.014 インチ x 185 cm ガイドワイヤを挿入ツールを通して、降下大動脈の腸骨堤の大動脈分岐部に送ります。挿入ツールを取り外し、3F ピグテール低かっカテーテルをワイヤーの上に挿入します。
- ピグテールカテーテルを、降下大動脈の腸骨堤にある大動脈分岐点の近位に2cm まで進めます。
- 7番目の腰椎と最初の仙骨脊椎の間にカテーテルの先端を配置します。2-4 mL の造影剤を手動で注入してカテーテルの位置をテストします。
- 血管内注射を投与する100μ g のニトログリセリンをカテーテルを通して拡張を高めるために.
- 血管造影図中に血管拡張を支援するためにカテーテルを通してウサギに 1% リドカイン 0.8 mL を投与する。注射器用のチューブをカテーテルに取り付け、ライン内の気泡を除去します。カテーテルを通した自動低かっの注入器を使用して対照の媒体の 8-9 mL を注入しなさい。
- 血管造影を使用して後肢のシリアル画像を記録します。
- 合計 8-9 mL の 3 mL/秒でコントラストを注入するパワーインジェクタを設定します。毎秒6フレームでデジタル減算血管造影を実行します。
- 作成されたシリアル画像を選択し、約-40% の設定を使用して、各血管造影図の写真を変更して、骨の外観を最小限に抑え、コントラストのある血管灌流の完全な画像をキャプチャします。大腿動脈結紮/切除後の血管流の血管造影図例を図 1に示す。
4. 大腿動脈の単離
- メス (#15 ブレード) を使用して右大腿動脈の皮膚の縦方向の切開を行います。切開部がちょうど上部蓋 (約 6cm) に近位の領域で終わる鼠径靭帯から inferiorly を拡張することを確認してください。
- 大腿動脈を露出させるために湾曲した Metzenbaum はさみまたは湾曲した蚊 hemostat との鈍い解剖を使用してください。
- Weitlaner レトラクターを使用して切開部を開いたままにします。
- 神経刺激を軽減し、血管拡張を促進するために、局部的に 1% リドカインの 0.5 mL を加えます。
- 下腹部、深い大腿骨、横の曲折アクセント、および表面的な上腹部動脈を含む大腿動脈のすべての枝と共に大腿動脈の全体の長さを解放するためにティッシュの鈍い解剖を続けてください (図 2a).
- さらに、膝窩および伏在動脈ならびに外腸骨動脈に沿って解剖する (図 2a)。定期的に組織の損傷から保護するために生理食塩水で領域を湿ら。鈍い解離が大腿骨の溝 (筋肉の間) に沿って行われる場合、筋肉を切断する必要はない。
- 図 2b、Cに示すように静脈と神経から動脈を慎重に分離する。結紮と図で示された動脈は、動脈を切断するのに十分なスペースを持つ2つの関係を配置することによって4.0 の絹の縫合糸を示した。これらの関係は、4つの正方形の結び目に続く外科医の結び目と行われる。
- Metzenbaum の小さなはさみを使って結紮した動脈の2つの結びつきの間で切断します。大腿動脈を外側の腸骨動脈の枝として遠位し、伏在と膝窩動脈を形成するカテゴライザの点を示す。
5. 血管造影を繰り返す
- 四頭筋肉の上部に 3 mm のステンレス鋼の球とのシラスティックシートを、付けるために4-0 の絹の縫合線を使用しなさい。それが所定の位置にある後、ボールの上に皮膚を引っ張ります。
- 血管内注射を投与する100μ g のニトログリセリンをカテーテルを通して拡張を高めるために.
