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Medicine

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Published: June 2, 2019 doi: 10.3791/58964
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2,4, 1,5,6,7
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Division of Cardiology, University of Texas McGovern Medical School, 3Center for Laboratory Animal Medicine and Care, UT Health Science Center at Houston, 4Memorial Herman Heart and Vascular Center, Texas Medical Center, 5Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 6The Institute for Computational Engineering and Sciences, University of Texas at Austin, 7Institute for Biomaterials, Drug Delivery and Regenerative Medicine, University of Texas at Austin

Summary

Describimos un procedimiento quirúrgico utilizado para inducir isquemia periférica en conejos con hiperlipidemia y diabetes. Esta cirugía actúa como un modelo preclínico para afecciones experimentadas en la enfermedad arterial periférica en pacientes. La angiografía también se describe como un medio para medir la magnitud de la isquemia introducida y la recuperación de la perfusión.

Abstract

La enfermedad vascular periférica es un problema clínico generalizado que afecta a millones de pacientes en todo el mundo. Una consecuencia importante de la enfermedad vascular periférica es el desarrollo de la isquemia. En casos severos, los pacientes pueden desarrollar isquemia de extremidades críticas en la que experimentan dolor constante y un mayor riesgo de amputación de las extremidades. Las terapias actuales para la isquemia periférica incluyen cirugía de bypass o intervenciones percutáneas como la angioplastia con stent o aterectomía para restaurar el flujo sanguíneo. Sin embargo, estos tratamientos a menudo fallan en la progresión continua de la enfermedad vascular o reestenosis o están contraindicados debido a la mala salud general del paciente. Un enfoque potencial prometedor para tratar la isquemia periférica involucra la inducción de la neovascularización terapéutica para permitir que el paciente desarrolle vasculatura colateral. Esta red recién formada alivia la isquemia periférica restaurando la perfusión a la zona afectada. El modelo preclínico empleado con mayor frecuencia para la isquemia periférica utiliza la creación de isquemia de las extremidades traseras en conejos sanos a través de la ligadura de la arteria femoral. En el pasado, sin embargo, ha habido una fuerte desconexión entre el éxito de los estudios preclínicos y el fracaso de los ensayos clínicos con respecto a los tratamientos para la isquemia periférica. Los animales sanos suelen tener una regeneración vascular robusta en respuesta a la isquemia inducida quirúrgicamente, en contraste con la reducción de la vascularización y la regeneración en pacientes con isquemia periférica crónica. Aquí describimos un modelo animal optimizado para isquemia periférica en conejos que incluye hiperlipidemia y diabetes. Este modelo ha reducido la formación de colaterales y la recuperación de la presión arterial en comparación con un modelo con una dieta de colesterol más alta. Por lo tanto, el modelo puede proporcionar una mejor correlación con pacientes humanos con angiogénesis comprometida de las co-morbididades comunes que acompañan a la enfermedad vascular periférica.

Introduction

La enfermedad arterial periférica (PAD) es un trastorno circulatorio común en el que la progresión de la formación de placa aterosclerótica conduce a un estrechamiento de los vasos sanguíneos en las extremidades del cuerpo. El reciente aumento de los factores de riesgo de la aterosclerosis, incluyendo la diabetes, la obesidad y la inactividad, ha provocado un aumento de la prevalencia de la enfermedad vascular1. Actualmente, se estima que el 12% – 20% de la población general de más de 60 años de edad tiene enfermedad arterial periférica2. Una consecuencia importante de la enfermedad arterial periférica es el desarrollo de isquemia periférica, que se encuentra más comúnmente en las extremidades inferiores. En casos severos, los pacientes pueden desarrollar isquemia crítica de las extremidades, un estado en el cual hay dolor constante debido a la falta de flujo sanguíneo. Los pacientes con isquemia crítica de las extremidades tienen una probabilidad del 50% de que un miembro sea amputado dentro de un año de diagnóstico. Además, los pacientes con diabetes tienen una mayor incidencia de enfermedad arterial periférica y resultados más pobres después de intervenciones para revascularización3,4. Las terapias actuales para la isquemia periférica incluyen intervenciones percutáneas tales como aterectomía y colocación de stents o bypass quirúrgico. Sin embargo, para muchos pacientes estos tratamientos sólo proporcionan beneficios a corto plazo y muchos no son lo suficientemente sanos para los procedimientos quirúrgicos mayores. En este trabajo, describimos un modelo de animales preclínicos para la prueba de nuevos tratamientos dirigidos a la enfermedad vascular periférica que incorpora la generación de isquemia periférica en conejos a través de la ligadura quirúrgica en el contexto del estado de la enfermedad diabética.

