Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Modelo pré-clínico de isquemia de membros posteriores em coelhos diabéticos

Published: June 2, 2019 doi: 10.3791/58964
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2,4, 1,5,6,7
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Division of Cardiology, University of Texas McGovern Medical School, 3Center for Laboratory Animal Medicine and Care, UT Health Science Center at Houston, 4Memorial Herman Heart and Vascular Center, Texas Medical Center, 5Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 6The Institute for Computational Engineering and Sciences, University of Texas at Austin, 7Institute for Biomaterials, Drug Delivery and Regenerative Medicine, University of Texas at Austin

Summary

Nós descrevemos um procedimento cirúrgico usado para induzir a isquemia periférica nos coelhos com hiperlipidemia e diabetes. Esta cirurgia actua como um modelo pré-clínico para as circunstâncias experimentadas na doença de artéria periférica nos pacientes. A angiografia também é descrita como um meio de medir a extensão da isquemia introduzida e a recuperação da perfusão.

Abstract

A doença vascular periférica é um problema clínico generalizado que afeta milhões de pacientes em todo o mundo. Uma consequência importante da doença vascular periférica é o desenvolvimento de isquemia. Em casos graves, os pacientes podem desenvolver isquemia crítica do membro em que experimentam a dor constante e um risco aumentado de amputação do membro. As terapias atuais para isquemia periférica incluem cirurgia de bypass ou intervenções percutâneas, como angioplastia com stent ou aterectomia para restaurar o fluxo sanguíneo. Entretanto, estes tratamentos falham frequentemente à progressão continuada da doença vascular ou do reestenose ou são contra-indicado devido à saúde pobre total do paciente. Uma abordagem potencial promissora para tratar a isquemia periférica envolve a indução de neovascularização terapêutica para permitir que o paciente desenvolva vasculatura colateral. Esta rede recém-formada alivia a isquemia periférica, restaurando a perfusão para a área afetada. O modelo pré-clínico mais freqüentemente empregado para isquemia periférica utiliza a criação de isquemia de membros posteriores em coelhos sadios através da ligadura da artéria femoral. No passado, no entanto, houve uma forte desconexão entre o sucesso dos estudos pré-clínicos e o fracasso dos ensaios clínicos em relação aos tratamentos para isquemia periférica. Os animais sadios têm tipicamente regeneração vascular robusta em resposta à isquemia cirurgicamente induzida, em contraste com a redução da vascularização e regeneração em pacientes com isquemia periférica crônica. Aqui, nós descrevemos um modelo animal aperfeiçoado para a isquemia periférica nos coelhos que inclui o hiperlipidemia e o diabetes. Este modelo reduziu a formação colateral e a recuperação da pressão sanguínea em comparação com um modelo com uma dieta mais elevada do colesterol. Assim, o modelo pode proporcionar melhor correlação com pacientes humanos com angiogênese comprometida a partir das comorbidades comuns que acompanham a doença vascular periférica.

Introduction

A doença arterial periférica (PAD) é um distúrbio circulatório comum em que a progressão da formação da placa aterosclerótica leva a um estreitamento dos vasos sanguíneos nos membros do corpo. O recente aumento dos fatores de risco para a aterosclerose, incluindo diabetes, obesidade e inatividade, tem levado ao aumento da prevalência de doença vascular1. Atualmente, estima-se que 12% – 20% da população geral acima de 60 anos de idade tenha doença arterial periférica2. Uma consequência importante da doença arterial periférica é o desenvolvimento de isquemia periférica, mais comumente encontrada nos membros inferiores. Em casos graves, os pacientes podem desenvolver isquemia crítica do membro, um estado em que há dor constante devido à falta de fluxo sanguíneo. Os pacientes com isquemia crítica do membro têm uma probabilidade de 50% de ter um membro amputado dentro de um ano do diagnóstico. Além disso, pacientes com diabetes apresentam maior incidência de doença arterial periférica e desfechos mais pobres após intervenções para revascularização3,4. As terapias atuais para a isquemia periférica incluem intervenções percutaneous tais como o aterectomia e stenting ou o desvio cirúrgico. Entretanto, para muitos pacientes estes tratamentos fornecem somente benefícios a curto prazo e muitos não são saudáveis bastante para procedimentos cirúrgicos principais. Neste trabalho, descrevemos um modelo animal pré-clínico para testar novos tratamentos visando a doença vascular periférica que incorpora a geração de isquemia periférica em coelhos através da ligadura cirúrgica no contexto do estado da doença diabética.

O modelo de isquemia do membro Hind em coelhos tem sido utilizado como modelo fisiológico para doença vascular obstrutiva e precursor pré-clínico para estudos humanos há mais de meio século5,6. Os coelhos são muitas vezes uma espécie preferida para estudos sobre isquemia periférica devido à musculatura desenvolvida do tornozelo e do músculo da panturrilha, em contraste com grandes modelos animais comuns que são ungulados (animais com cascos). Várias revisões recentes abordaram o uso desse modelo e outros na modelagem da doença vascular periférica em humanos7,8. Modelos semelhantes, utilizando isquemia de membro posterior em coelhos, foram utilizados em estudos pré-clínicos de fatores de crescimento9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20, terapia genética21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44, e células-tronco45,46,47,48,49,50 ,51para neovascularização terapêutica nos membros. Infelizmente, os ensaios clínicos que seguiram estes estudos animais bem sucedidos não mostraram benefícios significativos para os pacientes52.

Uma explanação sugerida da razão para esta falha translacional é que a condição da isquemia periférica em pacientes humanos é uma que inclui a resistência aos sinais angiogênico53,54,55, 56 , 57 , 58 , 59. vários estudos demonstraram defeitos nas vias de sinalização angiogênica em diabetes e hiperglicemia. Diabetes e hiperlipidemia levam a uma perda de proteoglicanos de sulfato de heparan e um aumento de enzimas que cortam o sulfato de heparan, apresentando um potencial mecanismo de resistência à angiogênese terapêutica/arteriogênese com fatores de crescimento60 , 61. assim, uma característica fundamental de um modelo de isquemia periférica deve incluir um aspecto da resistência terapêutica para que as terapias possam ser avaliadas no contexto do estado da doença presente em pacientes humanos.

