Her beskriver vi en høj overførselshastighed metode for omfattende stof overvågning, der giver mulighed for bedre opløsning og påvisning af store paneler af narkotika misbrug og deres metabolitter, med kvalitetskontrol baseret på multisegment injektion-kapillær elektroforese-massespektrometri.
Nye analysemetoder er tvingende nødvendigt at aktivere høj overførselshastighed, men omfattende stof screening, givet en alarmerende opioid og prescription drug krise på folkesundhedsområdet. Konventionelle urin drug test baseret på en to-lags immunassay skærmen efterfulgt af en gaskromatografi-tandem massespektrometri (GC-MS/MS) eller liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metode er dyrt og tilbøjelig til bias samtidig være begrænset til målrettede paneler af kendte medicin misbrug (DoA). Heri, skitsere vi en forbedret metode til narkotika overvågning, der giver mulighed for opløsning og påvisning af en udvidet panel af DoA og deres metabolitter, når du bruger multisegment injektion-kapillær elektroforese-massespektrometri (MSI-CE-MS). Multipleksede separationer af ti urinprøver med en kvalitetskontrol af CE (< 3 min/eksempel) sammen med full scan dataopsamling ved hjælp af en time-of-flight massespektrometer (TOF-MS) under positiv ion mode påvisning giver mulighed for identifikation og kvantificering af DoA ovenstående anbefalede cut-off niveauer. En fremragende opløsning af narkotika isomerer og isobarer, herunder baggrunden interferens, nås når du bruger MSI-CE-MS med en elektrokinetiske spacer mellem prøve segmenter, hvor nøjagtig masse/Molekylær formel sammen med comigration af en matchende deutereret intern standard og påvisning af en eller flere bio-omdannet metabolitter lette DoA identifikation over et bredere afsløring vindue. Urinprøver kan Derudover analyseres direkte uden enzymet deconjugation for hurtig screening uden kompliceret eksempel workup. MSI-CE-MS giver mulighed for overvågning af et bredt spektrum af DoA, der er nødvendige for behandling overvågning af højrisiko patienter, herunder bekræfter foreskrevne narkotika tilslutning, afsløre ulovlige narkotika brug/substitution og evaluere optimal dosering regimer som det kræves for nye fremskridt i præcision medicin.
En alarmerende stigning i misbrug af og afhængighed af opioider til håndtering af kronisk smerte repræsenterer en voksende trussel for folkesundheden, med over 70.000 drug overdosis dødsfald i USA anslås i 20171. På samme måde, forskellige andre psykotrope medicin er også almindeligt ordineret til børn og unge voksne til behandling af angst, depression og mental sundhed spørgsmål2. Som et resultat, er urin drug test metoder, bredt udviklet til arbejdspladsen og retsmedicinske toksikologi, af vital betydning for den terapeutiske overvågning af ordineret medicin, der er udsat for tolerance og afhængighed af3,4. Dette er nødvendigt for at sikre overholdelse, optimale terapeutiske virkning og patientsikkerhed, samtidig med at afsløre potentielle substitution, herunder ulovlig eller nonprescribed stof misbrug. I øjeblikket, urin dopingtest for DoA stole på en todelt fremgangsmåde, som består af en indledende konkurrencedygtige immunassay skærm via punkt af pleje enheder eller laboratorium analyzers, efterfulgt af en verifikationsprøve med større specificitet baseret på GC-MS/MS og i stigende grad, LC-MS/MS5. Dog er immunassays tilbøjelige til bias, som antistof reagenser binde nonspecifically til forskellige narkotika klasser til at generere en Præsumptive screen-positivt resultat, som forhindrer en pålidelig identifikation og kvantificering af specifikke stoffer eller komplekse stof blandinger6. I denne sammenhæng mere præcise urin dopingtest er tvingende nødvendigt i betragtning af de ublu omkostninger af omfattende flere skærme,7 herunder designerstoffer og syntetiske urin produkter, der unddrager sig konventionelle målrettet assays.