El modelo de isquemia de las extremidades traseras en conejos se ha utilizado como un modelo fisiológico para la enfermedad vascular obstructiva y precursor preclínico de estudios en humanos durante más de medio siglo5,6. Los conejos son a menudo una especie preferida para estudios sobre isquemia periférica debido a la musculatura desarrollada del músculo del tobillo y de la pantorrilla, en contraste con los modelos animales grandes comunes que son unguatos (animales con pezuñas). Varios comentarios recientes han abordado el uso de este modelo y otros en el modelado de la enfermedad vascular periférica en los seres humanos7,8. Modelos similares utilizando isquemia de los miembros posteriores en conejos se utilizaron en estudios preclínicos de factores de crecimiento9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20, terapia génica21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44y células madre45,46,47,48,49,50 ,51para la neovascularización terapéutica en las extremidades. Desafortunadamente, los ensayos clínicos que siguieron a estos exitosos estudios en animales no muestran beneficios significativos para los pacientes52.

Una explicación sugerida de la razón de este fracaso traslacional es que la condición de isquemia periférica en pacientes humanos es aquella que incluye resistencia a las señales angiogénicas53,54,55, 56 , 57 , 58 , 59. varios estudios han demostrado defectos en las vías de señalización angiogénicas en la diabetes y la hiperglucemia. La diabetes y la hiperlipidemia conducen a una pérdida de proteoglicanos de sulfato de heparán y un aumento en las enzimas que cortan el sulfato de heparán, presentando un mecanismo potencial para la resistencia a la angiogénesis/Arteriogénesis terapéutica con factores de crecimiento60 , 61. por lo tanto, una característica clave de un modelo de isquemia periférica debe incluir un aspecto de resistencia terapéutica para que las terapias puedan evaluarse en el contexto del estado de la enfermedad presente en pacientes humanos.

En este trabajo, describimos un modelo de conejo de isquemia periférica a través de la ligadura quirúrgica de las arterias femorales. En el modelo se incorpora un período de introducción con la inducción de la diabetes y la hiperlipidemia. Comparamos este modelo con otro modelo que incorpora una dieta más alta en grasas sin diabetes y descubrió que el modelo con diabetes y menor nivel de hiperlipidemia fue más eficaz en la reducción del crecimiento de los vasos sanguíneos. Nuestro modelo combina avances que han sido utilizados por grupos separados, con el objetivo de proporcionar un método práctico y estandarizado para lograr resultados consistentes en la investigación de enfermedades vasculares periféricas.

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Protocol

Se realizaron estudios con animales con la aprobación de la Universidad de Texas en Austin y el centro de Ciencias UTHealth en el Comité institucional de cuidado y uso de animales de Houston (IACUC), la oficina de revisión de cuidado y uso de animales (ACURO) del ejército de los Estados Unidos Investigación médica y oficina de comando de materiales de protección de investigación, y de acuerdo con las pautas de NIH para el cuidado de animales.

1. inducción de la diabetes y la hiperlipidemia

  1. La transición de los conejos de Nueva Zelanda (4 – 6 meses de edad) de una taza de comida de alfalfa estándar a 0,1% Chow de colesterol en el transcurso de cuatro días. Para los días 1 – 5, use las proporciones de Chow a colesterol estándar de 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 y 0:1, respectivamente. Después de dos semanas en 0,1% de colesterol Chow, inducir a los conejos a tener diabetes mediante la inyección de alloxan como se describe en los siguientes pasos
  2. Sedate a los conejos usando 35 – 75 mg/mL de ketamina y 1 – 2 mg/mL de acepromazina por inyección subcutánea y prepárelo para una inyección intravenosa introduciendo un catéter en la vena marginal de la oreja izquierda usando un catéter de 22 g.
  3. Recoja una gota de sangre de los conejos a través del centro del catéter de la vena de la oreja para la medición basal del nivel de glucosa en sangre (BGL). Se puede utilizar cualquier glucómetro estándar. Los niveles normales de glucosa para un conejo suelen estar en el rango de 80 a 150 mg/dL.
  4. Inyectar alloxan en 100 mg/kg reconstituido en solución salina a un volumen de 8 mL a través del catéter del oído lentamente durante un período de 8 minutos usando una bomba de jeringa.
  5. Compruebe el BGL cada hora para el próximo 12 h usando un glucómetro estándar para monitorear la hipoglucemia.
    1. Coloca el conejo en un restrainer.
    2. Anestesiar el oído con 2,5% lidocaína/2.5% crema de prilocaína.
    3. Tomar sangre de la vena del oído lateral usando una aguja de 27 G y medir la BGL usando un medidor estándar.
  6. Mida la BGL dos veces al día durante los primeros 7 días. Dé a los conejos una inyección de insulina Si la BGL alcanza o excede 350 mg/dL.
  7. Prepare una bola de acero inoxidable de 3 mm para su implantación como marcador de tamaño durante los angiogramas antes del día de la cirugía.
    1. Corte una pieza circular de 10 mm de láminas silásticas de una lámina más grande usando un punzón de biopsia.
    2. Monte la pelota en el centro de la lámina con un sellador de silicona transparente.
    3. Cubra completamente la pelota con el sellador. Permitir que el sellador cure durante un mínimo de 24 h.
    4. Coloque la pelota en una bolsa abierta de polietileno de baja densidad de 2 pulgadas x 3 pulgadas y colóquelo en una bolsa de esterilización para esterilizar con gas de óxido de etileno.

