Высок объём и всеобъемлющей наркотиков наблюдения с помощью масс-спектрометрии многосегментные инъекций капиллярного электрофореза

Summary

Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью для наблюдения комплексного препарата, что позволяет для повышения резолюции и обнаружения больших панелей наркотиков злоупотреблений и их метаболитов, с контролем качества на основе многосегментных инъекций капиллярная электрофорез масс-спектрометрии.

Abstract

Новые аналитические методы срочно необходимы для включения высокой пропускной способностью, но всеобъемлющий наркотиков скрининг, учитывая тревожное опиоидной и рецепта наркотиков кризис в области общественного здравоохранения. Обычных наркотиков мочи основанные на экране двухуровневой иммуноанализа следуют газовой хроматографии тандем масс-спектрометрии (ГХ-МС/МС) или методом жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS) являются дорогостоящими и склонны к предвзятости во время ограничивается целевых групп известных наркотиков (ООА). Здесь мы наметим усовершенствованный метод для наркотиков наблюдения, что позволяет резолюции и обнаружения расширенной группы ООА и их метаболитов при использовании многосегментные инъекций капиллярного электрофореза масс-спектрометрии (MSI-CE-MS). Мультиплексированных цветоделение десяти образцов мочи с контролем качества, CE (< 3 мин/образец) в сочетании с приобретением полного сканирования данных с использованием времени прохождения масс-спектрометр (TOF-МС) под положительный ион режим обнаружения позволяет для идентификации и количественная оценка DoA выше рекомендуемых пороговых уровней. Отличное разрешение наркотиков изомеров и изобары, включая фоновой помехи, достигаются при использовании MSI-CE-МС с электрокинетических спейсера между сегментами образца, где Точная масса/Молекулярная формула вместе с comigration о соответствия транс внутренний стандарт и выявления одного или более био трансформированных метаболитов облегчения идентификации DoA над более широкое окно обнаружения. Кроме того образцы мочи могут быть проанализированы непосредственно без фермента Деконъюгация для быстрого скрининга без сложных образцов реакционной. MSI-CE-МС обеспечивает наблюдение за широкий спектр DoA, которая необходима для мониторинга лечения повышенного риска пациентов, включая подтверждение приверженности лекарственное, выявление незаконного использования/замены и оценке оптимальной дозировке режимов При необходимости для новых достижений в медицине точности.

Introduction

Тревожный рост злоупотребления и зависимости от опиоидов для управления хронической боли представляет собой растущую угрозу для общественного здравоохранения, с более чем 70 000 смертей передозировки наркотиков в США, по оценкам в 2017 году¹. Аналогичным образом различные другие психотропные препараты также широко предписанных для детей и молодых людей для лечения тревоги, депрессии и психического здоровья вопросы². В результате мочи наркотиков тестирование методов, широко развита для на рабочем месте и судебно-медицинской токсикологии, имеет жизненно важное значение для терапевтического мониторинга предписанные лекарства, которые склонны к терпимости и зависимость от^3,4. Это необходимо для обеспечения соблюдения, оптимальной терапевтической эффективности и безопасности пациентов, при выявлении потенциальных замещения, включая злоупотребление наркотиками, незаконный или nonprescribed. В настоящее время испытания снадобья мочи для DoA полагаются на двухуровневый подход, состоящий из первоначальных конкурсных иммуноанализа экрана через точки обслуживания устройства или лабораторных анализаторов, следуют подтверждающего теста с большей конкретности, основанный на GC-MS/MS и, все чаще, LC-MS/MS⁵. Однако immunoassays склонны к предвзятости, как антитело реагентов nonspecifically связать различные классы наркотиков для создания предполагаемого экран положительный результат, который предотвращает надежной идентификации и количественной оценки конкретных наркотиков или сложных наркотиков смеси⁶. В этом контексте более точные тесты на наркотики мочи срочно необходимы, учитывая непомерные издержки всеобъемлющего полинаркомании экранов,⁷ , включая дизайнерские наркотики и синтетической мочи продукты, которые ускользают обычных целевых анализов.

Высокой эффективности цветоделения в сочетании с высоким разрешением мс (СУЛР), используя TOF или Орбитрэп массы анализаторы были предложены в качестве неадресных стратегия для наблюдения наркотиков в эпоху полипрагмазии и расширение панелей DoA^8,9 . Однако обычные LC цветоделение, медленно (> 15 мин) из-за длительного элюции раз резолюции химически различных классов ООА и их метаболитов, с использованием градиента элюции программ, которые ограничивает пропускную способность образца для рутинной наркотиков скрининг. Кроме того методы прямого анализа на основе десорбции ионизации (Дези)¹⁰ и лазерный диод термодесорбции (LDTD) позволяют быстрее наркотиков скрининг без разделения¹¹. Однако эти методы окружающего ионизации подвержены Изобарический/изомерных вмешательства при анализе образцов сложных мочи, таким образом требуя подтверждающих независимого тестирования.

