Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

Summary

Aquí describimos un método de alto rendimiento para farmacovigilancia integral que permite mejorar la resolución y detección de paneles grandes de drogas de abuso y sus metabolitos, con control de calidad basado en siguientes inyección capilar electroforesis-espectrometría de masas.

Abstract

Nuevos métodos analíticos se necesitan urgentemente para permitir la proyección de drogas de alto rendimiento, pero completa, dada una alarmante crisis de drogas opioides y prescripción en la salud pública. Pruebas de drogas de orina convencional basado en una pantalla de dos niveles inmunoensayo seguida por un tándem de cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS/MS) o método de líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) son caros y propensos al sesgo estando limitado a paneles específicos de drogas conocidos de abuso (DoA). En este documento, describiremos un método mejorado para la vigilancia de la droga que permite la resolución y la detección de un panel ampliado de DoA y sus metabolitos cuando se utiliza la siguientes inyección capilar electroforesis-espectrometría de masas (CE-MSI-MS). Multiplexado de separaciones de diez muestras de orina con un control de calidad CE (< 3 min/muestra) en conjunto con adquisición de datos full-scan con un tiempo de vuelo espectrómetro de masas (TOF-MS) con detección de iones positivos modo permite la identificación y cuantificación de DoA por encima de niveles recomendados de corte. Una excelente resolución de isómeros de drogas e isobaras, incluyendo interferencias de fondo, se logran cuando se utiliza CE-MSI-MS con un espaciador electrocinético entre segmentos de la muestra, donde precisa molecular/masa fórmula junto con la comigration de un juego deuterados estándar interno y la detección de uno o más metabolitos bio-transformados facilitan la identificación de DoA sobre una ventana de detección más amplia. Además, las muestras de orina pueden ser analizadas directamente sin deconjugation de enzima para el cribado rápido sin workup muestra complicada. CE-MSI-MS permite la vigilancia de un amplio espectro de DoA que se requiere para el seguimiento del tratamiento de pacientes de alto riesgo, incluyendo confirmando adherencia del fármaco prescrito, revelando el uso de drogas ilícitas/sustitución y evaluar regímenes de dosis óptima como sea necesario para nuevos avances en medicina de precisión.

Introduction

Un alarmante aumento en el mal uso de y la adicción a opiáceos para el tratamiento del dolor crónico representa una creciente amenaza para la salud pública, con más de 70.000 muertes por sobredosis de drogas en los Estados Unidos estimada en 2017¹. Asimismo, varios otros medicamentos psicotrópicos también se prescriben a niños y jóvenes adultos para el tratamiento de la ansiedad, depresión y problemas de salud mental². Como droga de la orina prueba métodos, ampliamente desarrollados para el trabajo y la toxicología forense, resulta de vital importancia para el monitoreo terapéutico de los medicamentos prescritos que son propensos a la tolerancia y la dependencia^3,4. Esto es necesario para asegurar la adherencia óptima eficacia terapéutica y seguridad de los pacientes, al tiempo que revela la sustitución potencial, incluyendo el uso indebido de drogas ilícitas o autotratamiento. En la actualidad, pruebas de drogas de orina para el DoA dependen de un enfoque de dos niveles, consta de una pantalla de inmunoanálisis competitivo inicial a través de dispositivos de punto de atención o analizadores de laboratorio, seguido de una prueba confirmatoria con mayor especificidad basado en GC-MS/MS y, cada vez más, LC-MS/MS de⁵. Sin embargo, inmunoensayos son propensos al sesgo, como reactivos de anticuerpos enlazar un varias clases de fármacos para generar un resultado positivo pantalla presunto, que impide una confiable identificación y cuantificación de drogas específicas o drogas complejas mezclas⁶. En este contexto, precisas pruebas de drogas en orina se necesitan con urgencia dados los exorbitantes costos de policonsumo integral pantallas,⁷ incluyendo drogas de diseño y productos de orina sintética que escapan convencional dirigido ensayos.

Separaciones de alta eficiencia en conjunción con la MS alta resolución (HRMS) utilizando analizadores de masas TOF o orbitrap han sido propuestos como una estrategia descartando para la vigilancia de drogas en una época de polifarmacia y ampliar paneles de DoA^8,9 . Sin embargo, separaciones LC convencionales son lenta (> 15 min) debido a los tiempos de elución mucho para la resolución de químicamente diversas clases de DoA y sus metabolitos mediante programas de gradiente de elución, que limita el rendimiento de la muestra para el cribado rutinario de drogas. Como alternativa, métodos de análisis directo basan en la desorción de ionización (DESI)¹⁰ y láser diodo desorción térmica (LDTD) permiten detección sin separación¹¹de drogas más rápido. Sin embargo, estos métodos de ionización ambiental son propensos a interferencias isobárico/isomérica al analizar a las muestras de orina compleja, por lo que requiere las pruebas de confirmación independiente.