- 必要であれば、血管造影図の間に血管拡張を助けるためにカテーテルを通してウサギに 1% リドカインの別の 0.8 mL を投与する。
- 自動低かっインジェクタを使用して、8-9 mL のコントラスト・メディアを注入します。
- ステップ3.9 で説明されるように血管造影を行う。
6. 創傷閉鎖および回収
- 右動脈からカテーテルを取り外します。動脈のまわりに既にある4-0 の絹の縫合線を使用して動脈を結ぶ。
- 両方の傷を縫合する。4-0 polydioxanone または 3-0 polyglactin 910 を使用して、テーパー針 (材料の表を参照) を連続した縫合パターンで、筋肉と subcuticular の層を閉じます。埋められた連続的な subcuticular の縫合線パターンの逆の切断の針 (材料のテーブルを見なさい) の 4-0 polydioxanone か 4-0 polyglactin 910 を使用して皮を閉めなさい。
注: 使用可能な場合は、両方の polydioxanone が優先されます。 - 25 G 針で注射器を使用して切開部の近くに 0.25% ブピバカインの皮内注射を投与する。針を挿入し、針が戻っている間 0.5 mL を注入します。.首の切開のための創傷の側あたり1つの注射 (首に2回の注射) と脚の切開用の創傷の2つの注射 (脚に4回の注射; 合計で6つの注射) を与えます。注入される総容積は3つの mL (0.5 mL x 6 の注入) である。
- 0.5 mg/kg メロキシカムの皮下注射を管理し、持続放出ブプレノルフィンで 0.12 mg/kg.
- それは麻酔から回復するようにウサギを監視します。ウサギは、麻酔から目覚めると、自動的に飲み込まれ始めます。嚥下反応が発生したら、気管内チューブを外す。うさぎが心血管機能と体温を維持できるようになるまで、綿密なモニタリングと熱サポートを提供します。それが歩行することができたら、その筐体にウサギを返します。
- ウサギが手術後にチョウを許容しない場合は、新鮮な野菜および/または、皮下食塩水注射と一緒にクリティカルケアダイエットの注射器を使用します。キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、にんじん、その他旬の野菜を使用できます。野菜を細断し、食べに戻ってウサギを助けるためにそれらを一緒に混ぜる。
7. モニタリング
- ステップ2.8 で説明されているように、2週間ごとにウサギを麻酔して両足の血圧を獲得する。血液化学アッセイに使用するために耳の中央動脈から血液を採取する。あるいは、伏在静脈または頭部静脈から血液を取る。各時点で約2ml を服用してください。分析のための標準的な血液化学パネルを使用してください。必要に応じて、低密度リポタンパク質 (LDL)、高密度リポタンパク質 (HDL)、またはヘモグロビン A1c (HbA1c) のためのテストを追加します。
- BGL 測定のための血液の非常に少量を取ります。
8. 治療
- 治療、キャリア、および架橋剤で10個のシリンジを準備します。100μ l の硫酸カルシウムスラリーを使用する前に各注射器を充填し、次いで、アルギン酸ナトリウムの 2% を、アルギン酸塩がシリンジの先端に最も近いような成長因子または他の治療とともに100μ l の。
- 次を準備する前に、筋肉に1つの準備注射を管理します。.これにより、アルギネートオリゴマーがシリンジ内の硫酸カルシウムと相互作用する時間が短縮される。大腿骨動脈の両側に沿って、注射を均等にスペースします。均一な注射を達成するために、他の研究19で説明したように、注射を導くための穴を有するシリコーンシートを作成します。これは商用化されたシリコーンのシートで穴を作成するのにバイオプシーの穿孔器の使用によって容易に準備することができる。
9. エンドポイント血管造影、安楽死、灌流固定および組織採取
- 終点の日付で、手順3で説明したように血管造影を行いますが、アクセスには左頚動脈を使用します。
- 血管造影の後, 剖検表に動物を移動し、後肢組織を維持するために灌流固定を実行します。
- 3% – 4% にイソフルランを増加させ、麻酔が十分に深いことを確認するためにつま先のピンチを実行します。
- 1000-2000 のヘパリンの IU を静脈内投与する。
- 胸部の正中線に沿って切開を作成し、#20 ブレードを持つメスを使用してダイヤフラムの長さをスパンします。
- リブケージを露出させたまま、リブカッターを使用して正中線の左にあるリブをカットします。心臓を露出させるために Weitlaner レトラクターを使用してください。
- 1/8 インチの内径と18G 針を持つ出力チューブとポンプを設定します。生理食塩水でラインをプリロードし、灌流用の別々の容器に調製された生理食塩水およびホルマリンを少なくとも 600 mL 有する。
- ポンプに接続された 18 G の針を、心臓の頂点を介して左心室に挿入します。別の18グラムの針 (何も付着していないもの) を右心房に挿入し、血液が剖検表のダウンドラフトに流出するのを許す。
- 灌流ポンプを使用して、約 500 mL の生理食塩水の流れを心臓に制御します。110 mL/min を流れるためにポンプ設定を使用してください。
- 心臓から来る液体がはっきりしたら、生理食塩水のリザーバから 10% のホルマリン溶液で満たされたものにチューブを移動させる。灌流が正常に機能していれば、4本の手足すべてにけいれんが起こる。左心室に約 500 mL のホルマリン溶液を注入する。
- ポンプをオフにして、心臓から針を取り除きます。
- #20 刃を持つメスで股関節を切断して腰の両後肢を除去します。四肢を削除するには、小さなリブカッターを使用します。非虚血性四肢をコントロールとして使用します。
- 4° c で24時間ホルマリンに手足を保存し、4° c で 70% エタノールに保存します。
- 組織学的分析のために、手足から複数の生検を取る。両肢で大腿部とふくらはぎを横切って地域で採取された 6 mm の生検8個を使用しています。
注: 足首血圧測定および血管造影が血流の回復を測定するための最も一般的に使用される方法である間、他の方法はドップラー超音波、レーザードップラーイメージ投射、赤外線を含む動物の回復を追跡するのに使用することができるサーモグラフィー62、微小球は灌流63、64、ct 画像、および磁気共鳴画像 (MRI)65を決定した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