Neste trabalho, nós descrevemos um modelo do coelho da isquemia periférica com a ligadura cirúrgica das artérias femoral. Um lead-in período com a indução de diabetes e hiperlipidemia é incorporado no modelo. Comparou-se este modelo a outro modelo que incorpora uma dieta mais gorda sem diabetes e constatou que o modelo com diabetes e menor nível de hiperlipidemia foi mais eficaz na redução do crescimento dos vasos sanguíneos. Nosso modelo combina avanços que têm sido utilizados por grupos distintos, com o objetivo de fornecer um método prático e padronizado para alcançar resultados consistentes na pesquisa de doenças vasculares periféricas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Estudos envolvendo animais foram realizados com a aprovação da Universidade do Texas em Austin e o centro de ciência UTHealth no Comitê de cuidados e uso de animais institucionais de Houston (IACUC), o serviço de revisão de cuidados e uso de animais (ACURO) do exército dos Estados Unidos Pesquisa médica e materiel Command Office de proteções de pesquisa, e de acordo com as diretrizes da NIH para o cuidado dos animais.

1. indução de diabetes e hiperlipidemia

  1. Transição dos coelhos da Nova Zelândia (4 – 6 meses de idade) de uma xícara de ração de alfafa padrão para 0,1% de colesterol no decorrer de quatro dias. Para os dias 1 – 5, use a ração padrão para rácios de ração de colesterol de 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 e 0:1, respectivamente. Depois de duas semanas em 0,1% de colesterol Chow, induzir coelhos para ter diabetes usando a injeção de aloxana como descrito nas seguintes etapas
  2. Sedate os coelhos com 35 – 75 mg/mL de cetamina e 1 – 2 mg/mL de acepromazina através de injeção subcutânea e preparação para uma injeção INTRAVENOSA através da introdução de um cateter na veia marginal da orelha esquerda utilizando um cateter de 22 g.
  3. Colete uma gota de sangue dos coelhos através do cubo do cateter da veia da orelha para a medida basal do nível da glicose de sangue (BGL). Qualquer glicosímetro padrão pode ser usado. Níveis normais de glicose para um coelho são tipicamente na faixa de 80 a 150 mg/dL.
  4. Injete aloxana em 100 mg/kg reconstituído em soro fisiológico a um volume de 8 ml através do cateter auricular lentamente durante um período de 8 minutos utilizando uma bomba de seringa.
  5. Verific o BGL cada hora para os 12 h seguintes usando um glicosímetro padrão para monitorar para o hypoglycemia.
    1. Coloque o coelho em uma contenção.
    2. Anestesie a orelha com 2,5% de lidocaína/2,5% de creme de prilocaína.
    3. Tome o sangue da veia lateral da orelha usando uma agulha de 27 G e meça BGL usando um medidor padrão.
  6. Meça o BGL duas vezes por dia durante os primeiros 7 dias. Dê aos coelhos uma injecção de insulina se o BGL atingir ou exceder 350 mg/dL.
  7. Prepare uma esfera de aço inoxidável de 3 milímetros para a implantação como um marcador do tamanho durante angiograma antes do dia da cirurgia.
    1. Corte uma parte circular de 10 mm de folhas de Silastic de uma folha maior usando um perfurador da biópsia.
    2. Monte a bola no centro da folha usando selante de silicone transparente.
    3. Cubra completamente a esfera com o vedador. Permita que o selante Cure por um mínimo de 24 h.
    4. Coloque a bola em um aberto 2 polegadas x 3 polegadas de polietileno de baixa densidade saco e colocá-lo em um saco de esterilização para ser esterilizado com gás de óxido de etileno.

2. preparação do coelho para a cirurgia

  1. Anestesie o coelho utilizando 20 – 40 mg/kg de cetamina e 2 mg/kg de midazolam através de injeção subcutânea. Coloque o coelho em 1,5% – 3% isoflurano (tipicamente 2%) durante toda a sedação inicial usando uma máscara. Dê uma injecção de Alfaxalona para manter a anestesia através de uma injecção intramuscular de 3 mg/kg.
  2. Uma vez anestesiado, retire a máscara e insira um tubo endotraqueal algemado, na via aérea e conecte-se a um ventilador. Continuar a administrar isoflurano em 1,5% – 3%.
  3. Colete sangue da artéria central de qualquer orelha para um painel de química basal.
  4. Coloque um cateter de veia orelha de 22 G na veia lateral da orelha para gotejamento da solução de Ringer Lactated durante todo o procedimento cirúrgico. Alternativamente, soro fisiológico normal (0,9% cloreto de sódio) pode ser usado.
  5. Usando a veia lateral na orelha oposta, coloque um cateter na veia e entregar Alfaxalona em 6 mg/kg/h. Aumente gradualmente o Alfaxalona a 8 MGS/quilograma/h ao diminuir o isoflurano a 0,6% durante o período da preparação.
  6. Para limitar a dor e o risco de infeção, administrar buprenorfina (0, 1 mg/kg) e enrofloxacina (5 mg/kg) utilizando uma injecção subcutânea com uma agulha de 25 G.
  7. Aparar o cabelo no pescoço, direita e esquerda das coxas internas, e de volta usando cortadores (#40 lâmina). O cabelo é retirado da parte de trás para manter contato com a almofada de aterramento.
  8. Coloque uma braçadeira de pressão arterial em cada um dos membros posteriores e medir a pressão arterial inicial. Coloque a braçadeira logo abaixo do joelho com a sonda logo acima do jarrete na superfície lateral.
  9. Posicione o coelho na mesa de cirurgia nas costas e esfregue e Drape os locais de cirurgia. Isto inclui a garganta para o acesso da artéria carotídea e a coxa direita interna para o acesso da artéria femoral. Realize a esfoliação de esterilização com esfrega alternada de clorexidina a 2% e álcool etílico a 70%. Repita este três vezes, em seguida, aplique um spray final com solução de clorexidina a 2%.
  10. Coloc uma esfera de aço inoxidável de 3 milímetros que seja sterilized dentro de um saco do polyethyene da baixa densidade sobre o pé direito (esfrebbed) perto da parte superior da coxa para serir como uma referência do tamanho durante medidas do angiograma. Coloque um drapejar estéril sobre a perna até o momento da cirurgia. Deixe a bola dentro do saco de plástico estéril durante o primeiro angiograma.