Nuestro laboratorio ha desarrollado una plataforma de separación multiplexados para aumentar el rendimiento de la muestra manteniendo la fidelidad de resolución y los datos de una separación de alta eficiencia basada en MSI-CE-MS¹². Flujos de trabajo de datos de novela pueden ser diseñados en CE-MSI-MS para el metabolito descartando perfiles (es decir, metabolómica) de hay de volumen limitado, que permite controles de calidad (QC) para la corrección de lote requerido para población estudios¹³. En este caso, separaciones se realizan utilizando un búfer isocrática con ionización del soluto que solvente condiciones de estado estacionario cuando use una interfaz líquido vaina convencional, que permite la serie inyecciones de 10 o más muestras en una sola duración de la proyección rápida y selectiva de diversas clases de DoA y sus metabolitos¹⁴. El foco de este estudio es validar más CE-MSI-MS para el análisis directo de muestras de orina auténtica de una cohorte representativa de pacientes clínicamente deprimidos utilizando un método de "diluir-y-disparar" que evita la necesidad de enzima hidrólisis¹⁵. Además, se realizó la aplicación de un espaciador electrocinética entre conectores serial muestra en CE-MSI-MS¹⁶ para más lejos mejorar la resolución de varios isómeros de drogas/isobaras, interferencias urinarias, de fondo o Cruz-interferencias proyección paneles grandes de DoA. La cuantificación absoluta de DoA en muestras de orina cuando usando emparejar deuterados estándares internos (d-es) se demuestra cuando uso MSI-CE-MS. Este enfoque también facilita la identificación de drogas, así como deducir la posición correcta de la muestra de casos con pantalla positiva en comparación con una mezcla de panel de drogas en los recomendados selección nivel de corte que funciona también como una referencia/control de calidad interno dentro de la misma prueba.

Protocol

Las muestras de orina ciego fueron amablemente proporcionadas por Dr. Zainab Samaan de la clínica de trastorno estado de ánimo en el Hospital de San José (Hamilton, ON, Canadá), cuyo estudio fue aprobado por la Junta de ética de investigación integrada de Hamilton.

1. los reactivos y preparación de soluciones de la muestra

1. Preparación de electrolito de fondo
   1. Preparar 50 mL de fondo electrolito (BGE) quincenal, 1 M el ácido fórmico, pH 1.8, con 15% v/v acetonitrilo como un modificador orgánico.
   2. Alícuota 1,9 mL de concentrado ácido fórmico stock (26,5 M) en un matraz aforado de 50 mL y agregar 7,5 mL de acetonitrilo y 40,6 mL de agua desionizada para llevar el volumen a 50 mL. Luego someter a ultrasonidos la solución durante 15 minutos y transferir a un frasco esterilizado con cierre apretado.
2. Preparación líquida de vaina
   1. Preparar 200 mL de vaina líquido semanal, que comprende el 0,1% de ácido fórmico en 60: 40 (MeOH:H₂O).
   2. Alícuotas de 200 μL de ácido fórmico (acción de 26,5 M) en un frasco que contenga 120 mL de MeOH y 80 mL de H₂O líquido de la envoltura y desgasifica durante 15 minutos.
   3. A continuación, añadir 10 μl de cada uno de los siguientes iones de referencia, purina y hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (CV-921), en el líquido de la envoltura para proporcionar señales de masa constante m/z 121.05087 y m/z 922.00979, respectivamente.
      Nota: Los iones de referencia permiten corrección masiva en tiempo real y también monitorear por posibles efectos de supresión o aumento de ion inducida por la matriz durante la separación.
3. Preparación estándar
   1. Preparar una solución estándar que contiene una mezcla de drogas 84 panel 3 x corte de proyección clínica nivel (L6)¹⁴ en 1 mL de metanol, utilizando los estándares de drogas comprados de un proveedor de productos químicos. Por separado preparar una mezcla de 48 juego estándar de drogas interno deuterados (d-ISs) en una 10 veces mayor concentración de la mezcla de drogas 84 en 1 mL de metanol. Además, prepare una solución que contenía 200 μm 4-fluoro -L-fenilalanina (F-Phe) y 3-cloro -L-tirosina (Tyr-Cl) en 1 mL de desionizada H₂O.
   2. Realizar una dilución quíntuplo de la mencionada mezcla 84-drogas (20 μl) y la d 48-EEI (20 μl), así como la dilución décuplo de 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 μl) y 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 μl) en una matriz de orina sintética certificada (40 μL) para hacer un total volumen de 100 μL en un tubo de centrífuga de 250 μl.
4. Preparación de curva de calibración externa
   1. Preparar curvas de calibración externa de cinco puntos (como se describe a continuación) por cuadruplicado (n = 4) sobre un rango dinámico 20-fold con la mezcla estándar de 84-drogas y 48 de sus correspondientes d-ISs en paso 1.3.1. Por ejemplo, para hacer una curva de calibración externa de cinco puntos, asegúrese de diluir la mezcla de drogas 84 (L6, paso 1.3.1) para 2, 4, 10, 20 y 40-fold, considerando que es necesario preparar una dilución quíntuplo de emparejar d-ISs (20 μl) y una dilución décuplo de (4-F-Phe 10 μl) y Cl-Tyr (10 μl) como un adicional en una matriz de orina sintética para hacer un volumen total de 100 μl. En ocasiones cuando un juego d-es no está disponible para un medicamento específico, uso 4-F-Phe como sustituto es para normalización de datos.
      Nota: Evitar la inclusión de d-ISs más que interferir Cruz (isobárico) con otras DoA en el panel si no se resuelven completamente por la separación de la CE.
5. Preparación de la muestra de orina
   1. Descongelar las muestras de orina de la mañana deidentified de una cohorte representativa de diez pacientes clínicamente deprimidos con una historia de drogas de receta conocida. Almacenar las muestras de orina a-80 ° C después de la recolección hasta que tienen que ser descongelados para el análisis.
      Nota: Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación de orina o un retraso almacenamiento a temperatura ambiente después de la colección debido a su efecto sobre la estabilidad química de ciertos metabolitos de DoA y sus conjugados.
   2. Vórtice de la orina de la mañana deidentified muestras de 30 s y, luego, los centrifugue durante 1 min a 14.000 x g por sedimentación. Después de eso, alícuotas de 10 μl de los mencionados procesados orina, 10 μl de d-es y 5 μl de F-Phe/Cl-Tyr y 25 μl de H₂O desionizada y de vortex durante 1 minuto (Repita estos pasos por triplicado para evaluar la precisión técnica). Transferir una alícuota de 20 μl de la mezcla descrita arriba a un frasco de polipropileno para el análisis.