2. preparación del conejo para la cirugía

  1. Anestesiar el conejo usando 20 – 40 mg/kg de ketamina y 2 mg/kg de midazolam vía inyección subcutánea. Coloca el conejo en 1.5% – 3% isoflurano (típicamente 2%) a lo largo de la sedación inicial usando una mascarilla. Dar una inyección de alfaxalone para mantener la anestesia a través de una inyección intramuscular de 3 mg/kg.
  2. Una vez anestesiado, retire la mascarilla e inserte un tubo endotraqueal con manguito, en la vía respiratoria y conéctelo a un respirador. Continuar administrando isoflurano en 1.5% – 3%.
  3. Recoja la sangre de la arteria central de cualquier oreja para un panel de química basal.
  4. Coloque un catéter de la vena del oído de 22 G en la vena del oído lateral para el goteo de solución de Ringer lactato durante todo el procedimiento quirúrgico. Alternativamente, se puede utilizar una solución salina normal (0,9% cloruro sódico).
  5. Usando la vena lateral en el oído opuesto, coloque un catéter en la vena y entregue alfaxalone a 6 mg/kg/h. aumente gradualmente el alfaxalone a 8 mg/kg/h mientras disminuye el isoflurano al 0,6% durante el período de preparación.
  6. Para limitar el dolor y el riesgo de infección, administrar buprenorfina (0,01 mg/kg) y enrofloxacina (5 mg/kg) utilizando una inyección subcutánea con una aguja de 25 G.
  7. Recorta el cabello en el cuello, los muslos internos derecho e izquierdo, y la espalda usando tijeras (#40 cuchilla). El cabello se retira de la parte posterior para mantener el contacto con la almohadilla de puesta a tierra.
  8. Coloque un manguito de presión arterial en cada uno de los miembros posteriores y mida la presión arterial inicial. Coloque el brazalete justo debajo de la rodilla con la sonda justo por encima del corvejón en la superficie lateral.
  9. Coloque el conejo en la mesa de cirugía en la espalda y frote y drapeado los sitios de cirugía. Esto incluye el cuello para el acceso a la arteria carótida y el muslo derecho interno para el acceso a la arteria femoral. Realice el exfoliante de esterilización con exfoliaciones alternas de 2% de clorhexidina y 70% de alcohol etílico. Repite esto tres veces, luego aplica un spray final con solución de clorhexidina al 2%.
  10. Coloque una bola de acero inoxidable de 3 mm que haya sido esterilizada dentro de una bolsa de polietilo de baja densidad en la parte superior de la pierna derecha (fregada) cerca de la parte superior del muslo para servir como una referencia de tamaño durante las mediciones de angiograma. Coloque un paño estéril sobre la pierna hasta el momento de la cirugía. Deje la pelota dentro de la bolsa plástica estéril durante el primer angiograma.

3. angiografía

  1. Exponga la arteria carótida común correcta
    1. Hacer una incisión de 4 – 5 cm de largo lateral a la tráquea usando un bisturí con una cuchilla #15.
    2. Utilice una disección contundente para exponer la arteria carótida y abrir la incisión con pequeños retractores de Weitlaner. Aísle cuidadosamente la arteria carótida de la vena yugular y el nervio vago. Típicamente, una tijera curvada de Metzenbaum y un mosquito hemostato curvo se utilizan para la disección contundente. Asegúrese de obtener la separación completa de la arteria carótida desde el nervio y la vena yugular para que las ligaduras solo LIGEN la arteria.
  2. Coloque una ligadura usando una sutura de seda 4-0 en los extremos proximal y distal de la arteria expuesta. Atar el extremo distal de la carótida con el nudo del cirujano seguido de cuatro nudos cuadrados. En el extremo proximal, utilice un ligaloop para permitir que se apriete o aflojar según sea necesario. El uso de un ligaloop colocado en el extremo proximal de la arteria expuesta puede ayudar a asegurar el introductor y el catéter.
  3. Administrar 500 UI de heparina a través de la IV. Utilizar aproximadamente 0,5 mL de 1% de lidocaína aplicada a lo largo de la carótida expuesta para dilatar el recipiente. Un tratamiento suele ser suficiente, pero se puede repetir según sea necesario. Corte aproximadamente a mitad de camino a través de la arteria carótida usando un bisturí o tijeras de iris, luego coloque la herramienta de inserción de alambre de 4 pulgadas en la arteria.
  4. Alimentar una guía de 0,014 pulgadas x 185 cm a través de la herramienta de inserción a la bifurcación aórtica en la cresta ilíaca en la aorta descendente. Retire la herramienta de inserción e inserte un catéter angiográfico de 3F en forma de coletas sobre el alambre.
  5. Avance el catéter de coletas para que sea 2 cm proximal a la bifurcación aórtica en la cresta ilíaca en la aorta descendente.
  6. Coloque la punta del catéter entre la séptima vértebra lumbar y la primera de las vértebras sacras. Pruebe la ubicación del catéter inyectando manualmente un agente de contraste de 2 – 4 mL.
  7. Administrar una inyección intraarterial de 100 μg de nitroglicerina a través del catéter para aumentar la vasodilatación.
  8. Administrar 0,8 mL de 1% de lidocaína al conejo a través del catéter para ayudar con la vasodilatación durante el angiograma. Fije el tubo para el inyector al catéter y retire las burbujas de aire en la línea. Inyecte 8-9 mL de medio de contraste utilizando un inyector angiográfico automatizado a través del catéter.
  9. Grabe imágenes seriales de los miembros posteriores mediante angiografía.
    1. Fije el inyector de energía para inyectar contraste a 3 mL/seg para un total de 8-9 mL. Realice una angiografía por sustracción digital a 6 fotogramas por segundo.
    2. Seleccione las imágenes seriales creadas y modifique una foto de cada angiograma utilizando aproximadamente-40% de ajuste para minimizar la apariencia del hueso y capturar una imagen completa de la perfusión del recipiente con contraste. En la figura 1se muestra un angiograma de ejemplo del flujo vascular después de la ligadura/extirpación de la arteria femoral.