Højeffektiv separationer sammenholdt med høj opløsning MS (HRMS) ved hjælp af TOF eller orbitrap masse analyzers er blevet foreslået som en disse strategi for narkotika overvågning i en æra af Polyfarmaci og udvide paneler af DoA8,9 . Konventionelle LC-separationer er dog langsom (> 15 min) på grund af de lange eluering gange til løsning af kemisk forskellige klasser af DoA og deres metabolitter ved hjælp af gradient eluering programmer, som begrænser prøve overførselshastighed for rutinemæssig stof screening. Alternativt, direkte analysemetoder baseret på desorption ionisering (DESI)10 og laser diode termisk desorption (LDTD) giver mulighed for hurtigere stof screening uden adskillelse11. Disse omgivende ionisering metoder er dog udsat for Isobar/isomer interferenser når analysere komplekse urinprøver fra, hvilket kræver uafhængige bekræftende prøvning.
Vores laboratorium har for nylig udviklet en multiplex adskillelse platform for at øge gennemløbet af prøven samtidig bevare en høj effektivitet adskillelse baseret på MSI-CE-MS12opløsning og data pålidelighed. Roman data arbejdsprocesser kan designes i MSI-CE-MS for disse metabolitten profilering (dvs.metabolomics) af volumen-begrænset biospecimens, kvalitetskontrol (QC) give mulighed for batch korrektion som krævet for storstilet befolkning studier13. I dette tilfælde udføres separationer ved hjælp af en isocratic buffer med opløste ionisering optræder under steady-state opløsningsmiddel, når du bruger en konventionel kappe flydende interface, som giver mulighed for serielle injektioner af 10 eller flere prøver inden for en enkelt køre for hurtigt men selektiv screening af forskellige klasser af DoA og deres metabolitter14. Fokus i denne undersøgelse er at yderligere validere MSI-CE-MS til direkte analyse af autentiske urinprøver fra en repræsentativ kohorte af klinisk deprimerede patienter ved hjælp af en “fortynde-og-skyd”-metode, der undgår behovet for enzymet hydrolyse15. Derudover gennemførelsen af en elektrokinetiske spacer mellem seriel prøve stik i MSI-CE-MS16 blev udført at yderligere forbedre løsningen af forskellige stof isomerer/isobarer, baggrund urin interferenser og/eller Cross-interferens når screening store paneler af DoA. Den absolutte kvantificering af DoA i urinprøver fra når ved hjælp af matching deutereret interne standarder (d-er) er påvist, når du bruger MSI-CE-MS. Denne tilgang også letter drug identifikation samt udlede korrekt prøve placeringen af skærmen-positive tilfælde i forhold til en drug panel blanding på de anbefalede cut-off screeningsniveau, der også fungerer som en intern reference/QC inden for samme flugt.
Konventionelle kromatografisk separation typisk stole på en enkelt prøve injektion pr. løb, som efterfølges af en gradient eluering til at løse komplekse stof blandinger og kolonne renovering. Disse krav fundamentalt begrænse sample overførselshastighed og pligt cykle selv når ved hjælp af optimal kolonne-skifte programmer. I denne sammenhæng, store mængder urin drug analysis for arbejdspladsen, toksikologi eller terapeutisk kontrol applikationer ved GC-MS/MS og i stigende grad, LC-MS/MS er således udført sideløbende, men anvendes fortrinsvis som en andenrangs eller konfirmatoriske test Hvornår nødvendigt (dvs., juridiske eller medicinsk sammenhæng). Dette skyldes meget højere investeringer og driftsomkostninger samt komplikationer med dataanalyse ved sammenligning prøver analyseret på tværs af flere instrumentale platforme inden for et akkrediteret laboratorium. Som følge heraf er immunassays stadig den primære metode til rutinemæssig stof screening på trods af at være udsat for falske-positiver og falske negativer blandt mange narkotika klasser, med begrænset adgang til antistof reagenser til nye designerstoffer. Tidligere undersøgelser har vist, at multipleksede separationer baseret på MSI-CE-MS tilbyder en enkel løsning for at forbedre prøve overførselshastighed op til én størrelsesorden. Derudover tillader denne tilgang til design af nye data arbejdsprocesser for biomarkør opdagelse med høj data troskab baseret på gennemførelsen af effektive batch korrektion og kvalitetskontrol12,13,14. Men indførelsen af 10 eller flere serielle hydrodynamiske injektioner i MSI-CE-MS forkorter den effektive kapillær længde påkrævet for at vedligeholde højeffektiv separationer, som kan kompromittere selektivitet, når du analyserer DoA og deres metabolitter i human urin.