糖尿病の誘導および 0.1% コレステロール食の開始に続いて、糖尿病およびコレステロール食によるウサギの総コレステロールは、123.3 ± 35.1 mg/dL (n = 6 雄ウサギ) 平均全体的な時間点およびウサギであった。これらのウサギの BGL レベルは、248.3 ± 50.4 mg/dL (n = 6 雄ウサギ) であった。典型的なウサギの血液化学および下肢の血圧比のための時間経過は、より高いコレステロールの食事 (1% コレステロール) 下のウサギと比較して図 3に示されている。非糖尿病動物では、コレステロールが高くても、最後の時点で虚血性下肢の血圧の回復が血管、血管では上昇していることがわかった (図 3)。高コレステロール/脂肪食の動物もリポタンパク質 A の増加レベルを示しました, 肝臓へのストレスを示唆しています。.したがって、より低いレベルのコレステロールを有する糖尿病は、研究エンドポイントにおいてより侵害された灌流につながった。組織学的には、いくつかの場所で浮腫および虚血性損傷と一致する筋肉構造の変化がある図 4.場合によっては、虚血による筋線維の変化/損傷を観察することができる。これは、組織学的分析における筋線維の喪失または崩壊として観察することができ、マウスにおけるいくつかの後肢虚血モデルにおいて観察されてきた。しかし、これらの変化を組織の処理における細胞学的成果物と区別するためには注意が必要である。PECAM およびαSMA のための免疫染色は、組織切片中の血管およびより大きい血管の数を識別するために使用することができる (図 4)。全体的に、低レベルのコレステロール食と糖尿病を使用してモデルは、血圧の反復可能な欠損を生成し、糖尿病なしの高コレステロールダイエットモデルに血管新生します。
図 1: 糖尿病および非糖尿病のウサギの前手術、術後、および大腿動脈結紮および切除後70日間の回復後の後肢の血管。(A) 虚血性四肢の血管造影図 (左) と対四肢のコントロール (右)(B) 結紮部位における虚血性四肢の拡大像。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 大腿動脈結紮および切除によるウサギの後肢虚血の誘導。(A) ウサギ後肢の血管解剖学の図。動脈を結紮するためにマークされたすべてのポイントでネクタイを置きます。変更し、アクセス許可71で使用します。(B) 結紮前の大腿動脈への切り込みを示す手術野。(C) 後肢虚血を誘発するための酵素を有する大腿動脈。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: モデルの経過にわたる後肢虚血を伴うウサギの典型的な血圧と血液化学糖尿病/MC のグループは 0.1% コレステロールの食事療法を与えられるように誘導されました。非糖尿病/HC 基は、1% コレステロール食を与えられた。BGL = 血糖値。TC = 総コレステロール。リパ = リポタンパク質 (a).BP = 虚血性下肢と非虚血性四肢の血圧比この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 大腿骨動脈結紮後70日目の糖尿病性ウサギにおける後肢の筋肉の組織学的分析。H & E 染色と同様に内皮マーカーに対する免疫組織化性染色、PECAM、および血管平滑筋細胞マーカー、αSMA が行われた。組織試料は、虚血性四肢および非虚血性対制御肢から生検した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
糖尿病と高脂血症のウサギに後肢虚血を誘導するための前臨床モデルを提示した。多くの研究では、ウサギの後肢下肢虚血を作成するために使用される技術には曖昧さがある。マウスにおいて、後肢虚血からの重症度及び回復は、虚血を誘導するために用いられるライゲーション及び技法の位置に大きく依存する。この研究において提示される技術の意義は、糖尿病性動物において8週間後に完全に回復しない虚血の一貫した誘導を可能にすることである。特に、動物がより高いコレステロールおよび脂肪食を与えられたとき、それらは四肢の血圧比のベースラインレベル近くまで回復することができた。さらに、より高い脂肪の食事で、動物は肝臓の損傷を示唆する肝酵素の変化を持っていました。したがって、コレステロール/脂肪の低いレベルを有する糖尿病モデルは、四肢における慢性虚血のより一貫性があり、関連するモデルであると思われる。
糖尿病の誘導、血管造影、大腿動脈の外科的結紮、治療の適用を含む4つの重要なステップをこのモデル内で強調することができます。これらのステップの中で、糖尿病の誘導は、最も重要なステップの1つであり、各実験室のためにさらなる最適化を必要とする1つであった。アロキサン注射の割合は、ウサギのアロキサンによる糖尿病の誘導の毒性および有効性を変化させる主要な要因である。あまりにも速く注入すると、アロキサンは BGL の不安定さとウサギの死を引き起こした。これは、デキストロース溶液の注射または他の場合には非常に高い BGL によって解決されない低血糖として観察されることがあります。あまりにもゆっくり注入した場合、ウサギはしばしば糖尿病になりません。このパラメータは、異なるソースからのウサギのために最適化される必要がある可能性があります。ウサギは、通常、1-3 h の高血糖になりますが、BGL がドロップを開始します。したがって、通常、糖尿病誘導の日にインスリンは投与されない。しかし、BGL が最初の24時間で 100 mg/dL を下回った場合、10.0 mL の 5% デキストロース溶液を皮下に注入するか、または 10% デキストロース溶液への水供給を変更することによって増加させることができる (典型的には一晩で十分である)。インスリンが投与されるたびに、余分な BGL テストは、グルコースレベルが低すぎる低下しないことを保証するために行われます。インスリン応答性は、しばしばウサギごとに異なります。したがって、個々の投与レジメンは、ウサギがインスリンにどのように反応するかに基づいて BGL を正常化するために使用される。糖尿病は、典型的には、アロキサン注射に続く2-3 日後に誘導される。