2. configuración del sistema CE-TOF-MS

1. Capilar de sílice fundida parámetros de acondicionamiento
   1. Asegúrese de que todas las normas, curvas de calibración externa y las muestras de orina en las secciones 1.3-1.5 se separan con un capilar de poliamida recubierto sílices tubular abierto sin recubrimiento de 50 μm, un diámetro externo de 360 μm, de diámetro interior y una longitud total del tubo capilar de 135 cm.
      Nota: Se utiliza una herramienta de corte de diamante para capilares coherentes que además son inspeccionados para asegurar un corte suave y al ras.
   2. Quitar unos 7 mm de la capa de poliimida de los distales capilares extremos, utilizando un fabricante de ventana capilar para reducir el remanente de la muestra y evitar potenciales polyimide inflamación en contacto con el solvente orgánico.
   3. Asegúrese de que sobresalga unos 2 mm de la salida del capilar de la aguja pulverizador de CE e instalar la entrada capilar en el cartucho de CE pasando dos vueltas de 360 °. Luego, cuidadosamente Instale el cartucho de la CE en la CE y coloque el pulverizador CE fuera la fuente de iones al acondicionamiento del tubo capilar.
      Nota: Corte la salida capilar constantemente ya que es crucial para garantizar un estable electrospray actual cuando acoplado a MS. Dos rociadores diferentes fueron utilizados en este trabajo: un pulverizador de CE se utilizó para el análisis de la muestra, y un rociador de LC fue utilizado para la calibración de masas.
   4. Asegúrese de realizar el capilar acondicionado con el rociador de CE no colocar en la fuente de iones. Ponga el pulverizador de LC en la fuente de iones.
      Nota: Esto permite calibración de masas evitando cualquier contaminación de la interfaz líquida de vaina coaxial que posteriormente se acopla al TOF-MS.
   5. Condición de nuevos capilares mediante la selección de la función ras (940 mbar) en el software del proveedor para el instrumento de control y la duración de la descarga en 30 minutos cada uno para cuatro diferentes solventes en el siguiente orden: metanol, 1 M de NaOH, desionizada agua y BGE. Asegúrese de poner la bomba isocrática en espera durante el período de acondicionamiento capilar.
   6. Limpie el rociador de CE-MS con un trapo de tejido empapado en MeOH/H₂O para quitar eventuales depósitos de sal residual.
   7. Realizar el mantenimiento preventivo diario del sistema CE-MS antes de analizar las muestras. Use metanol para limpiar electrodo de CE (en la entrada) pero uso un isopropanol y agua (50: 50) mezcla para limpiar la interfaz CE-MS, que es importante evitar la acumulación de sal y limitar el potencial remanente de la muestra.
   8. Retirar el rociador de LC de la fuente de iones y el rociador limpio con un capilar recién acondicionado en el interfaz líquido vaina coaxial para CE-MS.
   9. Encienda la bomba isocrática y aplique una tensión de 30 kV durante 15 minutos para lograr un perfil actual de CE estable antes de los análisis de orina.
2. Condiciones de inyección y la separación con CE
   1. Abra el software de proveedor utilizado para controlar el instrumento para establecer los parámetros de la CE y seleccionar el preacondicionamiento paso. Establecer función rasante a 600 s y especificar una posición de vial BGE.
      Nota: Puede necesitar un enfriador de agua para conectarse a sistemas de CE que carecen de bandeja muestra enfriamiento características, como esto es necesario para evitar la evaporación de la muestra cuando se analizan grandes lotes de muestras de volumen limitado.
   2. La función de inyección para inyectar hidrodinámico las muestras a 100 mbar 5 s e inyectar electrokinetically separadores BGE en 30 kV de 75 s.
      Nota: Este proceso se repite con cada inyección de la muestra (desde una posición diferente frasco) seguido de un separador BGE (desde la misma posición de vial) que realiza automáticamente dentro de un programa de método en el software para un total de 11 muestras discretas en el mismo plazo cuando se utiliza un formato MSI. Análisis de 10 muestras de orina en forma aleatoria después de una mezcla de drogas 84-panel en la corte de investigación nivel se inyecta como la primera posición de la muestra para cada serie de MSI-CE-MS.