3. angiografia

  1. Expor a artéria carótida comum direita
    1. Faça uma incisão de 4 – 5 cm de comprimento apenas lateral para a traquéia usando um bisturi com uma lâmina #15.
    2. Use dissecção sem corte para expor a artéria carótida e abrir a incisão usando pequenos retractores de Weitlaner. Isole cuidadosamente a artéria carótida da veia jugular e do nervo vago. Tipicamente, uma tesoura curvada de Metzenbaum e um hemostat curvado do mosquito são usados para a dissecção sem corte. Seja certo começ a separação cheia da artéria carotídea da veia do nervo e de jugular para fazer as ligaduras somente ligadura a artéria.
  2. Coloque uma ligadura usando uma sutura de seda 4-0 nas extremidades proximal e distal da artéria exposta. Amarre a extremidade distal da carótida com o nó de um cirurgião seguido por quatro nós quadrados. Na extremidade proximal, use um ligaloop para permitir que seja apertado ou afrouxado conforme necessário. O uso de um ligaloop colocado na extremidade proximal da artéria exposta pode ajudar a fixar o introdutor e o cateter.
  3. Administrar 500 UI de heparina através da IV. Use aproximadamente 0,5 mL de lidocaína a 1% aplicada ao longo da carótida exposta para dilatar o vaso. Um tratamento é geralmente suficiente, mas pode ser repetido conforme necessário. Corte aproximadamente a meio caminho através da artéria carótida usando uma tesoura de bisturi ou íris, em seguida, coloque a ferramenta de inserção de fio de 4 polegadas na artéria.
  4. Alimente um fio-guia de 0, 14 polegada x 185 cm através da ferramenta de inserção à bifurcação aórtica na crista ilíaca na aorta descendente. Retire a ferramenta de inserção e insira um cateter angiográfico pigtail 3F sobre o fio.
  5. Avance o cateter do pigtail para ser 2 cm proximal à bifurcação aórtica na crista ilíaca na aorta descendente.
  6. Posicione a ponta do cateter entre a sétima vértebras lombar e primeira sacral. Teste a localização do cateter injetando manualmente um 2 – 4 mL de agente de contraste.
  7. Administrar uma injeção intra-arterial de 100 μg de nitroglicerina através do cateter para aumentar a vasodilatação.
  8. Administrar 0,8 mL de lidocaína a 1% ao coelho através do cateter para auxiliar na vasodilatação durante o angiograma. Prenda o tubo para o injector ao cateter e remova todas as bolhas de ar na linha. Injete 8-9 mL de meios de contraste utilizando injetores angiográficos automatizados através do cateter.
  9. Grave imagens seriais dos membros posteriores usando angiografia.
    1. Defina o injector de energia para injetar contraste a 3 mL/seg para um total de 8-9 mL. Realize a angiografia digital da subtração em 6 frames por o segundo.
    2. Selecione as imagens seriais criadas e altere uma foto de cada angiograma usando a configuração de aproximadamente-40% para minimizar a aparência do osso e capturar uma imagem completa da perfusão do vaso com contraste. Um exemplo de angiograma do fluxo vascular após a ligadura/excisão da artéria femoral é mostrado na Figura 1.

4. isolamento da artéria femoral

  1. Faça uma incisão longitudinal na pele sobre a artéria femoral direita usando um bisturi (lâmina #15). Assegure-se de que a incisão se estende inferiormente do ligamento inguinal terminando na área apenas proximal à patela (aproximadamente 6 cm).
  2. Use a dissecção sem corte com tesoura curvada de Metzenbaum ou um hemostat curvado do mosquito para expor a artéria femoral.
  3. Use retractores Weitlaner para segurar a incisão aberta.
  4. Adicione 0,5 mL de lidocaína a 1% localmente para reduzir a irritação nervosa e promover a vasodilatação.
  5. Continuar a dissecção sem corte dos tecidos para libertar todo o comprimento da artéria femoral, juntamente com todos os ramos da artéria femoral, incluindo as artérias epigástrica inferior, femoral profunda, circunflexa lateral e epigástrica superficial (Figura 2a) .
  6. Dissecar ainda mais ao longo das artérias poplítea e safena, bem como da artéria ilíaca externa (Figura 2a). Umedecer periodicamente a área com soro fisiológico para proteger dos danos nos tecidos. Se a dissecção contundente é realizada ao longo do sulco femoral (entre os músculos) não há necessidade de cortar o músculo.
  7. Separe cuidadosamente a artéria da veia e do nervo, como mostrado na Figura 2b, C. Ligate as artérias indicadas pelo diagrama com 4,0 suturas de seda, colocando dois laços com espaço suficiente entre eles para cortar a artéria. Estes laços são realizados com o nó de um cirurgião seguido por quatro nós quadrados.
  8. Corte entre os dois laços nas artérias ligadas usando a tesoura pequena de Metzenbaum. Extirpar a artéria femoral de sua origem proximal como um ramo da artéria ilíaca externa até o ponto distalmente onde se bifurca para formar as artérias safena e poplítea.

5. Repita a angiografia

  1. Use 4-0 sutura de seda para fixar a folha de Silastic, com a esfera de aço inoxidável de 3 milímetros à parte superior do músculo do quadríceps. Puxe a pele sobre a bola depois que ele está no lugar.
  2. Administrar uma injeção intra-arterial de 100 μg de nitroglicerina através do cateter para aumentar a vasodilatação.
  3. Se necessário, administrar outro 0,8 mL de lidocaína a 1% ao coelho através do cateter para auxiliar na vasodilatação durante o angiograma.
  4. Injete 8-9 mL de meios de contraste utilizando um injector angiográfico automatizado.
  5. Realize a angiografia conforme descrito na etapa 3,9.