末梢血管疾患および四肢虚血の前臨床モデルとして、提示されたモデルはいくつかの潜在的な制限を有する。アロキサンによる糖尿病の誘導は、I 型糖尿病の急速な発展につながる。これは、ヒト患者において最も普及している II 型糖尿病の慢性的な発達とは対照的である。さらに、虚血は、血管疾患およびアテローム硬化性斑の慢性的な発達によるものではなく、外科的結紮によって急性に発症する。ウサギの使用の根本的な制限は、動物モデルとしての脆弱性です。動物は、I 型糖尿病との組み合わせで高脂血症の限られた量を容認し、動物の死を持つことなく、疾患の最大量を最適化することは、このプロトコルを作成する上での主要な目標であった。我々のグループは、末梢虚血を有する患者が血管新生成長因子に対する治療抵抗性を発症し、これが虚血66に対する成長因子ベースの治療薬の障害において主要な役割を果たす可能性があると仮定した。この目的のために、我々は、細胞表面プロテオグリカンの損失を示しており、動物およびヒト組織試料中のヘパラナーゼの増加55、58、67、68、69、70.ここに記載されているウサギのモデルが成長因子耐性を示しているかどうかは不明であるが、高高脂血症モデルに比べて糖尿病と中等度高脂血症モデルとの間により長期虚血があるという観察は示唆する血管再生のプロセスにはいくつかの赤字があります。
モデルに治療法を含めるためには、急性治癒期が介入なしに起こることを可能にするために、虚血の誘導に続く回復期間を有することが重要である。この間に療法が与えられれば、応答は末梢血管疾患を特徴付ける慢性虚血ではなく急性虚血に対する応答を増強するのにより関連性があるであろう。このようなモデルは、外傷または血栓症における急性虚血性傷害に関連し得るが、慢性虚血と良好な相関を提供しない可能性が高いであろう。健常動物における虚血の前臨床モデルにおける陽性結果と臨床試験の結果との間の相関が乏しいことから、糖尿病または血管再生を減少させる別の因子を含めることは、不在は、将来の治療法の作成のための人間の四肢虚血。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
著者は感謝して国防総省 Congressionally 監督研究プログラム (DOD CDMRP;W81XWH-16-1-0582) から ABB および RS への。著者らはまた、米国心臓協会 (17IRG33410888)、DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) および国立衛生研究所 (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) から ABB への資金提供も認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Henry Schein Medical | 1537468 / 1531434 | 250 mL bag / 1000 mL irrigation btl |
| 1 mL Syringe | VWR | BD309628 | |
| 10 mL Syringe | VWR | BD309695 | |
| 10% Formalin | Fisher-Scientific | 23-245684 | |
| 18G Needle | VWR | 89219-294 | |
| 20G Needle | VWR | 89219-340 | |
| 25G Needle | VWR | 89219-290 | |
| 27G Needle | VWR | 89219-288 | |
| 5 mL Syringe | VWR | BD309646 | |
| 5% Dextrose | Patterson Veterinary | 07-800-9689 | |
| Acepromazine | Patterson Veterinary | VEDC207 | |
| Alfaxalone | Patterson Veterinary | 07-891-6051 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | PHR1471-1G | |
| Alloxan Monohydrate | Sigma-Aldrich | A7413 | |
| Angiography Equipment | Toshiba | Infinix-i | |
| Angiography Injector | Medrad | ||
| Anti-Mouse Ab Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | Secondary Antibody for IHC |
| Anti-Rabbit Ab Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary Antibody for IHC |
| a-SMA Antibody | Abcam | ab5694 | Primary Antibody for IHC |
| Baytril | Bayer Animal Health | 724089904201 | Enrofloxacin |
| Blood Chemistry Panel | IDEXX | 2616 | Rabbit Panel |
| Blood Pressure Cuff | WelchAllyn | Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7 | |
| Blood Pressure Monitor | Vmed Technology | Vmed Vet-Dop2 | |
| Bupivacaine | Henry Schein Medical | 6023287 | |
| Buprenorphine | Patterson Veterinary | 42023017905 | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Calcium Sulfate | CB Minerals | Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC | |
| Chlorhexidine Scrub | Patterson Veterinary | 07-888-4598 | |