   3. Establecer la aplica tensión a 30 kV, la temperatura del cartucho a 25 ° C y el tiempo total de ejecución a ser 40 minutos utilizando el calendario, se aplica un gradiente de presión de 2 mbar/min desde 0 min a 40 min durante la separación.
      Nota: Se aplica una presión gradiente durante la separación para permitir la elución de fármacos migración lenta, que incluye algunas benzodiazepinas débil, básicas y neutro/ácido fármacos (p. ej., paracetamol, barbitúricos). Sin embargo, DoA elementales y sus metabolitos migran como cationes dentro de 25 minutos, incluyendo las anfetaminas, opiáceos y otras clases de alcaloides.
   4. Una vez finalizada la adquisición de la muestra, asegúrese de enjuagar el tubo capilar a una presión baja (50 mbar) con BGE hasta el día siguiente. De lo contrario, enjuague capilar para 600 s a alta presión (900 mbar) con agua y luego para 600 s con aire y almacenarlo en un soporte de rociador hasta su próximo uso.
3. Bomba isocrática y líquido de la envoltura
   1. Utilice una bomba isocrática de infinito y un infinito desgasificador para entregar el líquido de la envoltura (60: 40 MeOH:H₂O con el ácido fórmico 0.1% v/v) a una velocidad de 10 μl/min para el rociador de CE-MS.
4. Configuración de TOF-MS
   1. Asegurar que un TOF-MS, con una fuente de ion electrospray coaxial de vaina-líquido y nitrógeno caliente, está equipado con una unidad de CE.
   2. Operar el TOF-MS bajo en la detección de iones positivos que atravesó una masa de m/z 50-1.700, con un índice de adquisición de datos de 500 ms y del espectro. Asegúrese de que el perfil y el centroide de los datos se almacenan en un formato de archivo ".d".
   3. Establecer las condiciones de ionización electrospray : voltaje Vcap y boquilla a 2.000 V, gas nebulizador a 10 psi y el gas de secado entregan a 8 L/min a 300 ° C, con un flujo de gas de la envoltura de 3,5 L/min a 195 ° C. Además, configurar los ajustes del voltaje del MS de la fragmentor, skimmer y Oct1 RF en 750 V, 120 y 65 respectivamente.
      Nota: Voltaje Vcap y la boquilla, así como gas nebulizador fueron dados vuelta apagado durante la secuencia de inyección de muestra serial utilizada en CE-MSI-MS, pero el electrospray se programó para ser vuelto en 1 min después de la iniciación de la separación electroforética para evitar que la corriente errores por efectos de succión.
   4. Realizar el instrumento control y adquisición de datos utilizando el software del vendedor (Tabla de materiales).
5. Análisis de datos
   1. Analizar los datos de CE-MSI-MS utilizando el software del proveedor, incluyendo procesamiento, datos de alisado y la integración de electropherograms iones extraídos (Seii) para representante DoA y sus metabolitos.
   2. Abra el software y configure los siguientes parámetros.
      1. En los cromatogramas, seleccione el formato de extracción de datosy formato de datos espectrales cromatograma y la masa a modo de perfil .
      2. Seleccione Cuadrática/cúbica Savitzky Golay en la función de suavizado y la anchura de la función a 15 puntos.
      3. A continuación, haga clic en Integrar (MS), establecer el integrador ser ágily seleccione el número máximo de límite de picos a la 11 más grande debajo de filtros de pico.
      4. Haga clic en Ver, haga clic en lista de máxima integracióny seleccione el número de pico, tiempo de retención (RT), área de pico, alturay relación señal a ruido (SNR).
      5. Guardar estos parámetros bajo un nombre de método único. Aplicar este método al proceso e interpretar cada conjunto de datos.
         Nota: Una tabla resumen con el número máximo, el RT, el área de pico y altura y el SNR muestra a la derecha. Realizar la normalización de datos para RT medido y área de pico integrado para cada DoA a o emparejar d-es o (si no está disponible) a F-Phe para mejorar la precisión analítica.