6. fechamento e recuperação da ferida

  1. Retire o cateter da artéria direita. Amarre a artéria usando a sutura de seda 4-0 que já está no lugar ao redor da artéria.
  2. Sutura ambas as feridas fechadas. Feche o músculo e as camadas subcutticular usando 4-0 polidioxanona ou 3-0 Poliglactina 910 em uma agulha do atarraxamento (veja a tabela dos materiais) em um teste padrão contínuo da sutura. Feche a pele usando 4-0 polidioxanona ou 4-0 Poliglactina 910 em uma agulha de corte reversa (ver tabela de materiais) em um padrão de sutura subcubticular contínua enterrado.
    Nota: se disponível, a polidioxanona é preferida para ambos.
  3. Administrar injeções intradérmicas de bupivacaína a 0,25% perto das incisões usando uma seringa com agulha de 25 G. Insira a agulha e injete 0,5 mL enquanto a agulha for puxada para trás. Dê uma injeção por lado da ferida para a incisão no pescoço (duas injeções no pescoço) e duas injeções por lado da ferida para a incisão na perna (quatro injeções na perna; seis injeções no total). O volume total injetado é de 3 mL (0,5 mL x 6 injeções).
  4. Administrar injeções subcutâneas de 0,5 mg/kg de Meloxicam e buprenorfina de libertação sustentada a 0,12 mg/kg.
  5. Monitore o coelho como ele se recupera da anestesia. O coelho começará automaticamente a engolir à medida que acorda da anestesia. Uma vez que a resposta da deglutição ocorra, retire o tubo endotraqueal. Forneça a monitoração próxima e o apoio térmico até que o coelho possa manter a função cardiovascular e a temperatura de corpo. Retorne o coelho a seu cerco uma vez que pode deambulate.
  6. Empregar legumes frescos e/ou seringa de alimentação de uma dieta de cuidados críticos, juntamente com injeções Salinas subcutâneas, se o coelho não tolera Chow após a cirurgia. Repolho, brócolis, couve-flor, cenouras, ou outros em legumes sazonais podem ser usados. Shred os legumes e misturá-los juntos para ajudar no coelho voltando a comer.

7. monitorização de

  1. Anestesie os coelhos a cada duas semanas para adquirir a pressão arterial em ambas as pernas, conforme descrito na etapa 2,8. Colheita de sangue da artéria central da orelha para uso em ensaios de química do sangue. Alternativamente, tomar sangue da veia safena ou veia cefólica. Tome aproximadamente 2 mL em cada ponto de tempo. Use um painel de química do sangue padrão para análise. Se necessário, adicione testes para lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteína de alta densidade (HDL) ou hemoglobina (HbA1c).
  2. Tome uma quantidade muito pequena de sangue para medições de BGL.

8. tratamento de

  1. Prepare dez seringas com tratamento, portador e crosslinker. Encha cada seringa antes da utilização com 100 μL de pasta de sulfato de cálcio e, em seguida, 100 μL de alginato de sódio a 2% com factores de crescimento ou outros tratamentos, de forma a que o alginato seja mais próximo da ponta da seringa.
  2. Administrar uma injeção preparada no músculo antes de preparar o próximo. Isso reduz o tempo que o alginato interage com o sulfato de cálcio na seringa. Espaço as injeções uniformemente ao longo de ambos os lados da artéria femoral na coxa. Para conseguir injeções uniformes, criar uma folha de silicone com furos para orientar a injeção, como descrito em outros estudos19. Isto pode facilmente ser preparado usando um perfurador da biópsia para criar furos na folha de silicone comercialmente disponível.

9. angiografia do ponto final, eutanásia, fixação da perfusão e colheita do tecido

  1. Na data do ponto final, realize a angiografia como descrito em etapa 3 mas use a artéria carotídea esquerda para o acesso.
  2. Após a angiografia, mova o animal para a mesa de necropsia e realize a fixação da perfusão para preservar os tecidos dos membros posteriores:
    1. Aumente o isoflurano para 3% – 4% e realize uma pitada de dedo do pé para confirmar que a anestesia é suficientemente profunda.
    2. Administrar 1000-2000 UI de heparina por via intravenosa.
    3. Crie uma incisão ao longo da linha média da nervgaiola e abrangendo o comprimento do diafragma usando um bisturi com uma lâmina #20.
    4. Com a caixa torácica exposta, corte as costelas apenas à esquerda da linha média usando cortadores de costela. Use retractores Weitlaner para expor o coração.
    5. Configurar a bomba com tubo de saída com um diâmetro interno de 1/8 polegadas e uma agulha de 18G no final. Pré-carregue a linha com soro fisiológico e tenha pelo menos 600 mL de soro fisiológico e formalina preparados em recipientes separados para a perfusão.
    6. Insira a agulha de 18 G conectada à bomba no ventrículo esquerdo através do ápice do coração. Insira outra agulha de 18 G (desconectada a qualquer coisa) no átrio direito e permita que o sangue flua para o downdraft da mesa de necropsia.
    7. Use uma bomba de perfusão para controlar o fluxo de aproximadamente 500 mL de soro fisiológico no coração. Use um ajuste da bomba para fluir 110 mL/min.
    8. Uma vez que o fluido proveniente do coração é claro, mova o tubo do reservatório de soro fisiológico para um preenchido com uma solução de formalina a 10%. Twitching ocorrerá em todos os quatro membros se a perfusão está funcionando corretamente. Bombeie aproximadamente 500 mL de solução de formalina para o ventrículo esquerdo.
    9. Desligue a bomba e retire as agulhas do coração.
  3. Remova ambos os membros traseiros no quadril cortando em torno da articulação do quadril com um bisturi com lâmina #20. Use um pequeno cortador de costela para remover os membros. Use o membro não-isquêmico como um controle.
  4. Guarde os membros em formalina durante 24 h a 4 ° c e, em seguida, armazenado em 70% etanol a 4 ° c.
  5. Para a análise histológica, tomar biópsias múltiplas dos membros. Nós usamos oito biópsias de 6 milímetros tomadas em regiões através da coxa e da vitela em ambos os membros.
    Nota: quando a medida e a angiografia da pressão sanguínea do tornozelo forem os métodos os mais geralmente usados para medir a recuperação da circulação sanguínea, outros métodos podem ser usados para controlar a recuperação dos animais que incluem o ultra-som de Doppler, imagem latente do laser Doppler, infravermelho Termografia62, microesfera determinou a perfusão63,64, imagem latente do tomography computado (CT), e imagem latente de ressonância magnética (MRI)65.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Após a indução do diabetes e a iniciação da dieta do colesterol de 0,1%, o colesterol total para os coelhos com dieta do diabetes e do colesterol era 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 coelhos masculinos) média de pontos de tempo totais e coelhos. O nível de BGL para esses coelhos foi de 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 coelhos machos). Um curso do tempo para químicas do sangue e relações da pressão sanguínea do pé em um coelho típico é mostrado em Figura 3 em comparação aos coelhos uma dieta mais elevada do colesterol (colesterol de 1%). Nos animais não diabéticos, mesmo com colesterol mais elevado, verificou-se que houve aumento na recuperação da pressão arterial no membro isquêmico e vascularização nos angiogramas no momento final (Figura 3). Os animais na dieta mais alta de colesterol/gordura também mostraram níveis aumentados de lipoproteína A, sugerindo estresse no fígado. Assim, o diabetes com menor nível de colesterol levou a uma perfusão mais comprometida no desfecho do estudo. Histologicamente, há alterações na estrutura muscular consistentes com edema e dano isquêmico em alguns locais da Figura 4. Em alguns casos, pode-se observar alterações/danos nas fibras musculares devido à isquemia. Isso pode ser observado como perda ou ruptura das fibras musculares na análise histológica, como foi observado em alguns modelos de isquemia de membros posteriores em camundongos. Entretanto, o cuidado é necessário para distinguir estas mudanças dos Artifacts histológicos do processamento do tecido. A imunocoloração para PECAM e αSMA pode ser utilizada para identificar o número de vasos e vasos maiores nas secções teciduais (Figura 4). Globalmente, o modelo usando diabetes com uma dieta de colesterol de nível inferior produziu déficits repetíveis na pressão arterial e vascularização sobre o modelo de dieta de colesterol mais elevado sem diabetes.