Наша лаборатория недавно разработал мультиплексированных разделение платформы для увеличения пропускной способности образца при сохранении верности резолюции и данных высокой эффективности разделения на основе MSI-CE-MS¹². Роман данных рабочих процессов могут быть разработаны в MSI-CE-МС для неадресных метаболит, профилирование (т.е., метаболомики) ограниченный объем biospecimens, тогда как контроля качества (QC) позволяют для коррекции партии, как необходимые для крупномасштабных населения ¹³исследований. В этом случае цветоделение выполняются с использованием Изократические буфер с вещества ионизации, происходящих в условиях устойчивого состояния растворителя при использовании обычных оболочка жидкий интерфейс, который позволяет для последовательных инъекций 10 или более образцов в пределах одной Запуск для быстрого, но селективного отбора различных классов ООА и их метаболитов¹⁴. В центре внимания этого исследования состоит в дальнейшей проверке MSI-CE-МС для прямого анализа подлинных мочи от представителя когорты клинически депрессии больных с использованием метода «разбавлять и стрелять», позволяет избежать необходимости для ферментов гидролиза¹⁵. Кроме того, осуществление электрокинетических спейсера между серийный образец пробки в MSI-CE-MS¹⁶ была выполнена для дальнейшего улучшения разрешения различных изомеров наркотиков/изобары, фон мочевыводящих вмешательства, и/или кросс взаимодействий при отборе большие панели DoA. Абсолютная количественная оценка DoA в образцах мочи при использованием соответствия транс внутренних стандартов (d-это) проявляется при использовании MSI-CE-МС. Этот подход также облегчает идентификацию наркотиков, а также выведение позиции правильный образец экрана положительных случаев, когда по сравнению с смесью группа препарата в рекомендуемых скрининг пороговый уровень, который выполняет также функции внутренней ссылки/КК в рамках же запустить.

Protocol

Ослепленный мочи были любезно предоставленных саман Зайнаб д-р от клиники расстройство настроения в больнице Святого Иосифа (Гамильтон, Онтарио, Канада), чьи исследования был одобрен Советом комплексных этики научных исследований Гамильтон.

1. реагенты и подготовка решений

1. Подготовка электролита фона
   1. Подготовка 50 мл каждые две недели, 1 M муравьиной кислоты фон электролита (BGE), рН 1.8, с 15% v/v Ацетонитрил как органическим модификатором.
   2. Аликвота 1.9 мл сосредоточены складе муравьиной кислоты (26.5 M) в объемных флакон 50 мл и добавить 7,5 мл, ацетонитриле и 40,6 мл деионизованной воды довести объем до 50 мл. Затем sonicate решение для 15 мин и передача его в стерилизованные бутылки с жесткой уплотнения.
2. Оболочка жидким подготовки
   1. Подготовка 200 мл оболочка жидкого раствора еженедельно, состоящий из 0,1% муравьиной кислоты в переработке (MeOH:H₂O).
   2. Аликвота 200 мкл рабочего раствора муравьиной кислоты (26.5 M сток) во флакон, содержащий 120 мл метанола и 80 мл H₂O сделать оболочка жидкости и Дега за 15 мин.
   3. Далее, добавить 10 мкл каждого из следующих ссылок ионов, пуринов и hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), в платье жидкость для обеспечения постоянной массы сигналы на м/z 121.05087 и m/z 922.00979, соответственно.
      Примечание: Эти ссылки ионов позволяют в реальном времени массового коррекции, а также контролировать для потенциальных матрица индуцированной Ион подавление или повышения эффекты во время разделения.
3. Стандартный подготовка
   1. Подготовьте стандартный раствор, содержащий 84-наркотиков группа смеси на 3 x клинического скрининга отсечения уровень¹⁴ (L6) в 1 мл метанола, с использованием стандартов наркотиков приобрели от химического поставщика. Отдельно приготовить смесь из 48 соответствия стандарта (d МКС) Транс внутренних наркотиков в 10 раз выше концентрации чем смесь 84-препарата в 1 мл метанола. Кроме того, подготовить Стоковый раствор, содержащий 200 мкм 4-фтор -L-фенилаланин (F-Phe) и 3-хлоро -L-тирозина (Cl-Tyr) в 1 мл дейонизированной H₂O.
   2. Выполните пятикратный разбавления смеси вышеупомянутых 84-наркотиков (20 мкл) и 48 d МКС (20 мкл), а также десятикратно разрежения 4-fluorophenylalanine (F-Пхе, 10 мкл) и 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 мкл) в матрице сертифицированных синтетической мочи (40 мкл) сделать всего объем 100 мкл в 250 мкл пластиковых пробирок.
4. Подготовка внешней калибровки кривой
   1. Подготовка пяти пунктов внешней калибровочных кривых (как описано ниже) в составленном (n = 4) над кратной динамический диапазон, используя стандартную смесь 84-наркотиков и 48 их соответствующих d-МКС на шаге 1.3.1. Например, для изготовления пяти пунктов внешней калибровочной кривой, обеспечить разбавление 84-наркотиков смеси (L6, шаг 1.3.1) 2-, 4-, 10-, 20-и разницей, то это необходимо подготовить пятикратный разрежения соответствия d МКС (20 мкл) и десятикратный разрежения (4-F-пе 10 мкл) и Cl-Tyr (10 мкл) как дополнительный в матрице синтетической мочи сделать суммарный объем 100 мкл. В тех случаях, когда соответствующий d-IS не доступен для конкретного препарата, использование 4-F-пе как суррогат предназначен для нормализации данных.
      Примечание: Избегайте включения дополнительных d МКС, мешающие кросс (Изобарический) с другими DoA внутри панели, если они не являются полностью урегулированы путем разделения CE.
5. Подготовка проб мочи
   1. Потепление deidentified утром мочи от представителя когорты десяти пациентов клинически депрессии с историей наркотиков известный рецепт. Храните образцы мочи при температуре-80 ° C после сбора до тех пор, пока они должны быть разморожен для анализа.
      Примечание: Избегайте несколько циклов замораживания оттаивания мочи или задержки хранения при комнатной температуре в коллекцию из-за их влияние на химическую стабильность некоторых DoA метаболитов и их метаболитов.
   2. Вихревой deidentified утренней моче образцы для 30 s и, затем, центрифуга их за 1 мин на 14 000 x g для седиментации. После этого, кратные 10 мкл вышеупомянутого обрабатываются мочи, 10 мкл d-и 5 мкл F-Phe/Cl-Tyr и 25 мкл дейонизированной H₂O, и вихревые 1 мин (повторить эти шаги в трех экземплярах для оценки технической точности). 20 мкл Алиготе выше смеси передать полипропиленовые флакон для анализа.