4. el aislamiento de la arteria femoral

  1. Haz una incisión longitudinal en la piel sobre la arteria femoral derecha usando un bisturí (#15 cuchilla). Asegúrese de que la incisión se extiende inferiormente desde el ligamento inguinal que termina en la zona apenas proximal a la rótula (aproximadamente 6 cm).
  2. Utilice una disección contundente con tijeras Metzenbaum curvadas o un hemostato de mosquito curvado para exponer la arteria femoral.
  3. Utilice los retractores de Weitlaner para sostener la incisión abierta.
  4. Añadir 0,5 mL de 1% de lidocaína localmente para reducir la irritación del nervio y promover la vasodilatación.
  5. Continúe la disección contundente de los tejidos para liberar toda la longitud de la arteria femoral junto con todas las ramas de la arteria femoral, incluyendo las arterias epigástricas inferiores, femoral profundo, circunflejo lateral y epitgástrico superficial (figura 2A) .
  6. Diseccionar más a lo largo de las arterias poplítea y saphenosa, así como la arteria iliaca externa (figura 2A). Humedecer periódicamente el área con solución salina para protegerlo de daños en los tejidos. Si la disección contundente se realiza a lo largo de la ranura femoral (entre los músculos) no hay necesidad de cortar el músculo.
  7. Separe cuidadosamente la arteria de la vena y el nervio como se muestra en la figura 2B, C. Ligate las arterias indicadas por el diagrama con 4,0 suturas de seda colocando dos lazos con suficiente espacio entre ellos para cortar la arteria. Estos lazos se realizan con un nudo del cirujano seguido de cuatro nudos cuadrados.
  8. Corte entre los dos lazos en las arterias ligadas usando las pequeñas tijeras Metzenbaum. El consumo de la arteria femoral desde su origen proximal como una rama de la arteria ilíaca externa hasta el punto distalmente, donde se bifurca para formar las arterias saphenosas y popliteales.

5. repetir la angiografía

  1. Utilice la sutura de seda 4-0 para sujetar la lámina silástica, con una bola de acero inoxidable de 3 mm a la parte superior del músculo cuádriceps. Tire de la piel sobre la pelota después de que esté en su lugar.
  2. Administrar una inyección intraarterial de 100 μg de nitroglicerina a través del catéter para aumentar la vasodilatación.
  3. Si es necesario, administrar otro 0,8 mL de 1% de lidocaína al conejo a través del catéter para ayudar con la vasodilatación durante el angiograma.
  4. Inyecte 8-9 mL de medio de contraste usando un inyector angiográfico automatizado.
  5. Realice la angiografía como se describe en el paso 3,9.