3. Análisis de las muestras de orina y curvas de calibración externa

1. Configuraciones diferentes de inyección serie utilizadas en CE-MSI-MS
   1. Para la primera configuración de inyección muestra serial, utilizada para demostrar la resolución de isómero/isobara de drogas (figura 1A), asegúrese de que cinco repetido las inyecciones se realizan con una mezcla de estándares de drogas 84 d-es y 4-F-Phe/Cl-Tyr, seguido de un sexto inyección, que es una muestra en blanco en la orina sintética, y cinco inyecciones adicionales de la mezcla de drogas estándar.
   2. Para la configuración de inyección muestra serie segunda, utilizada para demostrar la detección de DoA en muestras individuales de orina de pacientes con una receta conocida (figura 2A), asegúrese de que la primera toma de muestra es una mezcla de mezcla estándar 84-drogas en un 1 x nivel de proyección de corte (control positivo) seguido de una inyección al azar 10 diluido de muestras de orina de pacientes: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, 183 # y #50.
   3. Para la configuración de inyección de muestra serie tercera, para ilustrar la adquisición de las curvas de calibración externa en una única prueba, garantizar que el calibrant soluciones para DoA son sobre un rango dinámico lineal de 20-fold correspondiente a 0.25 x 0,5 x 1 x, 2.5 x, y 5 x niveles de concentración de la corte, junto con emparejar d-IS y F-Phe/Cl-Tyr como adicional es en una matriz de orina sintética (n = 4).

Representative Results

CE-MSI-MS permite la inyección serie de diez o más muestras discretas dentro de una única prueba, que mejora considerablemente el rendimiento (< 3 min/muestra) sin modificaciones instrumentales complicados, programas de cambio de columna o infraestructura costosa Inversiones (figura 1A). Una serie alternante de inyecciones hidrodinámicas de la muestra y electrocinética espaciador de BGE se realiza dentro de un capilar de sílice fundida sin modificar, donde separación electroforética zonal de iones se producen bajo condiciones de electrolito fuertemente ácido (pH 1.8). ionización del soluto también se produce bajo condiciones de estado estacionario. En este caso un líquido vaina coaxial, con una masa calibrant, se utiliza como una interfaz para CE-MS en la detección de modo de iones positivos con ion mínima supresión o mejora efectos controlados por la señal de los iones de masa calibrant. TOF representa un HRMS robusto y rentable con una adquisición rápida de datos ideal para las aplicaciones de vigilancia de drogas investigación descartando al usar CE-MSI-MS. Por ejemplo, resolución impresionante se consigue varios isobárico/isomérica DoA y sus metabolitos, incluyendo los isómeros estructurales de tres isómeros estructurales opioides, es decir, norhydrocodone, hidromorfona y la morfina (figura 1B). En este caso, 30 resolver picos de 10 muestras independientes de una mezcla de drogas son detectadas sin remanente de la muestra. Un control de orina en blanco/negativo de orina sintética también se incluye dentro de la serie serie de inyección (posición #6 de la muestra). Además, son completamente resueltas como 20 diferentes picos con adquisición de datos full-scan (dos otros opiáceos isobáricos, es decir, 6-acetylmorphine (un metabolito inactivo de la heroína) y naloxona (un antagonista de receptores opioides utilizado para el tratamiento de sobredosis de opiáceos) Figura 1). Del mismo modo, dos isómeros posicionales de anfetamina se resuelven completamente en CE-MSI-MS para distinguir el abuso de la metanfetamina ilegal el potencial mal uso de la fentermina, un estimulante prescrito que se usa como un supresor del apetito para bajar de peso.

Figura 1: una serie de iones extraídos electropherograms (EIE) para representante DoA isómeros/isobaras que son resueltos por CE-MSI-MS mediante el análisis de diez muestras y un espacio en blanco dentro de una única prueba. (A) esquema de MSI-CE-MS que representa la configuración de inyección serie utilizada para un panel de 84-DoA en la orina sintética. Este método de separación multiplexado utiliza una serie alterna de inyecciones hidrodinámicas de 11 muestras discretas y en blanco con una inyección electrocinética de un búfer para iniciar la separación electroforética zonal de iones, seguido de un completo análisis de datos adquisición por TOF-MS con la detección de modo de ion positivo. (B) tres isómeros opiáceos de grupo funcional isobárico (m/z 286.1438), separadas por la CE, que comprende 30 resolver picos de 10 inyecciones de muestras discretas, incluyendo norhydrocodone, hidromorfona y morfina. (C) dos isobáricos opiáceos y sus metabolitos (m/z 328.1543), separadas por la CE, que comprende 20 resolver picos de 10 inyecciones de muestras discretas, incluyendo 6-acetylmorphine (metabolito de la heroína) y naloxona. (D) dos isobárico grupo funcional isómeros para anfetamina, separados por la CE, que comprende 20 resolver picos de 10 inyecciones de muestras discretas, incluyendo metanfetamina y fentermina. En todos los casos, orina negativa controles/espacios en blanco en la sexta posición de la muestra en CE-MSI-MS tenían evidencia insignificante del remanente de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para pantalla de DoA, una configuración de inyección serie en CE-MSI-MS utiliza una mezcla de drogas 84 panel en el recomendado niveles de concentración límite de detección (como la primera posición de inyección para todas las ejecuciones) seguido de un análisis al azar de orina representativas 10 muestras de pacientes clínicamente deprimidos con una historia conocida receta. Por ejemplo, una proyección positiva resultado de metadona de la prueba (m/z 310.2165) de paciente #208 (figura 2A) es deducido por una detección de un pico de señal grande (originario de inyección #9) que coemigra con metadona-d3 con un bajo error en masa (< 5 ppm). Ningún otro tipo de señales se detecta en otras muestras de orina en el mismo funcionamiento. Concentración de metadona 13 x el límite de corte recomendada es superior al comparar su ratio de respuesta del ion medido en la muestra (inyección #9) con la referencia droga mezcla/control de calidad (inyección #1) y corregido por un factor de dilución de orina cuádruple. Por lo tanto, este resultado confirma la adhesión del paciente a la terapia de mantenimiento con metadona. Pruebas de consumo de anfetaminas han (figura 2B) se muestran por niveles elevados de la anfetamina (m/z 136.1121) que sólo fue detectado en un paciente (#50, en inyección #11) dentro de la carrera de CE-MSI-MS. La concentración medida supera ligeramente los niveles de corte recomendada (1.3 x). Esto coemigra con anfetamina-d5 y tenía un error de masa baja con un fósforo Fórmula molecular mejor clasificado. Un resultado positivo para el antidepresivo venlafaxina (m/z 278.2115), un inhibidor de la recaptación selectiva de serotonina-norepinefrina, es también demostrado en paciente #281 (inyección #6). En este caso, la concentración excede los niveles de corte recomendada (15 x), esto se identifica por su exacta masa - o fórmula molecular-match, junto con venlafaxine comigrating-d6 (figura 2). El último criterio no se cumple para una isobara desconocido que también se detecta dentro de la traza de la EIE, que destaca la necesidad de precaución cuando depende exclusivamente de su masa exacta. También, una detección definitiva de prescrito pregabalina, que es prescrita para el tratamiento del dolor neuropático, así como de la generalizada ansiedad también demostrada para paciente #309, es basada en su concentración muy elevada (x 64) por encima de lo recomendado niveles de corte (Figura 2D). Sin embargo, no se detecta en los nueve otros ejecutan muestras de orina de pacientes analizadas dentro de la misma. Similar a los otros casos positivos de la pantalla, inyección #4, coemigra con pregabalina-d6, que está incluido en todas las muestras de orina analizadas por CE-MSI-MS.