2. Настройка системы CE-TOF-MS

1. Немелованной плавленый кремнезема капиллярные кондиционирования параметры
   1. Убедитесь, что все стандарты, внешняя Калибровка кривых и мочи, подготовленный в разделах 1.3-1.5 отделены с помощью немелованной открытым трубчатые кварцевое капиллярные полиимидно покрытием с внутренним диаметром 50 мкм, наружный диаметр 360 мкм и Общая длина капилляра 135 см.
      Примечание: Алмазный режущий инструмент используется для обеспечения последовательного капилляров, которые инспектируются далее обеспечить скрытой и гладкий срез.
   2. Удалите около 7 мм полиимида покрытия от обоих дистальной части капилляра концы, с использованием капиллярной окна чайник сократить пример переноса и предотвращения потенциальных полиимидные, отеки при контакте с органических растворителей.
   3. Убедитесь, что торчат около 2 мм Капиллярный розетки из иглы распылителя CE и установить капиллярного входе в CE картридж, циклы два поворота 360 °. Затем тщательно установите картридж с CE в CE и место опрыскивателя CE из источника ионов когда кондиционирования капилляра.
      Примечание: Вырежьте капиллярного розетки последовательно как он имеет решающее значение для обеспечения стабильного электроспрей текущей при сочетании с MS. В этой работе использовались два различных форсунок: опрыскивателя CE была использована для анализа проб, и LC опрыскиватель был использован для массового калибровки.
   4. Убедитесь, что для выполнения капилляров, Кондиционер с распылителем CE, не помещенные в источник ионов. Положите LC опрыскивателя в источнике ионов.
      Примечание: Это позволяет для массового калибровки, избегая любого загрязнения коаксиальный оболочка жидкий интерфейс, который связан впоследствии к TOF MS.
   5. Состояние новых капилляров, выбрав скрытой функции (940 мбар) на поставщика программного обеспечения, используемого для управления инструмент и установите продолжительность флеш на 30 мин для четырех различных растворителей в следующем порядке: метанол, 1 M NaOH, деионизированная вода и Булак ДжиИПи Инжиниринг. Убедитесь, что положить Изократические насоса в режиме ожидания в период капиллярного принадлежности.
   6. CE-MS опрыскиватель протрите салфеткой ткани, пропитанной метанола/H₂O для удаления любого остаточного солевых отложений.
   7. Выполните ежедневное профилактическое обслуживание системы CE-MS прежде чем анализировать образцы. Использование метанола протрите CE электрода (на входе), но использовать изопропиловый спирт и смесь (50: 50) для очистки CE-MS интерфейс, который очень важно избегать соли наращивание и ограничить потенциальные образца перенос воды.
   8. Удаление LC распылитель из источника ионов и положение уборка распылитель с недавно кондиционером капилляров в интерфейсе жидкого коаксиальный оболочка для CE-МС.
   9. Включите насос Изократические и применить напряжения 30 кв 15 мин для обеспечения достижения стабильной текущий профиль CE до анализа мочи.
2. Инъекции и разделения условий с помощью CE
   1. Откройте поставщиков программного обеспечения, используемые для управления инструмент для CE параметры и выберите Литраж шаг. Установите флеш функция 600 s и указать позицию BGE флакона.
      Примечание: Внешние воды чиллер может потребоваться быть подключены к системам CE, что отсутствие образца лоток охлаждения функции, как это требуется для предотвращения испарения образца при анализе больших партий образцов ограничено объем.
   2. Инъекций функция эжекции внедрить образцы на 100 мбар для 5 s и electrokinetically вставляют BGE распорки на 30 кв для 75 s.
      Примечание: Этот процесс повторяется с каждой инъекции образца (с позиции различных флакона) следуют BGE распорку (из той же позиции флакона), которая автоматически выполняется внутри метода программы на программное обеспечение для в общей сложности 11 дискретных проб, анализируется в При использовании формата MSI же работать. Анализировать 10 образцов мочи в случайном порядке после 84-группа наркотиков смеси на скрининг отсечения уровень вводится как первый пример позиции для каждого запуска MSI-CE-MS.