Figure 1
Figura 1: angiogramas para o membro traseiro de uma pré-cirurgia de coelho diabético e não diabético, pós-cirurgia e após recuperação por 70 dias após a ligadura e excisão da artéria femoral. (A) angiograma de membro isquêmico (esquerdo) e membro de controle contralateral (direita). (B) imagem ampliada do membro isquêmico no local da ligadura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: indução de isquemia de membros posteriores em coelhos através da ligadura e excisão da artéria femoral. (A) ilustração da anatomia vascular do membro traseiro do coelho. Coloque laços em todos os pontos marcados para ligadura as artérias. Modificado e usado com permissão71. (B) campo cirúrgico mostrando o corte até a artéria femoral antes da ligadura. (C) artérias femorais com ligações no local para induzir isquemia do membro posterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: pressão arterial típica e químicas sanguíneas para os coelhos com isquemia do membro posterior ao longo do modelo. O grupo do diabético/MC foi induzido para ter o diabetes e dado uma dieta do colesterol de 0,1%. O grupo do não-diabético/HC foi dado uma dieta do colesterol de 1%. BGL = nível de glicose no sangue. TC = colesterol total. LIPA = lipoproteína (a). BP = relação pressão arterial entre o membro isquêmico e não isquêmico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: análise histológica do músculo do membro traseiro em coelhos diabéticos 70 dias após a ligadura da artéria femoral. A coloração de H & E assim como a mancha immunohistochemical para o marcador endothelial, o PECAM, e o marcador vascular da pilha do músculo liso, αSMA, foram executados. As amostras de tecido foram biopsiadas do membro isquêmico e do membro do controle contralateral não isquêmico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nós apresentamos um modelo pré-clínico para induzir a isquemia do membro traseiro nos coelhos com diabetes e hyperlipidemia. Em muitos estudos, há ambigüidade à técnica utilizada para criar isquemia de membro posterior em coelhos. Em camundongos, a severidade e a recuperação da isquemia dos membros posteriores é altamente dependente da localização da ligadura e da técnica utilizada para induzir isquemia. O significado da técnica apresentada neste trabalho é que permite a indução consistente da isquemia que não se recupera inteiramente após 8 semanas em animais do diabético. Notavelmente, quando os animais receberam uma dieta mais alta de colesterol e gordura, eles foram capazes de recuperar para os níveis iniciais da relação de pressão arterial do membro. Além, na dieta gorda mais elevada os animais tiveram alterações nas enzimas do fígado que sugerem dano de fígado. Assim, o modelo diabético com menor nível de colesterol/gordura parece ser um modelo mais consistente e relevante de isquemia crônica no membro.

Quatro etapas essenciais podem ser destacadas dentro deste modelo que inclui a indução do diabetes, a angiografia, a ligadura cirúrgica das artérias femoral e a aplicação do tratamento. Dentre essas etapas, a indução do diabetes foi uma das etapas mais críticas e uma que pode requerer maior otimização para cada laboratório. A taxa de injeção de aloxana é um fator importante que altera a toxicidade e a eficácia da indução do diabetes por aloxana para coelhos. Quando injetado muito rapidamente, aloxana causou instabilidade na BGL e morte nos coelhos. Isto pode às vezes ser observado como o hipoglicemia que não é resolvido com as injeções de soluções da dextrose ou em outros casos extremamente elevados BGL. Se injetado muito lentamente os coelhos muitas vezes não conseguem se tornar diabético. É possível que este parâmetro precise ser otimizado para coelhos de diferentes fontes. Os coelhos se tornarão tipicamente hiperglicêmicos por 1-3 h, mas o BGL começará a cair. Conseqüentemente, geralmente nenhuma insulina é administrada no dia da indução do diabetes. No entanto, se o BGL cair abaixo de 100 mg/dL nos primeiros 24 h, pode ser aumentado injetando 10,0 mL de solução de dextrose a 5% por via subcutânea ou alterando o suprimento de água para uma solução de dextrose a 10% (normalmente durante a noite é suficiente). Sempre que a insulina é administrada um teste de BGL extra é feito para garantir que os níveis de glicose não cair muito baixo. A responsividade da insulina varia frequentemente para cada coelho. Assim, os regimes de dosagem individuais são usados para normalizar o BGL baseado em como o coelho responde à insulina. O diabetes é induzido tipicamente após 2-3 dias que seguem a injeção do aloxana.