6. cierre de la herida y recuperación

  1. Retire el catéter de la arteria derecha. Amarre la arteria usando la sutura de seda 4-0 que ya está en su lugar alrededor de la arteria.
  2. Sutura ambas heridas cerradas. Cierre las capas musculares y subcutículas utilizando 4-0 polydioxanona o 3-0 Poliglactina 910 en una aguja cónica (ver tabla de materiales) en un patrón de sutura continua. Cerrar la piel usando 4-0 Polidioxanona o 4-0 Poliglactina 910 en una aguja de corte inverso (ver tabla de materiales) en un patrón de sutura subcutcular continua enterrado.
    Nota: Si está disponible, se prefiere la Polidioxanona para ambos.
  3. Administrar inyecciones intradérmicas de 0,25% de bupivacaína cerca de las incisiones usando una jeringa con una aguja de 25 G. Inserte la aguja e inyecte 0,5 mL mientras la aguja se tira hacia atrás. Dar una inyección por lado de la herida para la incisión en el cuello (dos inyecciones en el cuello) y dos inyecciones por lado de la herida para la incisión en la pierna (cuatro inyecciones en la pierna; seis inyecciones en total). El volumen total inyectado es de 3 mL (0,5 mL x 6 inyecciones).
  4. Administrar inyecciones subcutáneas de 0,5 mg/kg de meloxicam y liberación sostenida de buprenorfina a 0,12 mg/kg.
  5. Supervise el conejo a medida que se recupere de la anestesia. El conejo comenzará a tragar automáticamente a medida que se despierte de la anestesia. Una vez que se produzca la respuesta a la deglución, retire la sonda endotraqueal. Proporcionar supervisión estrecha y soporte térmico hasta que el conejo es capaz de mantener la función cardiovascular y la temperatura corporal. Devuelva el conejo a su recinto una vez que sea capaz de ambular.
  6. Emplear verduras frescas y/o la alimentación de la jeringa de una dieta de cuidado crítico junto con las inyecciones de suero salino subcutánea si el conejo no tolera la comida después de la cirugía. Se puede usar repollo, brócoli, coliflor, zanahorias u otros en verduras de temporada. Triturar las verduras y mezclarlas para ayudar al conejo a volver a comer.

7. monitoreo

  1. Anestesiar los conejos cada dos semanas para adquirir la presión arterial en ambas piernas como se describe en el paso 2,8. Cosechar la sangre de la arteria central del oído para su uso en los ensayos de química sanguínea. Alternativamente, tome sangre de la vena safena o de la vena cefálica. Tomar aproximadamente 2 mL en cada punto de tiempo. Utilice un panel de química sanguínea estándar para el análisis. Si es necesario, agregue pruebas para la lipoproteína de baja densidad (LDL), la lipoproteína de alta densidad (HDL) o la hemoglobina A1C (HbA1c).
  2. Tome una cantidad muy pequeña de sangre para las mediciones de BGL.

8. el tratamiento

  1. Prepare diez jeringas con tratamiento, portador y agente reticulante. Llene cada jeringa justo antes de usar con 100 μL de purines de sulfato de calcio y luego 100 μL de alginato de sodio al 2% con factores de crecimiento u otros tratamientos de tal forma que el alginato esté más cerca de la punta de la jeringa.
  2. Administre una inyección preparada en el músculo antes de preparar la siguiente. Esto reduce el tiempo que el alginato interactúa con el sulfato de calcio en la jeringa. Espacie las inyecciones uniformemente a lo largo de ambos lados de la arteria femoral en el muslo. Para lograr inyecciones uniformes, cree una lámina de silicona con orificios para guiar la inyección, como se describe en otros estudios19. Esto se puede preparar fácilmente usando un punzón de biopsia para crear agujeros en láminas de silicona disponibles comercialmente.

9. angiografía final, eutanasia, fijación de perfusión y cosecha de tejidos

  1. En la fecha del punto final, realice la angiografía como se describe en el paso 3 pero utilice la arteria carótida izquierda para acceder.
  2. Después de la angiografía, mueva el animal a la mesa necropsia y realice la fijación de perfusión para preservar los tejidos de las extremidades posteriores:
    1. Aumente el isoflurano a 3% – 4% y realice una pizca de dedo para confirmar que la anestesia es lo suficientemente profunda.
    2. Administrar 1000-2000 UI de heparina por vía intravenosa.
    3. Crear una incisión a lo largo de la línea media de la caja torácica y que abarca la longitud del diafragma utilizando un bisturí con una cuchilla #20.
    4. Con la caja torácica expuesta, corte las costillas justo a la izquierda de la línea media usando cortadores de costillas. Utilice los retractores de Weitlaner para exponer el corazón.
    5. Configure la bomba con un tubo de salida con un diámetro interior de 1/8 pulgadas y una aguja de 18G al final. Precarga la línea con solución salina y tenga al menos 600 mL de solución salina y formalina preparadas en recipientes separados para la perfusión.
    6. Inserte la aguja de 18 G conectada a la bomba en el ventrículo izquierdo a través del ápice del corazón. Inserte otra aguja de 18 G (no unida a nada) en la aurícula derecha y permita que la sangre fluya hacia el borrador descendente de la mesa necropsia.
    7. Utilice una bomba de perfusión para controlar el flujo de aproximadamente 500 mL de solución salina en el corazón. Utilice un ajuste de bomba para fluir 110 mL/min.
    8. Una vez que el fluido proveniente del corazón esté despejado, mueva el tubo del depósito de solución salina a uno lleno con una solución de formalina del 10%. La contracción se producirá en las cuatro extremidades si la perfusión funciona correctamente. Bombear aproximadamente 500 mL de solución de formalina en el ventrículo izquierdo.
    9. Apague la bomba y retire las agujas del corazón.
  3. Retira ambos miembros posteriores de la cadera cortando alrededor de la articulación de la cadera con un bisturí con #20 cuchilla. Utilice un pequeño cortador de costillas para quitar las extremidades. Utilice el miembro no isquémico como control.
  4. Conservar las extremidades en formalina durante 24 h a 4 ° c y luego almacenarlas en etanol al 70% a 4 ° c.
  5. Para el análisis histológico, tome varias biopsias de las extremidades. Hemos utilizado ocho biopsias de 6 mm tomadas en regiones a través del muslo y la pantorrilla en ambas extremidades.
    Nota: mientras que la medición de la presión arterial del tobillo y la angiografía son los métodos más comúnmente utilizados para medir la recuperación del flujo sanguíneo, otros métodos se pueden utilizar para rastrear la recuperación de los animales incluyendo ultrasonido Doppler, imágenes Doppler láser, infrarrojos Termografía62, microesfera determinada perfusión63,64, tomografía computarizada (CT), e imagen por resonancia magnética (RM)65.