   3. Установка применяется напряжения 30 кв, картридж температура 25 ° C, и Общее время выполнения будет 40 мин, используя график, применить градиент давления 2 мбар/мин от 0 мин до 40 мин в ходе разделения.
      Примечание: Градиент давления применяется во время разделения для элюции медленно перенос наркотиков, которая включает в себя некоторые бензодиазепины слабо, основные и нейтральных/кислой наркотиков (например, парацетамол, барбитураты). Однако самые основные ООА и их метаболитов мигрируют как катионы в течение 25 мин, включая амфетамины, опиоидов и другие классы алкалоидов.
   4. После завершения приобретения образец, убедитесь, что для полоскания капилляр при низком давлении (50 мбар) с BGE до следующего дня. В противном случае, промойте капилляра для 600 s при высоком давлении (900 мбар) с водой, а затем для 600 s с воздухом и хранить его в держатель опрыскивателя до следующего использования.
3. Изократические насосы и ножны жидкости
   1. Используйте бесконечности Изократические насосы и вакууматор бесконечности для доставки оболочка жидкости (переработке MeOH:H₂O с муравьиной кислоты 0,1% v/v) в размере 10 мкл/мин до CE-MS опрыскивателя.
4. Параметры TOF MS
   1. Убедитесь, что TOF MS, с источник ионов коаксиальный электроспрей оболочка жидкость и газ с подогревом азот, оборудована блоком CE.
   2. Действуют TOF MS в положительный ион обнаружения , которые охватывали массу m/z 50-1700, с частотой сбора данных 500 мс/спектра. Убедитесь, что профиль и центр тяжести, что данные хранятся в формате «.d».
   3. Задайте условия ионизации электроспрей быть: Vcap и сопло напряжение на 2000 V, Распылитель газовый на 10 psi и сушки газа выступил на 8 Л/мин при 300 ° C, с потоком газа оболочка 3,5 Л/мин при 195 ° C. Кроме того задайте параметры напряжения MS fragmentor, скиммер, и Oct1 РФ 120, 65 и 750 V, соответственно.
      Примечание: Vcap и сопло напряжения, а также Распылитель газовый были выключены во время последовательности впрыска серийного образца используется в MSI-CE-МС, но электроспрей был запрограммирован, чтобы быть снова включается 1 мин после начала электрофоретического разделения для предотвращения ток ошибки из-за отсасывание эффекты.
   4. Выполните инструмент контроля и сбора данных с помощью поставщика программного обеспечения (Таблица материалов).
5. Анализ данных
   1. Анализ данных MSI-CE-MS, с использованием поставщика программного обеспечения, включая обработку, сглаживание, данных и учета извлеченных ионов electropherograms (глазами) представитель DoA и их метаболитов.
   2. Откройте программное обеспечение и задайте следующие параметры.
      1. В разделе хроматограмвыберите Формат извлечения данныхи Формат Хроматограмма и массы спектральных данных режим .
      2. Выберите Квадратичной/кубический Савицкий Голея под функцию сглаживания и функция ширина до 15 очков.
      3. Затем, нажмите кнопку Включения (МС), установить интегратор должен быть Agileи выберите максимальное количество вершин предел в крупнейших 11 пикфильтры.
      4. Нажмите кнопку Просмотр, нажмите интеграции пик списоки выберите Максимальное число, время удерживания (RT), площади пика, Высота пикаи отношение сигнал шум (SNR).
      5. Сохраните эти параметры под уникальное имя метода. Применить этот метод к процессу и интерпретации каждого набора данных.
         Примечание: Сводная таблица с номером пик, RT, площади пика и высоту и SNR отображаются на правой стороне. Выполняют нормализацию данных измеренных RT и комплексной пик области для каждой DoA либо соответствующее d-это или (если нет в наличии) для F-пластинчатые теплообменники для улучшения аналитической точности.