| Chloroform | Fisher-Scientific | C298-4 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8503 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Ear Vein Catheter | Patterson Veterinary | SR-OX165 | Surflo IV catheters |
| Endotracheal tube | Patterson Veterinary | Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size | |
| Glucometer | Amazon | B001A67WH2 | Accu-Chek Aviva |
| Glucometer Test Strips | McKesson Medical-Surgical | 788222 | Accu-Chek Aviva Plus |
| Guidewire | Boston Scientific | 39122-01 | |
| Hair Clippers | Amazon | B000CQZI3Q | Oster #40 blade |
| Heating Pad | Cincinnati Subzero | 273 | |
| Heating Pad Pump | Gaymar | Gaymar T/Pump | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | Curved Mosquito Hemostat |
| Heparin | Patterson Veterinary | ||
| Insertion Tool | Merit Medical Systems | MAP550 | metal wire insertion tool |
| Insulin | HPB Pharmacy | Novalin R & Novalin N | |
| Insulin Syringes | McKesson Medical-Surgical | 942674 | |
| Introducer | Cook Medical | G28954 | 3F Check Flo Performer Introducer |
| Isoflurane | Henry Schein Medical | 1100734 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 856440301 | |
| Lactated Ringers | McKesson Medical-Surgical | 186662 | |
| Lidocaine | McKesson Medical-Surgical | 239936 | |
| Lidocaine/Prilocaine cream | McKesson Medical-Surgical | 761240 | |
| Ligaloop | V. Mueller | CH117 / CH116 | White Mini / Yellow Mini |
| Mazola Corn Oil | Amazon | B0049IIVCI | |
| Medrad Syringe | McKesson Medical-Surgical | 346920 | 150 mL |
| Meloxicam | Patterson Veterinary | ||
| Metal ball sutures | Ethicon-Johnson & Johnson | K891H | 4-0 silk C-1 30" |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14019-13 | |
| Midazolam | Henry Schein Medical | 1215470 | |
| Nitroglycerin | McKesson Medical-Surgical | 927528 | |
| PECAM Antibody | Novus Biologicals | NB600-562 | Primary Antibody for IHC |
| Perfusion Pump | Masterflex | ||
| Pigtail Catheter | Merit Medical Systems | 1310-21-0053 | 3F pigtail |
| Polydioxanone (PDS II) suture | McKesson Medical-Surgical | 129271 | 4-0 taper RB-1 (needle comes on suture) |
| Polydioxanone (PDS II) suture | McKesson Medical-Surgical | 129031 | 4-0 reverse cutting FS-2 |
| Polyglactin 910 (Vicryl) suture | Butler | 7233-41 | 3-0 taper RB-1 |
| Polyglactin 910 (Vicryl) suture | McKesson | 104373 | 4-0 reverse cutting FS-2 |
| Rabbit Chow (Alfalfa) | LabDiet | 5321 | |
| Rabbit Restrainer | VWR | 10718-000 | |
| Rib Cutters | V. Mueller | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10015-00 | #15 blade |
| Silk Sutures | Ethicon-Johnson & Johnson | A183H | 4-0 silk ties 18" |
| Stainless Steel Ball | McMaster-Carr | 1598K23 | 3-mm diameter |
| Surgical Drapes | Gepco | 8204S | |
| Syringe Pump | DRE Veterinary | Versaflow VF-300 | |
| Visipaque contrast media | McKesson Medical-Surgical | 509055 | |
| Weitlaner Retractor | Fine Science Tools | 17012-13 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