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Representative Results

Después de la inducción de la diabetes y el inicio de la dieta de colesterol 0,1%, el colesterol total para los conejos con diabetes y la dieta de colesterol fue de 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 conejos masculinos) promedió los puntos de tiempo totales y conejos. El nivel de BGL para estos conejos fue de 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 conejos masculinos). En la figura 3 , en comparación con los conejos bajo una dieta de colesterol más alta (1% de colesterol), se muestra un curso de tiempo para las relaciones químicas de la sangre y la presión arterial en las piernas en un conejo típico. En los animales no diabéticos, incluso con el colesterol más alto, descubrimos que hubo aumento de la recuperación de la presión arterial en la extremidad isquémica y vascularización en los angiogramas en el punto de tiempo final (figura 3). Los animales en la dieta más alta de colesterol/grasa también mostraron aumento de los niveles de lipoproteína A, sugiriendo estrés en el hígado. Por lo tanto, la diabetes con un nivel de colesterol más bajo condujo a una perfusión más comprometida en el punto final del estudio. Histológicamente, hay cambios en la estructura muscular consistentes con edema y daño isquémico en algunos lugares figura 4. En algunos casos, uno puede observar cambios/daños en las fibras musculares debido a la isquemia. Esto se puede observar como pérdida o alteración de las fibras musculares en el análisis histológico, como se ha observado en algunos modelos de isquemia de extremidades posteriores en ratones. Sin embargo, se necesita atención para distinguir estos cambios de los artefactos histológicos del procesamiento del tejido. El inmunostamiento para PECAM y αSMA se puede utilizar para identificar el número de recipientes y recipientes más grandes en las secciones de tejido (figura 4). En general, el modelo que usa diabetes con una dieta de colesterol de nivel inferior produjo déficits repetibles en la presión arterial y vascularización sobre el modelo de dieta de colesterol más alto sin diabetes.

Figure 1
Figura 1: angiogramas para el miembro posterior de una pre-cirugía de conejo diabético y no diabético, después de la cirugía y después de la recuperación durante 70 días después de la ligadura de la arteria femoral y la extirpación. (A) angiograma de extremidad isquémica (izquierda) y miembro control contralateral (derecha). (B) imagen ampliada de la extremidad isquémica en el lugar de la ligadura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: inducción de isquemia de los miembros posteriores en conejos a través de la ligadura de la arteria femoral y la extirpación. (A) ilustración de la anatomía vascular de la extremidad posterior del conejo. Coloque los lazos en todos los puntos marcados para ligar las arterias. Modificado y utilizado con el permiso71. (B) campo quirúrgico que muestra el corte hasta la arteria femoral antes de la ligadura. (C) arterias femorales con ligaciones en su lugar para inducir isquemia de los miembros posteriores. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: la presión arterial típica y las sustancias químicas de la sangre para los conejos con isquemia de los miembros posteriores en el transcurso del modelo. El grupo diabético/MC fue inducido a tener diabetes y se le dio una dieta de colesterol 0,1%. Al grupo no diabético/HC se le dio una dieta de colesterol del 1%. BGL = nivel de glucosa en sangre. TC = colesterol total. LIPA = lipoproteína (a). BP = relación de la presión arterial entre la extremidad isquémica y no isquémica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: análisis histológico del músculo de la extremidad posterior en conejos diabéticos 70 días después de la ligadura de la arteria femoral. Se realizó la tinción de H & E, así como la tinción inmunohistoquímica para el marcador endotelial, PECAM, y marcador de célula de músculo liso vascular, αSMA. Las muestras de tejido se biopsia de la extremidad isquémica y el miembro de control contralateral no isquémico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos presentado un modelo preclínico para inducir isquemia de los miembros posteriores en conejos con diabetes e hiperlipidemia. En muchos estudios, hay ambigüedad en la técnica utilizada para crear isquemia de los miembros posteriores en conejos. En ratones, la severidad y la recuperación de la isquemia de los miembros posteriores depende en gran medida de la ubicación de la ligadura y la técnica utilizada para inducir la isquemia. La importancia de la técnica presentada en este trabajo es que permite la inducción consistente de isquemia que no se recupera completamente después de 8 semanas en animales diabéticos. En particular, cuando a los animales se les dio una dieta más alta en colesterol y grasas, pudieron recuperarse a niveles basales cercanos de la relación de presión arterial de las extremidades. Además, en la dieta más alta en grasas los animales tenían alteraciones en las enzimas hepáticas que sugieren daño hepático. Por lo tanto, el modelo diabético con un nivel más bajo de colesterol/grasa parece ser un modelo más consistente y relevante de isquemia crónica en la extremidad.