Como modelo pré-clínico de doença vascular periférica e isquemia de membros, o modelo apresentado tem algumas limitações potenciais. A indução do diabetes com aloxana é conduz ao desenvolvimento rápido do tipo mim diabetes. Isto é em contraste com o desenvolvimento crônico do tipo diabetes de II que é o mais predominante em pacientes humanos. Além disso, a isquemia é desenvolvida agudamente devido à ligadura cirúrgica um pouco do que devido ao desenvolvimento crônico da doença vascular e das chapas ateroscleróticas. Uma limitação fundamental do uso de coelhos é A sua fragilidade como modelo animal. Os animais só tolerarão uma quantidade limitada de hiperlipidemia em combinação com diabetes tipo I e otimizar a quantidade máxima de doença sem ter o animal morrer foi um grande objetivo na criação deste protocolo. Nosso grupo tem a hipótese de que pacientes com isquemia periférica desenvolvem resistência terapêutica a fatores de crescimento angiogênico e que isso pode desempenhar um papel importante na falha da terapêutica baseada em fator de crescimento para isquemia66. Para este fim, nós mostramos uma perda em proteoglicanos de superfície da pilha e um aumento no heparanase em amostras animais e humanas do tecido55,58,67,68,69,70 . Desconhece-se se o modelo de coelho descrito aqui demonstra resistência ao fator de crescimento, embora a observação de que há isquemia de longo prazo com diabetes e modelo de hiperlipidemia moderada em comparação com o modelo de hiperlipidemia alta sugeriria Há algum déficit no processo de revascularização.

Para a inclusão de tratamentos no modelo, é importante ter um período de recuperação após a indução de isquemia para permitir que a fase de cicatrização aguda ocorra sem intervenção. Se as terapias são dadas durante esse tempo, a resposta seria mais relevante para melhorar a resposta à isquemia aguda em vez da isquemia crônica que caracteriza a doença vascular periférica. Tal modelo pode ser relevante para lesão isquêmica aguda em trauma ou trombose, mas provavelmente não proporcionaria boa correlação com isquemia crônica. Dada a fraca correlação entre os resultados positivos em modelos pré-clínicos de isquemia em animais saudáveis e os resultados de ensaios clínicos, a inclusão de diabetes ou outro fator que reduz a regeneração vascular é essencial para a tentativa de a isquemia recapitular do membro nos seres humanos para a criação de terapias futuras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem com gratidão o financiamento através do departamento de defesa do programa de pesquisa dirigida pelo Congresso (DOD CDMRP; W81XWH-16-1-0582) para ABB e RS. Os autores igualmente reconhecem o financiamento através da associação americana do coração (17IRG33410888), do DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) e dos institutos nacionais da saúde (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) a ABB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Henry Schein Medical 1537468 / 1531434 250 mL bag / 1000 mL irrigation btl
1 mL Syringe VWR BD309628
10 mL Syringe VWR BD309695
10% Formalin Fisher-Scientific 23-245684
18G Needle VWR 89219-294
20G Needle VWR 89219-340
25G Needle VWR 89219-290
27G Needle VWR 89219-288
5 mL Syringe VWR BD309646
5% Dextrose Patterson Veterinary 07-800-9689
Acepromazine Patterson Veterinary VEDC207
Alfaxalone Patterson Veterinary 07-891-6051
Alginate Sigma-Aldrich PHR1471-1G
Alloxan Monohydrate Sigma-Aldrich A7413
Angiography Equipment Toshiba Infinix-i
Angiography Injector Medrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594 Thermo Fisher Scientific A-11032 Secondary Antibody for IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary Antibody for IHC
a-SMA Antibody Abcam ab5694 Primary Antibody for IHC
Baytril Bayer Animal Health 724089904201 Enrofloxacin
Blood Chemistry Panel IDEXX 2616 Rabbit Panel
Blood Pressure Cuff WelchAllyn Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7
Blood Pressure Monitor Vmed Technology Vmed Vet-Dop2
Bupivacaine Henry Schein Medical 6023287
Buprenorphine Patterson Veterinary 42023017905
Buprenorphine SR ZooPharm
Calcium Sulfate CB Minerals Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC
Chlorhexidine Scrub Patterson Veterinary 07-888-4598
Chloroform Fisher-Scientific C298-4
Cholesterol Sigma-Aldrich C8503
DAPI Thermo Fisher Scientific 62248
Ear Vein Catheter Patterson Veterinary SR-OX165 Surflo IV catheters
Endotracheal tube Patterson Veterinary Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size
Glucometer Amazon B001A67WH2 Accu-Chek Aviva
Glucometer Test Strips McKesson Medical-Surgical 788222 Accu-Chek Aviva Plus
Guidewire Boston Scientific 39122-01
Hair Clippers Amazon B000CQZI3Q Oster #40 blade
Heating Pad Cincinnati Subzero 273
Heating Pad Pump Gaymar Gaymar T/Pump
Hemostat Fine Science Tools 13009-12 Curved Mosquito Hemostat
Heparin Patterson Veterinary
Insertion Tool Merit Medical Systems MAP550 metal wire insertion tool
Insulin HPB Pharmacy Novalin R & Novalin N
Insulin Syringes McKesson Medical-Surgical 942674
Introducer Cook Medical G28954 3F Check Flo Performer Introducer
Isoflurane Henry Schein Medical 1100734
Ketamine Patterson Veterinary 856440301
Lactated Ringers McKesson Medical-Surgical 186662
Lidocaine McKesson Medical-Surgical 239936
Lidocaine/Prilocaine cream McKesson Medical-Surgical 761240
Ligaloop V. Mueller CH117 / CH116 White Mini / Yellow Mini
Mazola Corn Oil Amazon B0049IIVCI
Medrad Syringe McKesson Medical-Surgical 346920 150 mL
Meloxicam Patterson Veterinary
Metal ball sutures Ethicon-Johnson & Johnson K891H 4-0 silk C-1 30"
Metzenbaum Scissors Fine Science Tools 14019-13
Midazolam Henry Schein Medical 1215470
Nitroglycerin McKesson Medical-Surgical 927528
PECAM Antibody Novus Biologicals NB600-562 Primary Antibody for IHC
Perfusion Pump Masterflex
Pigtail Catheter Merit Medical Systems 1310-21-0053 3F pigtail
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129271 4-0 taper RB-1 (needle comes on suture)
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129031 4-0 reverse cutting FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) suture Butler 7233-41 3-0 taper RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) suture McKesson 104373 4-0 reverse cutting FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa) LabDiet 5321
Rabbit Restrainer VWR 10718-000
Rib Cutters V. Mueller
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade Fine Science Tools 10015-00 #15 blade
Silk Sutures Ethicon-Johnson & Johnson A183H 4-0 silk ties 18"
Stainless Steel Ball McMaster-Carr 1598K23 3-mm diameter
Surgical Drapes Gepco 8204S
Syringe Pump DRE Veterinary Versaflow VF-300
Visipaque contrast media McKesson Medical-Surgical 509055
Weitlaner Retractor Fine Science Tools 17012-13