Figura 2: una serie de iones extraídos electropherograms (EIE) para representante de pantalla-positivo de orina drogas resultados de una cohorte de 10 pacientes clínicamente deprimidos como confirmado cuando recomienda el uso de MSI-CE-MS, que incluye un panel de 84-drogas en el nivel de corte, inyectada como la primera posición de inyección de muestra, que sirve como referencia interna/control de calidad. (A) EIE recubrimiento correspondiente a metadona-d3, que coemigra con la metadona, destacando esa muestra de orina sólo una (inyección posición #9) ha elevado las concentraciones de metadona superando con creces el nivel de corte. (B) EIE recubrimiento correspondiente a anfetamina-d3, que coemigra con anfetamina, destacando esa muestra de orina sólo una (inyección posición #11) ha elevado las concentraciones por encima de los niveles de corte. (C) EIE recubrimiento correspondiente a venlafaxina-d6, que coemigra con venlafaxina, destacando esa muestra de orina sólo una (inyección posición #6) ha elevado las concentraciones por encima de los niveles de corte. (D) EIE recubrimiento correspondiente a pregabalina-d6, que coemigra con pregabalina, destacando que sólo una muestra de orina (posición #4 de inyección) muy elevado concentraciones superiores a los niveles de corte. Todas las muestras de orina se analizaron directamente después de una dilución por cinco veces en agua desionizada junto con la adición de un juego d-es (si está disponible). Un resultado positivo de la pantalla en CE-MSI-MS corresponde a un medicamento que coemigra con d-ISs con un error de masa baja (< 5 ppm) y la fórmula molecular correcta, cuya concentración excede el límite que se analiza dentro de la misma prueba como referencia interna/control de calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La cuantificación absoluta de DoA y sus metabolitos también se logra por MSI-CE-MS basada en curvas de calibración externa, usando estándares de referencia de calibrant para DoA que se adquieren rápidamente dentro de una única prueba. Por ejemplo, la dilución seriada de una mezcla de drogas 84 calibrant junto con un juego d-está en una concentración fija proporciona un confiable análisis cuantitativo en muestras de orina compleja. Esto compensa la supresión inducida por la matriz de iones potencial o mejora sino por variaciones en el volumen de inyección en el tubo capilar entre las muestras. En ocasiones cuando un juego d-es comercialmente disponibles o prohibitiva para ciertos DoA, un sustituto es se utiliza para la normalización de datos, tales como d-es desde dentro de la misma clase de droga o una orina no se encuentra en compuestos sintética (F-Phe), según lo demostrado previamente ¹⁴. representante EIEs y curvas de calibración externa de oxicodona se muestran en la Figura 3A, B. y citalopram en la figura 3, D. Estos son ampliamente prescritos analgésicos y antidepresivos, respectivamente, con potencial de abuso. Ión relativa respuesta proporciones su juego días-es se miden. En este caso, una configuración de inyección serie en MSI-CE-MS, que comprende cinco drogas diferentes calibradores, se analizan por duplicado dentro de una única prueba junto con una orina sintética en blanco. En general, buena linealidad (R² > 0.990) en una 20-fold concentración gama logró con adecuada sensibilidad para la detección de la mayoría de DoA y sus metabolitos (es decir, alcaloides catiónicos) en el panel de drogas 84 ¹⁴. en todos los casos, se detectan metabolitos de drogas como límites de su ión molecular protonado [MH⁺] encima de su límite de detección (> 50 ng/mL), con la excepción de ciertos fármacos ácido neutro que tienen una eficiencia de ionización pobre bajo la modo de iones positivos, como los cannabinoides (por ejemplo, THC-COOH), barbitúricos (p. ej., secobarbital) y carbamatos (p. ej., carisoprodol).