Dentro de este modelo se pueden destacar cuatro pasos esenciales que incluyen la inducción de la diabetes, la angiografía, la ligadura quirúrgica de las arterias femorales y la aplicación del tratamiento. Entre estos pasos, la inducción de la diabetes fue uno de los pasos más críticos y uno que puede requerir una mayor optimización para cada laboratorio. La tasa de inyección de alloxan es un factor importante que altera la toxicidad y la efectividad de la inducción de la diabetes por alloxan para los conejos. Cuando se inyecta demasiado rápido, alloxan causó inestabilidad en la BGL y la muerte en los conejos. Esto a veces se puede observar como hipoglucemia que no se resuelve a través de inyecciones de soluciones de dextrosa o en otros casos extremadamente alta BGL. Si se inyecta demasiado lentamente, los conejos a menudo no pueden volverse diabéticos. Es posible que este parámetro deba optimizarse para conejos de diferentes fuentes. Por lo general, los conejos se volverán hiperglucémico durante 1-3 h, pero la BGL comenzará a caer. Por lo tanto, generalmente no se administra insulina en el día de la inducción de la diabetes. Sin embargo, si el BGL cae por debajo de 100 mg/dL en las primeras 24 h, se puede aumentar inyectando 10,0 mL de solución de dextrosa al 5% por vía subcutánea o cambiando el suministro de agua a una solución de dextrosa al 10% (normalmente es suficiente durante la noche). Cada vez que se administra insulina, se realiza una prueba de BGL adicional para garantizar que los niveles de glucosa no bajen demasiado. La respuesta a la insulina a menudo varía para cada conejo. Por lo tanto, los regímenes de dosificación individuales se utilizan para normalizar la BGL en función de cómo el conejo responde a la insulina. La diabetes se induce típicamente después de 2-3 días después de la inyección de alloxan.

Como modelo preclínico de enfermedad vascular periférica y isquemia de las extremidades, el modelo presentado tiene algunas limitaciones potenciales. La inducción de la diabetes con alloxan conduce al rápido desarrollo de la diabetes tipo I. Esto contrasta con el desarrollo crónico de la diabetes tipo II que es más frecuente en pacientes humanos. Por otra parte, la isquemia se desarrolla de forma aguda debido a la ligadura quirúrgica en lugar de debido al desarrollo crónico de la enfermedad vascular y placas ateroscleróticas. Una limitación fundamental del uso de conejos es su fragilidad como modelo animal. Los animales sólo tolerarán una cantidad limitada de hiperlipidemia en combinación con diabetes tipo I y la optimización de la cantidad máxima de enfermedad sin que el animal muera fue un objetivo importante en la creación de este protocolo. Nuestro grupo ha presumido que los pacientes con isquemia periférica desarrollan resistencia terapéutica a factores de crecimiento angiogénicos y que esto puede desempeñar un papel importante en el fracaso de la terapéutica basada en factor de crecimiento para la isquemia66. Con este fin, hemos demostrado una pérdida en los proteoglicanos de la superficie celular y un aumento en la heparanase en muestras de tejido animal y humano55,58,67,68,69,70 . Se desconoce si el modelo de conejo descrito aquí demuestra resistencia al factor de crecimiento, aunque la observación de que hay isquemia a largo plazo con diabetes y un modelo de hiperlipidemia moderado en comparación con el modelo de hiperlipidemia alta sugeriría existe un cierto déficit en el proceso de revascularización.