- Shammas, A. N., et al. Limb Outcomes Following Lower Extremity Endovascular Revascularization in Patients With and Without Diabetes Mellitus. Journal of Endovascular Therapy. 24 (3), 376-382 (2017).
- Tunstall-Pedoe, H., Peters, S. A. E., Woodward, M., Struthers, A. D., Belch, J. J. F. Twenty-Year Predictors of Peripheral Arterial Disease Compared With Coronary Heart Disease in the Scottish Heart Health Extended Cohort (SHHEC). Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Whiteley, H. J., Stoner, H. B., Threlfall, C. J. The effect of hind limb ischaemia on the physiological activity of rabbit skin). British Journal of Experimental Pathology. 34 (4), 365-375 (1953).
- Longland, C. J.
- Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 773-780 (2004).
- Krishna, S. M., Omer, S. M., Golledge, J. Evaluation of the clinical relevance and limitations of current pre-clinical models of peripheral artery disease. Clinical Science (London. 130 (3), 127-150 (2016).
- Zhou, J., et al. Therapeutic angiogenesis using basic fibroblast growth factor in combination with a collagen matrix in chronic hindlimb ischemia). ScientificWorldJournal. , 652794 (2012).
- Prochazka, V., et al. Therapeutic Potential of Adipose-Derived Therapeutic Factor Concentrate for Treating Critical Limb Ischemia. Cell Transplantation. 25 (9), 1623-1633 (2016).
- Cao, R., et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2. Nature Medicine. 9 (5), 604-613 (2003).
- Doi, K., et al. Enhanced angiogenesis by gelatin hydrogels incorporating basic fibroblast growth factor in rabbit model of hind limb ischemia. Heart and Vessels. 22 (2), 104-108 (2007).
- Nitta, N., et al. Vascular regeneration by pinpoint delivery of growth factors using a microcatheter reservoir system in a rabbit hind-limb ischemia model. Experimental and Therapeutic. 4 (2), 201-204 (2012).
- Karatzas, A., et al. NGF promotes hemodynamic recovery in a rabbit hindlimb ischemic model through trkA- and VEGFR2-dependent pathways. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 62 (3), 270-277 (2013).
- Stachel, G., et al. SDF-1 fused to a fractalkine stalk and a GPI anchor enables functional neovascularization. Stem Cells. 31 (9), 1795-1805 (2013).
- Asahara, T., et al. Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. Circulation. 92, 365 (1995).
- Morishita, R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human recombinant hepatocyte growth factor in rabbit hind limb ischemia model as cytokine supplement therapy. Hypertension. 33 (6), 1379-1384 (1999).
- Walder, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor augments muscle blood flow and function in a rabbit model of chronic hindlimb ischemia. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 27 (1), 91-98 (1996).