3. анализ мочи и внешних калибровочных кривых

1. Различные последовательного впрыска конфигураций, используемых в MSI-CE-MS
   1. Для первого серийного образца инъекции конфигурации, используется для демонстрации наркотиков изомер/изобары резолюции (рис. 1а), обеспечения повторения пять инъекции выполняются на смесь 84 наркотиков стандартов с d-это и 4-F-Phe/Cl-Tyr, последовали шестой инъекция, которая является образцом пустой синтетической мочи, и пять дополнительных инъекций смеси стандартного препарата.
   2. Второй серийный образец инъекции конфигурации, используется для демонстрации обнаружения DoA в отдельных мочи у больных с известным рецепт (рисунок 2A), убедитесь, что вилку первый образец представляет собой смесь 84-наркотиков стандартной смеси на 1 x скрининг пороговый уровень (положительный контроль) следуют рандомизированных инъекций 10 разреженных мочи от больных: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183 и #50.
   3. Для третьего серийного образца инъекции конфигурации, используемый для иллюстрации приобретение внешних калибровочных кривых в один проход, обеспечения готовности calibrant решения для DoA над кратной линейный динамический диапазон, соответствующий 0.25 x 0.5 x, 1 x 2,5 x, и 5 x пороговых уровней концентрации, вместе с соответствующими d-IS и F-Phe/Cl-Tyr как дополнительные есть в матрице синтетической мочи (n = 4).

Representative Results

MSI-CE-MS позволяет последовательного впрыска десять или более дискретных образцов в один проход, который значительно повышает пропускную способность (< 3 мин/образец) без сложных инструментальных модификации, переключении столбца программы или дорогостоящей инфраструктуры инвестиции (рис. 1A). Чередуя ряд гидродинамических инъекции образца и электрокинетические прокладку BGE осуществляется в рамках неизмененном плавленый кремнезема капилляров, где зональных электрофоретической цветоделение ионов происходят в условиях сильно электролит (рН 1.8). экстракцию ионизации также происходит в условиях устойчивого состояния. В этом случае коаксиальный оболочка жидкость, с массового calibrant, используется как интерфейс для CE-MS в режиме обнаружения положительный ион с минимальным Ион подавление или повышения эффекты как контролируется массового calibrant ионов сигнала. TOF представляет надежную еще экономически HRMS с быстрого сбора, идеально подходит для видеонаблюдения неадресных скрининга наркотиков при использовании MSI-CE-МС. К примеру впечатляющие резолюции достигается для различных Изобарический/изомерных ООА и их метаболитов, в том числе структурные изомеры трех опиоидных структурных изомеров, а именно norhydrocodone, Гидроморфон и морфин (рис. 1B). В этом случае 30 решены выявленные пики от 10 независимых образцов наркотиков смеси без образца перенос. Элемент пустой/отрицательная мочи синтетической мочи также включены в рамках серии последовательного впрыска (образец позиции #6). Кроме того два других Изобарический опиоиды, а именно 6-acetylmorphine (неактивные героина метаболит) и налоксон (антагонист опиоидных рецепторов, используется для лечения опиоидной передозировки) полностью решены как 20 отдельных пиков с (приобретение полного сканирования данных Рисунок 1 c). Аналогичным образом два амфетамина позиционные изомеров полностью решена в MSI-CE-МС отличить незаконных метамфетамином от потенциального злоупотребления фентермин, предписанные стимулятор, который используется в качестве подавления аппетита для потери веса.