Heri, indførte vi en elektrokinetiske indsprøjtning af BGE efter hver injektion af hydrodynamiske prøven, således at adskillelsen drager fordel af den fulde kapillær længde (120 cm), dermed forbedre løsningen af vigtige stof isobarer/isomerer, når du bruger Full scan dataopsamling ved TOF-MS (figur 1A). I forhold til en nylig rapport14opnås bedre opløsning for flere vigtige Isobar/isomer DoA og deres metabolitter, som er kritiske, når screening for store stof paneler. For eksempel, blev løsning af flere vigtige strukturelle/funktionelle gruppe isomerer realiseret, herunder tre analoge opioid narkotika/metabolitter (figur 1B), to ikke-forretningsmæssigt forbundne opioid isobarer (figur 1 c), og to methamfetamin positionelle isomerer (fig. 1 d). I alle tilfælde er prøve fremførsel fra seriel injektion af forskellige kalibratoren løsninger inden for det samme køre ikke væsentlig som bekræftet af en negativ urin kontrol/blank. Desuden, forbedret opløsning er også indså for flere cross-interferenser involverer visse d-ISs med Isobar narkotika i panelet, som cotinine-d3 og 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EUDP-d3 og imipramin, norfentanyl-d5 og ketamin, Kodein-d6 og sertralin, og kokain-d3 og zolpidem. Dette resultat er udvidet til andre Isobar interferenser inden for panelet stof, der var bedre løses i denne undersøgelse (f.eks.noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/methylphenidat), samt største baggrund urin interferenser (f.eks. , i-source fragment ioner af kreatinin med amfetamin)14. Adgang til to ortogonale parametre til at tilfredsstille den formodede identifikation af et bestemt DoA er faktisk afgørende for at reducere falsk-positive på grund af Isobar interferenser, nemlig nøjagtig masse kombineret med comigration med d-ISs. Også, påvisning af en eller flere biotransformed metabolitter af det overordnede stof inden for den samme prøve, såsom hydroxyleret, demethylated eller intakt glucuronid stof conjugate(s), tilføjer yderligere tillid mod narkotika identifikation under udvidelse af vinduet for registrering.
De anbefalede cut-off niveauer for urin stof screening varierer meget for forskellige klasser af DoA (spænder fra 50 til 1,000 ng/mL) afhængigt af deres farmakokinetik, toksicitet og baggrunden interferenser, for at reducere metode bias baseret på retningslinjerne fra Substance Abuse og mentale sundhed Services Administration (SAMHSA)14. Potentialet for MSI-CE-MS til at opdage og identificere forskellige klasser af DoA direkte i urinen med minimal prøve forbehandling blev anvendt til en gruppe af klinisk deprimeret patienter med en kendt recept post. Den endelige identifikation af metadon (ordineret), amfetamin (nonprescribed/ulovlig), Venlafaxin (ordineret) og pregabalin (ordineret) i fortyndet, men nonhydrolyzed, urinprøver blev demonstreret ved brug af MSI-CE-MS. Dette var baseret på en direkte sammenligning af et stof, der er registreret i en bestemt injektion position i forhold til 84-drug blandingen blev indført i den første prøve position på den anbefalede cut-off screeningsniveau, der tjener som en intern reference/QC og positiv kontrol (Figur 2). Også, absolut drug kvantificering er muligt ved hjælp af eksterne kalibreringskurverne (figur 3) baseret på ion svar forholdet målt for et stof i forhold til sin d-er. I modsætning til de fleste kromatografisk separation, der er ingen deuterium effekt påvirker migration tidsforskelle mellem en d-er og dens nondeuterated drug da de besidder analoge elektroforese mobilitetsophold i gratis løsning i CE. Faktisk er funktionen migration af DoA præcist modelleret i CE, baseret på deres grundlæggende fysisk-kemiske egenskaber/kemiske struktur, nemlig molekylære volumen og effektiv opladning (pKen)14. Da mange lægemidler også undergår betydelig sekundære metabolisme før udskillelse i urinen (fxmorfin glucuronid), screening cut-off niveauer kræver justering som deres målte koncentrationer er lavere end forventet i forhold til metoder, der udnytter enzym hydrolyse til samlede stof afsløring. En stor fordel ved “fortynde-og-skyd” urin drug test, ud over at reducere omkostninger og klokkeslæt, prøve håndtering, og en potentiel bias eller batch variationer på grund af ufuldstændige enzym hydrolyse, er, at formodede skærm-positive tilfælde bekræftes yderligere af den påvisning af en eller flere relaterede drug metabolitter inden for samme prøve. Dette har også giver dybere indsigt i stof farmakokinetik og optimal dosering krav for enkelte patienter samtidig forbedre påvisning for “hurtig” metabolizers eller ordineret/ulovlige stoffer med korte halveringstider. Derudover comigration med en matchende d-spiller to vigtige funktioner for pålidelige stof screening når bruger MSI-CE-MS — nemlig, den identificerer nøjagtige prøve injektion position (dvs., patienten #) mens også korrigere for forskelle i ion svar/injektionsvolumener for forbedret præcision og nøjagtighed.