- Anderson, E. M., et al. VEGF and IGF Delivered from Alginate Hydrogels Promote Stable Perfusion Recovery in Ischemic Hind Limbs of Aged Mice and Young Rabbits. Journal of Vascular Research. 54 (5), 288-298 (2017).
- Xie, J., et al. Induction of angiogenesis by controlled delivery of vascular endothelial growth factor using nanoparticles. Cardiovascular Therapeutics. 31 (3), e12-e18 (2013).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Ohara, N., et al. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in a rabbit model of hind limb ischemia. Gene Therapy. 8 (11), 837-845 (2001).
- Pyun, W. B., et al. Naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor induces collateral artery augmentation in a rabbit model of limb ischemia. Gene Therapy. 17 (12), 1442-1452 (2010).
- Kupatt, C., et al. Cotransfection of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-B via recombinant adeno-associated virus resolves chronic ischemic malperfusion role of vessel maturation. Journal of the American College of Cardiology. 56 (5), 414-422 (2010).
- Olea, F. D., et al. but not single, VEGF gene transfer affords protection against ischemic muscle lesions in rabbits with hindlimb ischemia. Gene Therapy. 16 (6), 716-723 (2009).
- Pinkenburg, O., et al. Recombinant adeno-associated virus-based gene transfer of cathelicidin induces therapeutic neovascularization preferentially via potent collateral growth. Human Gene Therapy. 20 (2), 159-167 (2009).
- Katsu, M., et al. Ex vivo gene delivery of ephrin-B2 induces development of functional collateral vessels in a rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 49 (1), 192-198 (2009).
- Korpisalo, P., et al. Therapeutic angiogenesis with placental growth factor improves exercise tolerance of ischaemic rabbit hindlimbs. Cardiovascular Research. 80 (2), 263-270 (2008).
- Chen, F., Tan, Z., Dong, C. Y., Chen, X., Guo, S. F. Adeno-associated virus vectors simultaneously encoding VEGF and angiopoietin-1 enhances neovascularization in ischemic rabbit hind-limbs. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (4), 493-502 (2007).
- Kobayashi, K., et al. Combination of in vivo angiopoietin-1 gene transfer and autologous bone marrow cell implantation for functional therapeutic angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (7), 1465-1472 (2006).
- Lee, J. U., et al. A novel adenoviral gutless vector encoding sphingosine kinase promotes arteriogenesis and improves perfusion in a rabbit hindlimb ischemia model. Coronary Artery Disease. 16 (7), 451-456 (2005).
- Nishikage, S., et al. In vivo electroporation enhances plasmid-based gene transfer of basic fibroblast growth factor for the treatment of ischemic limb. Journal of Surgical Research. 120 (1), 37-46 (2004).
- Ishii, S., et al. Appropriate control of ex vivo gene therapy delivering basic fibroblast growth factor promotes successful and safe development of collateral vessels in rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 39 (3), 629-638 (2004).
- Tokunaga, N., et al. Adrenomedullin gene transfer induces therapeutic angiogenesis in a rabbit model of chronic hind limb ischemia: benefits of a novel nonviral vector, gelatin. Circulation. 109 (4), 526-531 (2004).
- Yamauchi, A., et al. Pre-administration of angiopoietin-1 followed by VEGF induces functional and mature vascular formation in a rabbit ischemic model. Journal of Gene Medicine. 5 (11), 994-1004 (2003).
- Zhong, J., et al. Neovascularization of ischemic tissues by gene delivery of the extracellular matrix protein Del-1. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 30-41 (2003).
- Shyu, K. G., Chang, H., Isner, J. M. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hindlimb ischemia. Life Sciences. 73 (5), 563-579 (2003).
- Kasahara, H., et al. Biodegradable gelatin hydrogel potentiates the angiogenic effect of fibroblast growth factor 4 plasmid in rabbit hindlimb ischemia. The Journal of the American College of Cardiology. 41 (6), 1056-1062 (2003).
- Rissanen, T. T., et al. Fibroblast growth factor 4 induces vascular permeability, angiogenesis and arteriogenesis in a rabbit hindlimb ischemia model. FASEB Journal. 17 (1), 100-102 (2003).
- Taniyama, Y., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat and rabbit hindlimb ischemia models: preclinical study for treatment of peripheral arterial disease. Gene Therapy. 8 (3), 181-189 (2001).