Рисунок 1: серия извлеченных ионов electropherograms (EIE) для представителя DoA изомеров/изобары, которые решаются MSI-CE-MS, анализируя десять образцов и пустым в течение одного запуска. (A) схема MSI-CE-MS, изображает последовательного впрыска конфигурации используется для 84-DoA панели в синтетической мочи. Этот метод мультиплексированных разделения электрокинетических инъекции буфера использует чередуя ряд гидродинамических инъекции 11 отдельных образцов и пустой инициировать зональных электрофоретического разделения ионов, последовал полный сканирования данных приобретение TOF MS с положительный ион режим обнаружения. (B) три Изобарический функциональной группы опиоидов изомеров (m/z 286.1438), разделенных CE, состоящий из 30 решена пики от 10 уколов дискретных образца, включая norhydrocodone, Гидроморфон и морфин. (C) два Изобарический опиоидных наркотиков и их метаболитов (m/z 328.1543), разделенных CE, состоящий из 20 решена пики от 10 уколов дискретных образца, включая 6-acetylmorphine (героина метаболит) и налоксон. (D) два Изобарический функциональной группы амфетамина изомеров, разделенных CE, состоящий из 20 решена пики от 10 уколов дискретных образца, включая метамфетамин и фентермин. Во всех случаях отрицательные мочи контроля/бланки представил на шестой позиции образца в MSI-CE-МС были незначительными доказательства образца перенос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для блокировки DoA, Конфигурация последовательного впрыска в MSI-CE-MS используется смесь 84-наркотиков группа в рекомендуемых скрининг пороговых уровней концентрации (как первое место инъекции для всех прогонов) следуют рандомизированных анализа 10 представитель мочи образцы, клинически депрессии больных с известным рецепт истории. Например, положительные скрининг тест результат на метадон (m/z 310.2165) от пациента #208 (рисунок 2A) выводится путем обнаружения пик большого сигнала (возникая от инъекций #9), который comigrates с метадоном d3 с низкой массовые ошибки (< 5 ppm). Никакие другие сигналы обнаруживаются в любых других образцов мочи в течение того же запустить. Концентрации метадона при сравнении соотношения измеренных Ион ответ в образце (инъекции #9) с ссылкой наркотиков смесь/КК (инъекции #1), превышает 13 x Рекомендуемое пороговое предельное и устраняется четырехкратное коэффициент разбавления мочи. Таким образом этот результат подтверждает приверженность пациента метадоновой поддерживающей терапии. Потребление nonprescribed амфетамин (рис. 2B) является свидетельством повышенными амфетамином уровнях (m/z 136.1121) который был обнаружен только в один пациент (пациент #50, в инъекции #11) в рамках MSI-CE-MS. Измеренная концентрация незначительно превысили рекомендуемый пороговых уровней (1,3 x). Это comigrates с амфетамин d5 и низкой массы ошибка с топ рейтинг Молекулярная формула матча. Положительный результат теста для антидепрессантов венлафаксин (m/z 278.2115), селективного серотонина норадреналина reuptake ингибитор, проявляется также в пациент #281 (инъекции #6). В этом случае концентрация превышает рекомендуемых пороговых уровней (15 x), это определяется по его точная масса - или Молекулярная формула матч, вместе с comigrating венлафаксин d6 (рис. 2 c). Этот последний критерий не встретились для неизвестных изобары, которое также обнаруживается в трассировке ЭИЭ, который подчеркивает необходимость проявлять осторожность, когда полагаясь исключительно на его точной массы. Кроме того окончательное определение предписанные прегабалина, который назначается для лечения нейропатической боли, а также Генерализованная тревога, также продемонстрировал для пациента #309, основанный на его грубо повышенной концентрации (64 x) выше рекомендованного пороговых уровней (Рисунок 2D). Это однако, не обнаруживается в девяти других пациентов мочи, анализируются в течение того же запустить. Подобно к другим случаям экрана позитивных, инъекции #4, comigrates с прегабалина d6, который включен во всех пробах мочи, анализируемой MSI-CE-МС.

Рисунок 2: серия извлеченных ионов electropherograms (EIE) для представителя экрана положительных мочи наркотиков результаты теста из когорты 10 пациентов клинически депрессии как подтвердили, когда рекомендуется использовать MSI-CE-МС, который включает в себя группу 84-наркотиков на пороговый уровень, вводят в первой позиции инъекции образца, выступающей в качестве внутренней ссылки Смятие. (A) ЭИЭ оверлея соответствует метадон d3, который comigrates с метадоном, подчеркнув, что только один мочи (инъекции позиции #9) имеет повышенные концентрации метадона, что намного превышает пороговый уровень. (B) ЭИЭ оверлея соответствует амфетамин d3, который comigrates с амфетамином, подчеркнув, что только один мочи (инъекции позиции #11) имеет повышенные концентрации выше пороговых уровней. (C) ЭИЭ оверлея соответствует венлафаксин d6, который comigrates с венлафаксин, подчеркнув, что только один мочи (позиция #6 инъекций) имеет повышенные концентрации выше пороговых уровней. (D) ЭИЭ оверлея соответствует прегабалина d6, который comigrates с прегабалина, подчеркнув, что только один образец мочи (позиция #4 инъекции) грубо повышенных концентраций, превышающих пороговых уровней. Все образцы мочи были проанализированы непосредственно после пятикратного разрежения в деионизированной воде вместе с добавлением соответствующий d-(при наличии). Экран положительный результат в MSI-CE-МС соответствует препарат, который comigrates с d МКС с низкой массы ошибка (< 5 ppm) и правильный Молекулярная формула, концентрация которого превышает отсечения, анализируемые в рамках выполнения же как внутренние ссылки Смятие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Абсолютная количественная оценка ООА и их метаболитов достигается MSI-CE-MS, основанные на внешних калибровочных кривых, с использованием эталонных стандартов calibrant для DoA, быстро приобретают в один проход. Например, серийный разбавления 84-препарат calibrant смеси вместе с соответствующим d-на фиксированной концентрации обеспечивает надежный количественный анализ в сложных мочи. Это компенсирует для потенциальных матрица индуцированной Ион подавления или расширения, но и для изменения в объем впрыска в капилляр между выборками. В тех случаях, когда соответствующий d-IS коммерчески недоступен или непомерно для некоторых DoA, суррогат — используется для нормализации данных, таких как d-IS от в пределах того же класса наркотиков или синтетических соединения не найден в моче (F-Phe), как показано ранее ¹⁴. Представитель глазами и внешних калибровочные кривые для оксикодон показаны на рисунке 3а, B. и для циталопрама в рисунке 3 c, D. Эти широко назначают анальгетики и антидепрессанты, соответственно, с потенциалом злоупотреблений. Относительный Ион ответ соотношения их соответствия d-это измеряется. В этом случае конфигурация последовательного впрыска в MSI-CE-МС, состоящий из пяти различных наркотиков calibrants, анализируются в двух экземплярах в течение одного запуска вместе с пустой синтетической мочи. В целом, хорошая линейность (R² > 0.990) над кратной концентрации диапазон был достигнут с адекватной чувствительностью для выявления большинства ООА и их метаболитов (то есть, Катионный алкалоидов) в пределах панели 84-наркотиков ¹⁴. во всех случаях, наркотиков метаболиты обнаруживаются как ограничивает их протонированных иона [MH⁺] молекулярных выше их отключения скрининг (> 50 нг/мл), за исключением некоторых кислых/нейтральный препаратов, которые имеют плохой ионизации КПД под положительный ион режим, например каннабиноидов (например, ТГК-COOH), барбитураты (например, секобарбитал) и карбаматы (например, карисопродолом).