Para la inclusión de tratamientos en el modelo, es importante tener un período de recuperación después de la inducción de la isquemia para permitir que la fase de curación aguda ocurra sin intervención. Si durante este tiempo se administran terapias, la respuesta sería más relevante para mejorar la respuesta a la isquemia aguda en lugar de la isquemia crónica que caracteriza la enfermedad vascular periférica. Tal modelo puede ser relevante para la lesión isquémica aguda en trauma o trombosis, pero probablemente no proporcionaría una buena correlación con la isquemia crónica. Dada la mala correlación entre los resultados positivos en los modelos preclínicos de isquemia en animales sanos y los resultados de los ensayos clínicos, la inclusión de la diabetes u otro factor que reduzca la regeneración vascular es esencial para intentar la isquemia de las extremidades recapitulada en los seres humanos para la creación de terapias futuras.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen con gratitud el financiamiento a través del programa de investigación dirigida por el Congreso del Departamento de defensa (DOD CDMRP; W81XWH-16-1-0582) a ABB y RS. Los autores también reconocen la financiación a través de la Asociación Americana del corazón (17IRG33410888), el CDMRP DOD (W81XWH-16-1-0580) y los institutos nacionales de salud (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) a ABB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Henry Schein Medical 1537468 / 1531434 250 mL bag / 1000 mL irrigation btl
1 mL Syringe VWR BD309628
10 mL Syringe VWR BD309695
10% Formalin Fisher-Scientific 23-245684
18G Needle VWR 89219-294
20G Needle VWR 89219-340
25G Needle VWR 89219-290
27G Needle VWR 89219-288
5 mL Syringe VWR BD309646
5% Dextrose Patterson Veterinary 07-800-9689
Acepromazine Patterson Veterinary VEDC207
Alfaxalone Patterson Veterinary 07-891-6051
Alginate Sigma-Aldrich PHR1471-1G
Alloxan Monohydrate Sigma-Aldrich A7413
Angiography Equipment Toshiba Infinix-i
Angiography Injector Medrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594 Thermo Fisher Scientific A-11032 Secondary Antibody for IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary Antibody for IHC
a-SMA Antibody Abcam ab5694 Primary Antibody for IHC
Baytril Bayer Animal Health 724089904201 Enrofloxacin
Blood Chemistry Panel IDEXX 2616 Rabbit Panel
Blood Pressure Cuff WelchAllyn Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7
Blood Pressure Monitor Vmed Technology Vmed Vet-Dop2
Bupivacaine Henry Schein Medical 6023287
Buprenorphine Patterson Veterinary 42023017905
Buprenorphine SR ZooPharm
Calcium Sulfate CB Minerals Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC
Chlorhexidine Scrub Patterson Veterinary 07-888-4598
Chloroform Fisher-Scientific C298-4
Cholesterol Sigma-Aldrich C8503
DAPI Thermo Fisher Scientific 62248
Ear Vein Catheter Patterson Veterinary SR-OX165 Surflo IV catheters
Endotracheal tube Patterson Veterinary Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size
Glucometer Amazon B001A67WH2 Accu-Chek Aviva
Glucometer Test Strips McKesson Medical-Surgical 788222 Accu-Chek Aviva Plus
Guidewire Boston Scientific 39122-01
Hair Clippers Amazon B000CQZI3Q Oster #40 blade
Heating Pad Cincinnati Subzero 273
Heating Pad Pump Gaymar Gaymar T/Pump
Hemostat Fine Science Tools 13009-12 Curved Mosquito Hemostat
Heparin Patterson Veterinary
Insertion Tool Merit Medical Systems MAP550 metal wire insertion tool
Insulin HPB Pharmacy Novalin R & Novalin N
Insulin Syringes McKesson Medical-Surgical 942674
Introducer Cook Medical G28954 3F Check Flo Performer Introducer
Isoflurane Henry Schein Medical 1100734
Ketamine Patterson Veterinary 856440301
Lactated Ringers McKesson Medical-Surgical 186662
Lidocaine McKesson Medical-Surgical 239936
Lidocaine/Prilocaine cream McKesson Medical-Surgical 761240
Ligaloop V. Mueller CH117 / CH116 White Mini / Yellow Mini
Mazola Corn Oil Amazon B0049IIVCI
Medrad Syringe McKesson Medical-Surgical 346920 150 mL
Meloxicam Patterson Veterinary
Metal ball sutures Ethicon-Johnson & Johnson K891H 4-0 silk C-1 30"
Metzenbaum Scissors Fine Science Tools 14019-13
Midazolam Henry Schein Medical 1215470
Nitroglycerin McKesson Medical-Surgical 927528
PECAM Antibody Novus Biologicals NB600-562 Primary Antibody for IHC
Perfusion Pump Masterflex
Pigtail Catheter Merit Medical Systems 1310-21-0053 3F pigtail
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129271 4-0 taper RB-1 (needle comes on suture)
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129031 4-0 reverse cutting FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) suture Butler 7233-41 3-0 taper RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) suture McKesson 104373 4-0 reverse cutting FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa) LabDiet 5321
Rabbit Restrainer VWR 10718-000
Rib Cutters V. Mueller
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade Fine Science Tools 10015-00 #15 blade
Silk Sutures Ethicon-Johnson & Johnson A183H 4-0 silk ties 18"
Stainless Steel Ball McMaster-Carr 1598K23 3-mm diameter
Surgical Drapes Gepco 8204S
Syringe Pump DRE Veterinary Versaflow VF-300
Visipaque contrast media McKesson Medical-Surgical 509055
Weitlaner Retractor Fine Science Tools 17012-13

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Medicina problema 148 isquemia de las extremidades traseras enfermedad arterial periférica enfermedad vascular periférica conejos diabetes hiperlipidemia angiografía
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Sligar, A. D., Howe, G., Goldman, J., Felli, P., Karanam, V., Smalling, R. W., Baker, A. B. Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits. J. Vis. Exp. (148), e58964, doi:10.3791/58964 (2019).

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