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  3. Shammas, A. N., et al. Limb Outcomes Following Lower Extremity Endovascular Revascularization in Patients With and Without Diabetes Mellitus. Journal of Endovascular Therapy. 24 (3), 376-382 (2017).
  4. Tunstall-Pedoe, H., Peters, S. A. E., Woodward, M., Struthers, A. D., Belch, J. J. F. Twenty-Year Predictors of Peripheral Arterial Disease Compared With Coronary Heart Disease in the Scottish Heart Health Extended Cohort (SHHEC). Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
  5. Whiteley, H. J., Stoner, H. B., Threlfall, C. J. The effect of hind limb ischaemia on the physiological activity of rabbit skin). British Journal of Experimental Pathology. 34 (4), 365-375 (1953).
  6. Longland, C. J. Collateral circulation in the limb. Postgraduate Medical Journal. 29 (335), 456-458 (1953).
  7. Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 773-780 (2004).
  8. Krishna, S. M., Omer, S. M., Golledge, J. Evaluation of the clinical relevance and limitations of current pre-clinical models of peripheral artery disease. Clinical Science (London. 130 (3), 127-150 (2016).
  9. Zhou, J., et al. Therapeutic angiogenesis using basic fibroblast growth factor in combination with a collagen matrix in chronic hindlimb ischemia). ScientificWorldJournal. , 652794 (2012).
  10. Prochazka, V., et al. Therapeutic Potential of Adipose-Derived Therapeutic Factor Concentrate for Treating Critical Limb Ischemia. Cell Transplantation. 25 (9), 1623-1633 (2016).
  11. Cao, R., et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2. Nature Medicine. 9 (5), 604-613 (2003).
  12. Doi, K., et al. Enhanced angiogenesis by gelatin hydrogels incorporating basic fibroblast growth factor in rabbit model of hind limb ischemia. Heart and Vessels. 22 (2), 104-108 (2007).
  13. Nitta, N., et al. Vascular regeneration by pinpoint delivery of growth factors using a microcatheter reservoir system in a rabbit hind-limb ischemia model. Experimental and Therapeutic. 4 (2), 201-204 (2012).
  14. Karatzas, A., et al. NGF promotes hemodynamic recovery in a rabbit hindlimb ischemic model through trkA- and VEGFR2-dependent pathways. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 62 (3), 270-277 (2013).
  15. Stachel, G., et al. SDF-1 fused to a fractalkine stalk and a GPI anchor enables functional neovascularization. Stem Cells. 31 (9), 1795-1805 (2013).
  16. Asahara, T., et al. Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. Circulation. 92, 365 (1995).
  17. Morishita, R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human recombinant hepatocyte growth factor in rabbit hind limb ischemia model as cytokine supplement therapy. Hypertension. 33 (6), 1379-1384 (1999).
  18. Walder, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor augments muscle blood flow and function in a rabbit model of chronic hindlimb ischemia. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 27 (1), 91-98 (1996).
  19. Anderson, E. M., et al. VEGF and IGF Delivered from Alginate Hydrogels Promote Stable Perfusion Recovery in Ischemic Hind Limbs of Aged Mice and Young Rabbits. Journal of Vascular Research. 54 (5), 288-298 (2017).
  20. Xie, J., et al. Induction of angiogenesis by controlled delivery of vascular endothelial growth factor using nanoparticles. Cardiovascular Therapeutics. 31 (3), e12-e18 (2013).
  21. Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
  22. Ohara, N., et al. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in a rabbit model of hind limb ischemia. Gene Therapy. 8 (11), 837-845 (2001).
  23. Pyun, W. B., et al. Naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor induces collateral artery augmentation in a rabbit model of limb ischemia. Gene Therapy. 17 (12), 1442-1452 (2010).
  24. Kupatt, C., et al. Cotransfection of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-B via recombinant adeno-associated virus resolves chronic ischemic malperfusion role of vessel maturation. Journal of the American College of Cardiology. 56 (5), 414-422 (2010).
  25. Olea, F. D., et al. but not single, VEGF gene transfer affords protection against ischemic muscle lesions in rabbits with hindlimb ischemia. Gene Therapy. 16 (6), 716-723 (2009).
  26. Pinkenburg, O., et al. Recombinant adeno-associated virus-based gene transfer of cathelicidin induces therapeutic neovascularization preferentially via potent collateral growth. Human Gene Therapy. 20 (2), 159-167 (2009).
  27. Katsu, M., et al. Ex vivo gene delivery of ephrin-B2 induces development of functional collateral vessels in a rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 49 (1), 192-198 (2009).
  28. Korpisalo, P., et al. Therapeutic angiogenesis with placental growth factor improves exercise tolerance of ischaemic rabbit hindlimbs. Cardiovascular Research. 80 (2), 263-270 (2008).
  29. Chen, F., Tan, Z., Dong, C. Y., Chen, X., Guo, S. F. Adeno-associated virus vectors simultaneously encoding VEGF and angiopoietin-1 enhances neovascularization in ischemic rabbit hind-limbs. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (4), 493-502 (2007).
  30. Kobayashi, K., et al. Combination of in vivo angiopoietin-1 gene transfer and autologous bone marrow cell implantation for functional therapeutic angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (7), 1465-1472 (2006).
  31. Lee, J. U., et al. A novel adenoviral gutless vector encoding sphingosine kinase promotes arteriogenesis and improves perfusion in a rabbit hindlimb ischemia model. Coronary Artery Disease. 16 (7), 451-456 (2005).
  32. Nishikage, S., et al. In vivo electroporation enhances plasmid-based gene transfer of basic fibroblast growth factor for the treatment of ischemic limb. Journal of Surgical Research. 120 (1), 37-46 (2004).
  33. Ishii, S., et al. Appropriate control of ex vivo gene therapy delivering basic fibroblast growth factor promotes successful and safe development of collateral vessels in rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 39 (3), 629-638 (2004).
  34. Tokunaga, N., et al. Adrenomedullin gene transfer induces therapeutic angiogenesis in a rabbit model of chronic hind limb ischemia: benefits of a novel nonviral vector, gelatin. Circulation. 109 (4), 526-531 (2004).
  35. Yamauchi, A., et al. Pre-administration of angiopoietin-1 followed by VEGF induces functional and mature vascular formation in a rabbit ischemic model. Journal of Gene Medicine. 5 (11), 994-1004 (2003).