Рисунок 3: серия извлеченных ионов electropherograms (EIE) для количественной оценки представитель DoA. Это делается путем создания внешних калибровочных кривых на основе их относительных Ион ответ соотношения с соответствующим d-над кратной линейный динамический диапазон. (A) дублировать инъекции пяти пунктов Калибровочная кривая для calibrants оксикодон вместе с оксикодон d3 и пустым. (B) внешние Калибровочная кривая для оксикодон, после линейной регрессии для получения чувствительность (склон) и линейность (R²), с погрешностей, представляющие ±1σ (n = 4). (C) дублировать инъекции пяти пунктов Калибровочная кривая для calibrants циталопрам, вместе с циталопрам d6 и пустым. (D) внешние Калибровочная кривая для циталопрам, после линейной регрессии для получения чувствительность (склон) и линейность (R²), с ошибкой бары представляющих ±1 SD (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Обычные хроматографического Цветоделение обычно полагаются на один образец инъекции в перспективе, которая затем следуют градиента элюции для урегулирования сложных наркотиков смеси и столбец ремонта. Эти требования принципиально ограничить пропускную способность образца и обязанность цикла даже при использовании оптимальный столбец Переключение программ. В этом контексте, анализ большого объема мочи наркотиков на рабочем месте, токсикологии или терапевтического мониторинга приложений, GC-MS/MS и, все чаще, LC-MS/MS таким образом выполнять параллельно, но используется преимущественно как второго уровня или подтверждающего теста при необходимости (например, юридических или медицинских контекст). Это обусловлено гораздо выше капитальные инвестиции и оперативные расходы, а также осложнений с анализом данных при сравнении выборок, проанализированы на несколько инструментальных платформ в аккредитованной лаборатории. В результате immunoassays по-прежнему остаются основным методом для рутинной наркотиков скрининг несмотря на то что подвержены ложных срабатываний и ложь негативы среди многих наркотиков классов, с ограниченным доступом к антитела реагентов для возникающих дизайнерские наркотики. Предыдущие исследования показали, что мультиплексированных цветоделения на основе MSI-CE-MS предлагают простое решение для повышения пропускной способности образца до один порядок величины. Кроме того этот подход позволяет для разработки новых данных рабочих процессов для открытия биомаркеров с точностью данных, на основе осуществления эффективного пакетного коррекции и контроля качества^12,,1314. Однако введение 10 или более последовательных гидродинамических инъекции в MSI-CE-MS сокращает эффективная длина капилляра, необходимые для поддержания высокой эффективности увольнений, которые могут скомпрометировать избирательность при анализе ООА и их метаболитов в моче человека.

Здесь мы ввели электрокинетических инъекции BGE после каждой инъекции гидродинамические образца, таким образом, что разделение использует полное капиллярное длины (120 см), тем самым повышая разрешение важных наркотиков изобары/изомеров при использовании полный проверка сбора данных по TOF MS (рис. 1A). По сравнению с недавнего доклада¹⁴лучше разрешение достигается несколько важных Изобарический/изомерных ООА и их метаболитов, который имеет решающее значение при отборе для крупных панелей. Например был реализован резолюции несколько важных структурно функциональных групп изомеров, включая три аналогичных опиоидных наркотиков/метаболитов (рис. 1B), два несвязанных опиоидных изобар (рис. 1 c) и два метамфетамин Позиционные изомеров (рис. 1 d). Во всех случаях образец переходящего из последовательного впрыска решений различных calibrant в течение того же запустить не значительные, как подтверждается управления/пустым отрицательным мочи. Кроме того, улучшение резолюции также реализуется несколько кросс-взаимодействий с участием некоторых d МКС с Изобарический наркотиков в панели, например котинина d3 и 3,4-метилендиоксиамфетамин (МДА), EDDP-d3 и имипрамин, norfentanyl-d5 и Кетамин, кодеин d6 и сертралин и кокаин d3 и золпидема. Этот результат распространяется на другие Изобарический взаимодействиями внутри панели наркотиков, которые были лучше решить в этом исследовании (например, noroxycodone/оксиморфон, normeperidine/Метилфенидат), а также основных фон мочевыводящих взаимодействий (например , в исходный фрагмент ионов креатинина с амфетамина)¹⁴. Действительно доступ к двух ортогональных параметров для удовлетворения предполагаемого идентификации конкретных DoA имеет решающее значение для уменьшения ложных срабатываний благодаря Изобарический взаимодействий, а именно точные массы в сочетании с comigration с d МКС. Кроме того обнаружения одного или нескольких метаболитов биотрансформации родитель наркотиков в пределах того же образца, например Гидроксилированные, деметилированное или нетронутыми глюкуронид наркотиков conjugate(s), добавляет дальнейшее доверие к идентификации наркотиков при расширении окна для обнаружения.