Figura 3: una serie de iones extraídos electropherograms (EIE) para la cuantificación de los DoA representante. Esto se hace mediante la generación de curvas de calibración externa basadas en su cociente de respuesta relativa de iones con un un juego d-es sobre un rango dinámico lineal 20-fold. (A) duplicar la inyección de una curva de cinco puntos de calibración para calibradores de oxicodona oxicodona-d3 junto con un espacio en blanco. (B) curva de calibración externa de oxicodona, después de la regresión lineal para obtener sensibilidad (pendiente) y linealidad (R²), con barras de error que representa ±1σ (n = 4). (C) duplicar la inyección de una curva de cinco puntos de calibración para calibradores de citalopram, junto con citalopram-d6 y un espacio en blanco. (D) curva de calibración externa de citalopram, después de la regresión lineal para obtener sensibilidad (pendiente) y linealidad (R²), con error barras representando SD ± 1 (n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Separaciones cromatográficas convencionales por lo general dependen de una inyección de la muestra por carrera, que es seguido por una elución gradiente para resolver mezclas complejas drogas y reacondicionamiento de la columna. Estos requisitos fundamentalmente limitan producción de muestras y deber ciclo incluso al usar programas de columna-conmutación óptima. En este contexto, análisis de drogas orina de alto volumen de trabajo, de Toxicología o aplicaciones de monitoreo terapéuticos por GC-MS/MS y, cada vez más, LC-MS/MS son así realizado paralelamente pero utilizado preferentemente como un segundo nivel o confirmación de prueba cuando necesario (es decir, contexto legal o médico). Esto es debido a las mayores inversiones de capital y costos operativos, así como complicaciones con análisis de datos cuando se comparan muestras analizadas a través de múltiples plataformas instrumentales dentro de un laboratorio acreditado. Como resultado, los inmunoensayos siguen siendo el principal método para el cribado rutinario de drogas a pesar de ser propenso a falsos positivos y falsos negativos entre muchas clases de drogas, con acceso limitado a los reactivos de anticuerpos para nuevas drogas de diseño. Estudios anteriores han demostrado que separaciones multiplexados basados en MSI-CE-MS ofrecen una solución simple para mejorar el rendimiento de la muestra hasta un orden de magnitud. Además, este enfoque permite el diseño de flujos de trabajo nuevos datos para el descubrimiento de biomarcadores con fidelidad de datos basado en la aplicación de la corrección por lotes eficaz y control de calidad^12,13,14. Sin embargo, la introducción de 10 o más serie hidrodinámicas inyecciones en CE-MSI-MS acorta la longitud del tubo capilar eficaz necesaria para mantener separaciones de alta eficiencia, que pueden comprometer la selectividad al analizar DoA y sus metabolitos en orina humana.

En este documento, hemos introducido una inyección electrocinética de BGE después de cada inyección hidrodinámica muestra, tal que la separación aprovecha de la longitud del tubo capilar completo (120 cm), lo que mejora la resolución de importantes drogas isobaras/isómeros cuando se utiliza escaneo completo de adquisición de datos por TOF-MS (figura 1A). En comparación con un reciente informe¹⁴, mejor resolución se obtiene para varias importantes isobárico/isomérica DoA y sus metabolitos, que es crítico cuando detección de paneles grandes de la droga. Por ejemplo, la resolución de varios isómeros de grupo funcional estructural importante fue realizada, incluyendo tres análogos opioides medicamentos/metabolitos (figura 1B), dos isobaras opiáceos sin relación (figura 1) y metanfetamina dos isómeros posicionales (figura 1). En todos los casos, no es significativo según lo confirmado por un control de orina negativo/blanco remanente muestra de inyección serie de calibrant diferentes soluciones dentro del mismo funcionamiento. Además, mejorar la resolución también se realiza para varios Cruz-interferencias con ciertos d-ISs con drogas isobáricos en el panel, como cotinina-d3, 3, 4-metilendioxianfetamina (MDA), EDDP-d3 y la imipramina, norfentanyl-d5 y ketamina, codeína-d6 y sertralina y cocaína-d3 y zolpidem. Este resultado se extiende a otras interferencias isobáricos en el panel de drogas que mejor se resolvieron en este estudio (p. ej., noroxycodone/oximorfona, normeperidine/metilfenidato), así como de interferencias urinaria antecedentes principales (p. ej. , en fuente fragmento iones de creatinina con anfetamina)¹⁴. De hecho, acceso a dos parámetros orthogonal para satisfacer la supuesta identificación de un DoA específico es fundamental para reducir falsos positivos debido a interferencias isobáricos, es decir, precisas masa combinados con comigration con d-ISs. Además, la detección de uno o más metabolitos biotransformados de la droga del padre dentro de la misma muestra, como glucurónido hidroxilados, desmetilado o intacto drogas conjugate(s), añade más confianza hacia la identificación de la droga mientras la ventana para la detección.