- Vincent, K. A., et al. Angiogenesis is induced in a rabbit model of hindlimb ischemia by naked DNA encoding an HIF-1alpha/VP16 hybrid transcription factor. Circulation. 102 (18), 2255-2261 (2000).
- Gowdak, L. H., et al. Induction of angiogenesis by cationic lipid-mediated VEGF165 gene transfer in the rabbit ischemic hindlimb model. Journal of Vascular Surgery. 32 (2), 343-352 (2000).
- Shyu, K. G., Manor, O., Magner, M., Yancopoulos, G. D., Isner, J. M. Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb. Circulation. 98 (19), 2081-2087 (1998).
- Witzenbichler, B., et al. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C/VEGF-2) promotes angiogenesis in the setting of tissue ischemia. The American Journal of Pathology. 153 (2), 381-394 (1998).
- Prochazka, V., et al. The Role of miR-126 in Critical Limb Ischemia Treatment Using Adipose-Derived Stem Cell Therapeutic Factor Concentrate and Extracellular Matrix Microparticles. Medical Science Monitor. 24, 511-522 (2018).
- Wang, J., et al. A cellular delivery system fabricated with autologous BMSCs and collagen scaffold enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (6), 1438-1447 (2012).
- Hao, C., et al. Therapeutic angiogenesis by autologous adipose-derived regenerative cells: comparison with bone marrow mononuclear cells. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 307 (6), H869-H879 (2014).
- Nemoto, M., et al. Adequate Selection of a Therapeutic Site Enables Efficient Development of Collateral Vessels in Angiogenic Treatment With Bone Marrow Mononuclear Cells. Journal of the American Heart Association. 4 (9), (2015).
- Mikami, S., et al. Autologous bone-marrow mesenchymal stem cell implantation and endothelial function in a rabbit ischemic limb model. PLoS One. 8 (7), (2013).
- Wang, S., et al. Transplantation of vascular endothelial growth factor 165transfected endothelial progenitor cells for the treatment of limb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 4967-4974 (2015).
- Yin, T., et al. Genetically modified human placentaderived mesenchymal stem cells with FGF2 and PDGFBB enhance neovascularization in a model of hindlimb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5093-5099 (2015).
- Annex, B. H. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischaemia. Nature Reviews Cardiology. 10 (7), 387-396 (2013).
- Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
- Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
- Monteforte, A. J., et al. Glypican-1 nanoliposomes for potentiating growth factor activity in therapeutic angiogenesis. Biomaterials. 94, 45-56 (2016).
- Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
- Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomaterialia. 42, 56-65 (2016).
- Das, S., Singh, G., Baker, A. B. Overcoming disease-induced growth factor resistance in therapeutic angiogenesis using recombinant co-receptors delivered by a liposomal system. Biomaterials. 35 (1), 196-205 (2014).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2014).
- Shafat, I., Ilan, N., Zoabi, S., Vlodavsky, I., Nakhoul, F. Heparanase levels are elevated in the urine and plasma of type 2 diabetes patients and associate with blood glucose levels. PLoS One. 6 (2), (2011).
- Wang, Y., et al. Endothelial cell heparanase taken up by cardiomyocytes regulates lipoprotein lipase transfer to the coronary lumen after diabetes. Diabetes. 63 (8), 2643-2655 (2014).
- Fan, C. L., et al. Therapeutic angiogenesis by intramuscular injection of fibrin particles into ischaemic hindlimbs. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 33 (7), 617-622 (2006).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Interventional Radiology. 16 (7), 991-998 (2005).
- Gowdak, L. H., et al. Adenovirus-mediated VEGF(121) gene transfer stimulates angiogenesis in normoperfused skeletal muscle and preserves tissue perfusion after induction of ischemia. Circulation. 102 (121), 565-571 (2000).
- Zhang, H., Wang, X., Guan, M., Li, C., Luo, L. Skeletal muscle evaluation by MRI in a rabbit model of acute ischaemia. The British Journal of Radiology. 86 (1026), 20120042 (2013).
- Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
- Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
- Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomateriala. 42, 56-65 (2016).
- Baker, A. B., et al. Regulation of heparanase expression in coronary artery disease in diabetic, hyperlipidemic swine. Atherosclerosis. 213 (2), 436-442 (2010).
- Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind Limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
- Popesko, P., Rajtová, V., Ji Horák, A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals. , Wolfe Publishing. London. (1992).