Рекомендованных пороговых уровней для скрининга мочи наркотиков различаются для разных классов DoA (от 50 до 1000 нг/мл) в зависимости от их фармакокинетики, токсичности и фона помех, чтобы уменьшить предвзятость метод, основанный на руководящих принципах от Наркомании и психического здоровья услуг администрации (SAMHSA)¹⁴. Потенциал для MSI-CE-МС для обнаружения и идентификации различных классов DoA непосредственно в моче с предварительной минимальной образец был применен к группе пациентов клинически депрессии с записью известный рецепт. Окончательное определение метадона (предписанных), амфетамин (nonprescribed/незаконные), венлафаксин (предписанных) и прегабалина (предписанных) в разреженных, но nonhydrolyzed, мочи был продемонстрирован при использовании MSI-CE-МС. Это было основано на прямое сравнение наркотиков, обнаруженных в конкретных инъекции позиции относительно смесь 84-наркотиков, представил на первой позиции образца на рекомендуемый скрининг пороговый уровень, который служит в качестве внутренней ссылки/КК и положительный контроль (Рисунок 2). Кроме того, абсолютное наркотиков количественная оценка осуществима с помощью внешних калибровочных кривых (рис. 3) на основании соотношения ионов ответ измеряно препарата по отношению к его d-это. В отличие от наиболее хроматографического цветоделение, отсутствует дейтерия эффект воздействия миграции время различия между d-это и его nondeuterated наркотиков, поскольку они обладают аналогичными электрофоретической подвижности в свободное решение в CE. Действительно поведение миграции DoA моделируется точно в CE, основанный на их основных физико-химических свойств химической структуры, а именно: Молекулярный том и эффективный заряд (pK)¹⁴. Поскольку многие препараты также претерпевают значительные вторичного метаболизма до экскреции с мочой (например, морфин глюкуронид), скрининг отсечения, которую уровнях требуют перестройки как их измеренные концентрации ниже, чем ожидалось по сравнению с методы, которые используют ферментов гидролиза для обнаружения всего наркотиков. Основное преимущество «разбавлять и снимай» наркотиков мочи, помимо снижения расходов и времени, пробами и потенциальной предвзятости или пакетного вариации из-за неполной ферментов гидролиза, является, что предполагаемого экрана-инфицированных далее подтверждается Обнаружение одной или нескольких метаболитов связанной с наркотиками в рамках той же пробы. Это также обеспечивает более глубокое понимание наркотиков фармакокинетики и оптимальной дозировки требования для отдельных пациентов при одновременном повышении обнаружения для «быстрого» метаболизмом или предписано/незаконных наркотиков с короткие периоды полураспада. Кроме того, comigration с совпадающими d-это играет две важные функции для надежной наркотиков скрининг при использование MSI-CE-MS — а именно, он определяет точный пример инъекций позиции (то есть, пациент #) а также исправления для различия в Ион ответы/инъекции томов для повышения точности и достоверности.

Будущая работа направлена на разработку заказного программного обеспечения инструменты для облегчения автоматизированной обработки мультиплексированные увольнений, в сочетании с HRMS как необходимые для большого объема мочи наркотиков испытания с КК/QA. Строгие проверки для широкого спектра скрининга DoA MSI-CE-МС также будут расследоваться среди больших когорте риска пациентов для того, чтобы объективно оценить лекарственное приверженности и потенциала злоупотребления/замену, что может поставить под угрозу эффективность лечения, безопасности пациентов, и/или психиатрической оценки/диагноз. Дополнительный анализ кислой/анионный классов ООА и их метаболитов будет также осуществляться MSI-CE-MS в щелочных условиях отрицательный ион режим обнаружения требуется для комплексного скрининга природных/Синтетические каннабиноиды. Это важно, учитывая последствия надвигающегося общественного здравоохранения легализации марихуаны для отдыха по всей Канаде и несколько штатов США. Основным преимуществом приобретения полного сканирования данных TOF MS является, что ретроспективный анализ проб может быть выполнена даже тогда, когда образцы мочи больше не доступны для последующего тестирования, тогда как другие образ жизни или пищевые воздействия могут быть оценены лучше понимаете дифференциального ответы к лекарственной терапии. Таким образом быстрое но точный метод наблюдения наркотиков по MSI-CE-MS предлагает значительные преимущества для обычных целевых immunoassays, а также прямые вливания/эмбиент методы ионизации MS/MS, которые подвержены вмешательства/предвзятости при разрешении расширение панели ООА и их метаболитов в сложных биологических образцов в дополнительных издержек.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)