Fremtidige arbejde har til formål at udvikle tilpassede softwareværktøjer til at lette edb multipleksede separationer koblet til HRMS som krævet for store mængder urin drug test med QC/QA. Streng validering af MSI-CE-MS til DoA bredspektret screening vil også blive undersøgt blandt en større kohorte af højrisiko patienter for at objektivt evaluere foreskrevne medicin overholdelse og potentielle misbrug/substitution, kan kompromittere behandling effektivitet, patientsikkerhed, og/eller psykiatrisk vurdering/diagnose. En supplerende analyse af sure/anioniske klasser af DoA og deres metabolitter skal også udføres af MSI-CE-MS betingelser basisk med negativ ion mode opdagelse som krævet for den omfattende screening af naturlige/syntetiske cannabinoider. Dette er vigtigt i betragtning de truende offentlige sundhedsmæssige konsekvenser af legalisering af rekreative marihuana på tværs af Canada og flere amerikanske stater. En stor fordel af full scan datafangst af TOF-MS er, at retrospektiv analyse af prøver kan udføres, selv når urinprøver fra er ikke længere tilgængelig for opfølgende test, mens andre livsstil eller kosten engagementer kan vurderes bedre forstå differentieret svar til medicinsk behandling. I Resumé giver en hurtig endnu præcis drug overvågning metode af MSI-CE-MS betydelige fordele ved at konventionelle målrettede immunassays, såvel som direkte infusion/omgivende ionisering-MS/MS metoder, der er udsat for interferens/bias, når der udvidet paneler af DoA og deres metabolitter i komplekse biologiske prøver på meromkostninger.
The authors have nothing to disclose.
P.B.M. ønsker at anerkende finansieringen støtte fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada, Canada Foundation for Innovation, genom Canada og McMaster University. Forfatterne takke Howard Lee hos Seroclinix Corporation og Dr. Marcus Kim fra Agilent Technologies for deres indsigtsfulde drøftelser. Derudover, anerkender forfatterne Dr. Zainab Samaan fra Institut for psykiatri og adfærdsmæssige Sciences ved McMaster University og stemninger sygdom klinik på St. Joseph’s Hospital for at få adgang til de deidentified patient urinprøver anvendes i denne undersøgelse .
7100 Capillary Electrophoresis System | Agilent Technologies Inc. | G7100A | CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation |
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer | Agilent Technologies Inc. | G6230B | HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation |
CE-ESI-MS Sprayer Kit | Agilent Technologies Inc. | G1603A | CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette |
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser | Agilent Technologies Inc. | G1310B | Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant |
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01) | Agilent Technologies Inc. | — | Software used for control of CE-MS system |
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01) | Agilent Technologies Inc. | — | Software used for processing of CE-MS data |
Shortix Capillary Cutter | Agilent Technologies Inc. | 5813-4620 | Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries |
Capillary Window Maker | Microsolv Inc. | 07200-S | Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary |
Flexible Fused-silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies Inc. | TSP05375 | Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD) |
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE) | Cerilliant Inc. | Miscellaneous | Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine) |