Los niveles de corte recomendados para la detección de drogas de orina varían para las diferentes clases de DoA (desde 50 a 1.000 ng/mL) según su farmacocinética, toxicidad e interferencias de fondo, con el fin de reducir el sesgo del método basado en las directrices de el abuso de sustancias y Salud Mental (SAMHSA) de la administración¹⁴servicios. El potencial de MSI-CE-MS detectar e identificar las diversas clases de DoA directamente en orina con pretratamiento de muestra mínimo se aplicó a un grupo de pacientes clínicamente deprimidos con un registro de recetas conocidas. La identificación definitiva de la metadona (prescrito), anfetamina (han/ilícito), venlafaxina (prescritos) y pregabalina (prescritos) en muestras de orina diluida, sin embargo, nonhydrolyzed, fue demostrada cuando se usa CE-MSI-MS. Esto se basó en una comparación directa de una droga en una posición de inyección específica respecto a la mezcla de drogas 84 introducida en la primera posición de la muestra en los recomendados selección nivel de corte que sirve como una referencia/control de calidad interno y control positivo (Figura 2). Además, la cuantificación absoluta de la droga es factible utilizando curvas de calibración externa (figura 3) basadas en la relación de respuesta del ion medido para un fármaco con respecto a su d-es. A diferencia de separaciones cromatográficas más, no hay ningún efecto de deuterio que diferencias de tiempo de migración entre una d-es y sus nondeuterated puesto que poseen movilidad electroforética análoga en solución gratuita en CE. De hecho, el comportamiento de la migración de DoA es modelado con precisión en CE, basado en su estructura química propiedades fisicoquímicas fundamentales, a saber, el volumen molecular y carga efectiva (pK_a)¹⁴. Puesto que muchos fármacos sufren también significativo metabolismo secundario antes de la excreción en orina (p. ej., morfina glucurónido), corte de proyección niveles requieren ajuste como sus concentraciones medidos están inferiores al esperado en comparación con métodos que utilizan la hidrólisis enzimática para la detección de droga total. Un beneficio importante de orina "diluir-y-disparar" las pruebas de drogas, además de reducir costos de tiempo, manejo de muestras y un sesgo potencial o variaciones de lote debido a la hidrólisis de la enzima incompleta, es que casos de pantalla positivo presuntivos más son confirmados por el detección de metabolitos de drogas relacionados con uno o más dentro de la misma muestra. Esto también proporciona penetraciones más profundas en drogas farmacocinética y óptimos de dosificación necesaria para los pacientes individuales al tiempo que mejora la detección de otras "rápidos" o medicamentos prescritos/ilícito con una vida media corta. Además, comigration con el emparejar d-juega dos funciones importantes para droga confiable detección cuando usa CE-MSI-MS — es decir, identifica la posición de inyección exacto de la muestra (es decir, paciente #) y también corregir las diferencias en ion volúmenes de inyección respuestas para mejor precisión y exactitud.

Futuro trabajo pretende desarrollar herramientas de software a medida para facilitar el tratamiento automatizado de datos de separaciones multiplexadas junto a HRMS requerido para pruebas con QC/QA de drogas de orina de alto volumen. Validación rigurosa de MSI-CE-MS para la proyección del amplio-espectro de DoA se investigarán también entre una cohorte grande de pacientes de alto riesgo con el fin de evaluar objetivamente prescrito adherencia y potencial uso indebido/substitución de la droga que puede comprometer eficacia del tratamiento, seguridad del paciente y evaluación/diagnóstico psiquiátrico. También, se realizará un análisis complementario de ácidos aniónicos/clases de DoA y sus metabolitos por CE-MSI-MS bajo condiciones alcalinas con ion negativo modo de detección como sea necesario para la proyección global de los cannabinoides naturales y sintético. Esto es importante dadas las implicaciones de salud pública que se avecina de la legalización de la marihuana recreativa a través de Canadá y varios Estados de Estados Unidos. Una ventaja importante de adquisición de datos full-scan por TOF-MS es que el análisis retrospectivo de las muestras se puede realizar incluso cuando las muestras de orina ya no están disponibles para las pruebas de seguimiento, mientras que otros exposición dieta o estilo de vida puede evaluarse mejor comprender las respuestas diferenciales al tratamiento farmacológico. En Resumen, un método de vigilancia de drogas rápida pero precisa por CE-MSI-MS ofrece ventajas significativas para inmunoensayos específicos convencionales, así como la infusión directa, ambiente métodos de ionización-MS/MS que son propensos a interferencias/parcialidad al resolver paneles ampliados de DoA y sus metabolitos en muestras biológicas complejas en costos adicionales.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)