  36. Zhong, J., et al. Neovascularization of ischemic tissues by gene delivery of the extracellular matrix protein Del-1. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 30-41 (2003).
  37. Shyu, K. G., Chang, H., Isner, J. M. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hindlimb ischemia. Life Sciences. 73 (5), 563-579 (2003).
  38. Kasahara, H., et al. Biodegradable gelatin hydrogel potentiates the angiogenic effect of fibroblast growth factor 4 plasmid in rabbit hindlimb ischemia. The Journal of the American College of Cardiology. 41 (6), 1056-1062 (2003).
  39. Rissanen, T. T., et al. Fibroblast growth factor 4 induces vascular permeability, angiogenesis and arteriogenesis in a rabbit hindlimb ischemia model. FASEB Journal. 17 (1), 100-102 (2003).
  40. Taniyama, Y., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat and rabbit hindlimb ischemia models: preclinical study for treatment of peripheral arterial disease. Gene Therapy. 8 (3), 181-189 (2001).
  41. Vincent, K. A., et al. Angiogenesis is induced in a rabbit model of hindlimb ischemia by naked DNA encoding an HIF-1alpha/VP16 hybrid transcription factor. Circulation. 102 (18), 2255-2261 (2000).
  42. Gowdak, L. H., et al. Induction of angiogenesis by cationic lipid-mediated VEGF165 gene transfer in the rabbit ischemic hindlimb model. Journal of Vascular Surgery. 32 (2), 343-352 (2000).
  43. Shyu, K. G., Manor, O., Magner, M., Yancopoulos, G. D., Isner, J. M. Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb. Circulation. 98 (19), 2081-2087 (1998).
  44. Witzenbichler, B., et al. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C/VEGF-2) promotes angiogenesis in the setting of tissue ischemia. The American Journal of Pathology. 153 (2), 381-394 (1998).
  45. Prochazka, V., et al. The Role of miR-126 in Critical Limb Ischemia Treatment Using Adipose-Derived Stem Cell Therapeutic Factor Concentrate and Extracellular Matrix Microparticles. Medical Science Monitor. 24, 511-522 (2018).
  46. Wang, J., et al. A cellular delivery system fabricated with autologous BMSCs and collagen scaffold enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (6), 1438-1447 (2012).
  47. Hao, C., et al. Therapeutic angiogenesis by autologous adipose-derived regenerative cells: comparison with bone marrow mononuclear cells. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 307 (6), H869-H879 (2014).
  48. Nemoto, M., et al. Adequate Selection of a Therapeutic Site Enables Efficient Development of Collateral Vessels in Angiogenic Treatment With Bone Marrow Mononuclear Cells. Journal of the American Heart Association. 4 (9), (2015).
  49. Mikami, S., et al. Autologous bone-marrow mesenchymal stem cell implantation and endothelial function in a rabbit ischemic limb model. PLoS One. 8 (7), (2013).
  50. Wang, S., et al. Transplantation of vascular endothelial growth factor 165transfected endothelial progenitor cells for the treatment of limb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 4967-4974 (2015).
  51. Yin, T., et al. Genetically modified human placentaderived mesenchymal stem cells with FGF2 and PDGFBB enhance neovascularization in a model of hindlimb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5093-5099 (2015).
  52. Annex, B. H. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischaemia. Nature Reviews Cardiology. 10 (7), 387-396 (2013).
  53. Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
  54. Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
  55. Monteforte, A. J., et al. Glypican-1 nanoliposomes for potentiating growth factor activity in therapeutic angiogenesis. Biomaterials. 94, 45-56 (2016).
  56. Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
  57. Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomaterialia. 42, 56-65 (2016).
  58. Das, S., Singh, G., Baker, A. B. Overcoming disease-induced growth factor resistance in therapeutic angiogenesis using recombinant co-receptors delivered by a liposomal system. Biomaterials. 35 (1), 196-205 (2014).
  59. Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2014).
  60. Shafat, I., Ilan, N., Zoabi, S., Vlodavsky, I., Nakhoul, F. Heparanase levels are elevated in the urine and plasma of type 2 diabetes patients and associate with blood glucose levels. PLoS One. 6 (2), (2011).
  61. Wang, Y., et al. Endothelial cell heparanase taken up by cardiomyocytes regulates lipoprotein lipase transfer to the coronary lumen after diabetes. Diabetes. 63 (8), 2643-2655 (2014).
  62. Fan, C. L., et al. Therapeutic angiogenesis by intramuscular injection of fibrin particles into ischaemic hindlimbs. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 33 (7), 617-622 (2006).
  63. Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Interventional Radiology. 16 (7), 991-998 (2005).
  64. Gowdak, L. H., et al. Adenovirus-mediated VEGF(121) gene transfer stimulates angiogenesis in normoperfused skeletal muscle and preserves tissue perfusion after induction of ischemia. Circulation. 102 (121), 565-571 (2000).
  65. Zhang, H., Wang, X., Guan, M., Li, C., Luo, L. Skeletal muscle evaluation by MRI in a rabbit model of acute ischaemia. The British Journal of Radiology. 86 (1026), 20120042 (2013).
  66. Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
  67. Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
  68. Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomateriala. 42, 56-65 (2016).
  69. Baker, A. B., et al. Regulation of heparanase expression in coronary artery disease in diabetic, hyperlipidemic swine. Atherosclerosis. 213 (2), 436-442 (2010).
  70. Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind Limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
  71. Popesko, P., Rajtová, V., Ji Horák, A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals. , Wolfe Publishing. London. (1992).

Tags

Medicina isquemia de membros posteriores doença arterial periférica doença vascular periférica coelhos diabetes hiperlipidemia angiografia
Modelo pré-clínico de isquemia de membros posteriores em coelhos diabéticos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sligar, A. D., Howe, G., Goldman,… More

Sligar, A. D., Howe, G., Goldman, J., Felli, P., Karanam, V., Smalling, R. W., Baker, A. B. Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits. J. Vis. Exp. (148), e58964, doi:10.3791/58964 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter