Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode for omfattende narkotikaovervåking som tillater for bedre oppløsning og påvisning av store paneler av misbruk og deres metabolitter, med kvalitetskontroll basert på multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese-massespektrometri.
Nye analytiske metoder er sterkt behov for å aktivere høy gjennomstrømming, men likevel omfattende narkotikarelaterte screening, gitt en alarmerende opioid- og reseptbelagte stoffet krise i offentlig helse. Konvensjonelle urin narkotikatesting basert på en to-lags immunanalyse skjermen etterfulgt av en gass kromatografi-tandem massespektrometri (GC-MS/MS) eller flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoden er dyre og utsatt for skjevhet samtidig begrenset til målrettet paneler av kjente narkotiske stoffer (DoA). Her, skissere vi en bedre metode for narkotikaovervåking som tillater for oppløsning og oppdagelsen av en utvidet panel av DoA og deres metabolitter ved multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese-massespektrometri (MSI-CE-MS). Multiplekset separasjoner av ti urinprøver med en kvalitetskontroll av CE (< 3 min/sampling) sammen med full skanning datainnsamling bruker time of flight-masse spectrometer (TOF-MS) under positivt ion mode Gjenkjenningsmerknad tillater identifikasjon og kvantifisering av DoA ovenfor anbefalte cut-off nivåer. En utmerket løsning stoffet isomerene og Isobarene, inkludert bakgrunn forstyrrelser, oppnås når du bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis med en electrokinetic mellomrom mellom eksempel segmenter, hvor nøyaktig masse/molekylære formel med comigration av en matchende deuterated interne standard og gjenkjenning av ett eller flere bio-forvandlet metabolitter lette DoA identifikasjon over et bredere oppdagelsen vinduet. I tillegg kan urinprøver analyseres direkte uten enzymet deconjugation for rask screening uten komplisert eksempel workup. MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis aktiverer overvåking av et bredt spekter av DoA som kreves for behandling overvåking av høy-risiko pasienter, inkludert bekrefter foreskrevet narkotika etterlevelse, avslørende illegale bruk/substitusjon og vurdere optimal dosering regimer nødvendig for nye fremskritt i presisjon medisin.
En alarmerende økning i misbruk av og avhengighet til opioider for behandling av kroniske smerter representerer en økende trussel mot folkehelsen, med over 70 000 overdosedødsfall i USA i 20171. Tilsvarende er ulike andre psykotrope medikamenter også mye foreskrevet til barn og unge voksne for behandling av angst, depresjon og psykiske problemer2. Urin narkotikatesting metoder, mye utviklet for arbeidsplassen og rettsmedisinske toksikologi, er resultatet av avgjørende betydning for den terapeutiske overvåking av foreskrevet medisiner som er utsatt for toleranse og avhengighet3,4. Dette er nødvendig for å sikre overholdelse, optimal terapeutiske effekten og pasientsikkerhet, mens avsløre potensielle substitusjon, inkludert ulovlig eller nonprescribed rusmiddelmisbruk. Foreløpig urin narkotikatesting for DoA stole på en to lagdelt tilnærming, bestående av et innledende konkurransedyktig immunanalyse skjermen via point-of-care enheter eller laboratorium analyserer, etterfulgt av en bekreftende test med større spesifisitet er basert på GC–MS-/ MS og stadig, LC–MS-/ MS5. Men er immunanalyser utsatt for bias, som antistoff reagenser binde nonspecifically til ulike narkotika klasser til å generere en presumptive skjermen-positive resultatet, som hindrer en pålitelig ID og kvantifisering av spesifikke medikamenter eller komplekse narkotika blandinger6. I denne sammenheng mer nøyaktig urin-narkotikatesting trengs haster gitt den ublu kostnadene ved omfattende blandingsbruk skjermbilder,7 inkludert syntetiske medikamenter og syntetisk urin produkter som unnvike konvensjonelle målrettet analyser.
Høy effektivitet separasjoner i forbindelse med høy oppløsning MS (HRMS) bruker TOF eller orbitrap masse analyserer foreslått som en nontargeted strategi for narkotikaovervåking i en tid med polypharmacy og utvide paneler DoA8,9 . Men er konvensjonelle LC separasjoner treg (> 15 min) på grunn av lang elueringsrør tider for oppløsning av kjemisk ulike klasser av DoA og deres metabolitter i gradient elueringsrør-programmer, som begrenser utvalget gjennomstrømmingen for rutinemessig narkotikarelaterte screening. Alternativt, direkte analyse baseres på desorpsjon ionization (tegning)10 og laser diode termisk desorpsjon (LDTD) tillater raskere narkotikarelaterte screening uten separasjon11. Men er metodene ambient ionisering utsatt for isobar/isomere forstyrrelser når analysere komplekse urin prøver, dermed krever uavhengig bekreftende testing.
Vårt laboratorium har nylig utviklet en multiplex separasjon plattform for å øke utvalg ytelse samtidig beholde oppløsning og data gjengivelsen av en høy effektivitet separasjon basert på MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis12. Romanen data arbeidsflyter kan være utformet på MSI-CE-MS for nontargeted metabolitten profilering (dvs.metabolomics) av volum-begrenset biospecimens, mens kvalitetskontroll (QC) tillater for satsvis korreksjon som kreves for store befolkning studier13. I dette tilfellet utføres separasjoner ved hjelp av en isocratic buffer med stoff ionisering oppstår under stabil løsemiddel forhold når du bruker en konvensjonell skjede flytende grensesnitt, som gir føljetong injeksjoner av 10 eller flere prøver i ett kjøre rask men selektiv screening av ulike klasser av DoA og deres metabolitter14. Fokus for denne studien er å ytterligere validere MSI-CE-MS for direkte analyse av autentisk urinprøver fra en representant kohort av klinisk deprimerte pasienter med en “fortynne-og-shoot” metode som kontorplass enzym hydrolyse15. I tillegg gjennomføringen av en electrokinetic mellomrom mellom føljetong eksempel plugger i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis16 ble utført ytterligere forbedre oppløsningen på forskjellige narkotika isomerene/Isobarene, bakgrunn urin forstyrrelser, og/eller Cross-forstyrrelser når screening store paneler av DoA. Den absolutte kvantifiseringen av DoA i urin prøver når bruker matchende deuterated interne standarder (d-er) er demonstrert ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Denne tilnærmingen også forenkler narkotika identifikasjon, samt deducing riktig utvalg plasseringen av skjermen-positive tilfeller i forhold til en narkotika-panelet blanding på de anbefalte screening cut-off nivå som også fungerer som en intern referanse/QC innen samme løp.
Vanlig brukt kromatografiske separasjoner er vanligvis avhengige av en enkelt prøve injeksjon per kjørt, som etterfølges av en gradient tilsettes for å løse komplekse narkotika blandinger og justering av kolonnen. Disse kravene fundamentalt begrense utvalg ytelse og plikt syklus selv når du bruker optimal kolonnen bytte programmer. I denne sammenheng, høyt volum urin drug analyse for arbeidsplassen, toksikologi eller terapeutiske overvåking programmer av GC–MS-/ MS og stadig, LC–MS-/ MS er dermed utføres parallelt, men brukes fortrinnsvis som et andre lag eller bekreftende teste når nødvendig (dvs., juridiske eller medisinske sammenheng). Dette er på grunn av mye høyere investeringer og driftskostnader, samt komplikasjoner med dataanalyse når sammenligne analyserte på flere instrumental plattformer innen akkreditert laboratorium prøver. Resultatet fortsatt immunanalyser Hovedmetode for rutinemessig narkotikarelaterte screening tross utsatt for falske positiver og USANN-negativer blant mange narkotika klasser, med begrenset tilgang til antistoff reagenser for nye syntetiske medikamenter. Tidligere studier har vist at multiplex separasjoner basert på MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis tilbyr en enkel løsning for å forbedre utvalget gjennomstrømningen til en størrelsesorden. I tillegg gir denne tilnærmingen for design av romanen data arbeidsflyter for biomarkør oppdagelsen med høy kvalitet basert på gjennomførelsen effektiv satsvis og kvalitetskontroll12,13,14. Men forkorter innføringen av 10 eller flere serielle etter injeksjoner i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis den effektive kapillære lengden forpliktet til høy effektivitet separasjoner, noe som kan kompromittere selektivitet når du analyserer DoA og deres metabolitter i menneskelige urin.
Her, innført vi en electrokinetic injeksjon av BGE etter hver etter eksempel injeksjon, slik at avstanden utnytter full kapillær lengden (120 cm), dermed forbedre oppløsningen på stoffet Isobarene/isomerene ved full-scan datainnsamling av TOF-MS (figur 1A). I forhold til en siste rapport14oppnås bedre oppløsning for flere viktige isobar/isomere DoA og deres metabolitter, som er kritisk når screening for store narkotika paneler. For eksempel ble oppløsningen for flere viktige strukturelle/funksjonelle gruppen isomerene realisert, inkludert tre analoge opioider narkotika/metabolitter (figur 1B), to urelaterte opioider Isobarene (figur 1 c) og to metamfetamin posisjonelle isomerene (figur 1 d). I alle tilfeller er eksempel carry-over fra føljetong injeksjon av ulike calibrant løsninger innen samme kjøre ikke betydelig som bekreftes av en negativ urin kontroll/tom. I tillegg forbedret oppløsning er også innsett for flere kryss-forstyrrelser med visse d-ISs med isobar narkotika panelet, som cotinine-d3 og 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDDP-d3 og imipramin, norfentanyl-d5 og Ketamin, kodein-d6 og sertraline, og kokain-d3 og zolpidem. Dette resultatet er utvidet til andre isobar forstyrrelser narkotika panelet som var bedre løst i denne studien (f.eksnoroxycodone/oxymorphone, normeperidine/metylfenidat), samt store bakgrunn urin forstyrrelser (f.eks , i kildekode fragmentere ioner av creatinine med amfetamin)14. Tilgang til to ortogonale parametere å tilfredsstille antatte identifisering av en bestemt DoA er faktisk avgjørende for å redusere false-positiv på grunn av isobar forstyrrelser, nemlig nøyaktig masse kombinert med comigration med d-ISs. Også gjenkjenning av ett eller flere biotransformed metabolitter av overordnede innenfor samme prøven, som hydroxylated, demethylated eller intakt glucuronide narkotika conjugate(s), legger ytterligere tillit mot narkotika identifikasjon mens utvide vinduet for gjenkjenning.
Anbefalte cut-off nivåene for urin narkotikarelaterte screening varierer for ulike klasser av DoA (alt fra 50 til 1000 ng/mL) avhengig av farmakokinetikken, toksisitet, og bakgrunnen forstyrrelser, for å redusere metoden bias basert på retningslinjer fra Rusmiddelmisbruk og psykiske tjenester administrasjon (SAMHSA)14. Potensialet for MSI-CE-MS å oppdage og identifisere ulike klasser av DoA direkte i urin med minimal eksempel forbehandling ble brukt til en gruppe klinisk deprimerte pasienter med kjente resept posten. Definitive identifikasjon av metadon (reseptbelagte), amfetamin (nonprescribed/ulovlig), venlafaxine (reseptbelagte) og pregabalin (reseptbelagte) i utvannet, men nonhydrolyzed, urinprøver ble demonstrert ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Den var basert på en direkte sammenligning av et medikament oppdaget i en bestemt injeksjon posisjon i forhold til 84-stoff blandingen i første eksempel stilling ved de anbefalte screening cut-off nivå som fungerer som en intern referanse/QC og positiv kontroll (Figur 2). Også absolutt medikamentfri kvantifisering er mulig ved hjelp av eksterne kalibrering kurver (Figur 3) basert på ion svar forholdet målt for et stoff i forhold til sin d-er. I motsetning til mest brukt kromatografiske separasjoner, det er ingen deuterium effekt påvirker overføring tid forskjellene mellom en d-er og dens nondeuterated narkotika siden de har tilsvarende electrophoretic mobilities i gratisløsning CE. Migrasjon virkemåten til DoA er faktisk nøyaktig modellert i CE, basert på deres grunnleggende mekanisk-egenskaper/kjemisk struktur, nemlig molekylær volum og effektiv kostnad (pKen)14. Siden mange legemidler gjennomgår også betydelige sekundære metabolisme før utskillelse i urin (f.eksmorfin glucuronide), screening cut-off nivåer krever justering som deres konsentrasjonene er lavere enn forventet sammenlignet metoder som bruker enzym hydrolyse for totale gjenkjenning. En stor fordel av “fortynne-og-shoot” urin narkotikatesting, i tillegg til å redusere kostnader/tid, prøve-håndtering, og en potensielle skjevhet eller satsvis variasjoner på grunn av ufullstendige enzym hydrolyse, er at presumptive skjermen-positive tilfeller blir ytterligere bekreftet av den gjenkjenning av ett eller flere relaterte narkotika metabolitter i samme utvalget. Dette gir også dypere innsikt i stoffet farmakokinetikken og optimal dosering krav for individuelle pasienter samtidig forbedre gjenkjenning for “rask” metabolizers eller foreskrevet/illegale rusmidler med korte halv-liv. I tillegg comigration med tilsvarende d-spiller to viktige funksjoner for pålitelig narkotikarelaterte screening når bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis, nemlig den identifiserer nøyaktig utvalg injeksjon posisjon (dvs., pasient #) mens også korrigerer for forskjeller i ion svar/injeksjon volumer for forbedret presisjon og nøyaktighet.
Fremtiden fungere som mål å utvikle tilpasset programvareverktøy å Letter automatisert databehandling av multiplex separasjoner koplet til HRMS som kreves for høyt volum urin-narkotikatesting med QC/QA. Strenge validering av MSI-CE-MS for bredspektret screening av DoA vil også bli undersøkt en større kohort av høy-risiko pasienter for å objektivt vurdere foreskrevet narkotika etterlevelse og potensielle misbruk/substitusjon som kan kompromittere behandling effekt, pasientens sikkerhet eller psykiatrisk evaluering/diagnose. En supplerende analyse av Sure/anionic klasser av DoA og deres metabolitter vil også bli fremført av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis under alkaliske forhold med negative ion modus gjenkjenning som kreves for omfattende screening av naturlige/syntetisk cannabinoider. Dette er viktig gitt truende folkehelsen implikasjonene av legalisering av marihuana rekreasjons over Canada og flere amerikanske stater. En stor fordel av full skanning datainnsamling av TOF-MS er at retrospektiv av prøver kan utføres selv når urin prøver er ikke lenger tilgjengelig for oppfølging testing, mens andre livsstil eller kosthold eksponeringer kan bli vurdert bedre forstå differensial Svar å bedøve terapi. I sammendraget tilbyr rask men presis narkotika overvåking metode av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis betydelige fordeler til konvensjonelle målrettet immunanalyser, samt direkte infusjon/ambient ionisering–MS-/ MS metoder som er utsatt for forstyrrelser/bias ved løsing utvidet paneler DoA og deres metabolitter i komplekse biologiske prøver inkrementelle kostnader.
The authors have nothing to disclose.
P.B.M. ønsker å anerkjenne finansiering støtte fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada, Canada grunnlaget for innovasjon, Genome Canada og McMaster University. Forfatterne takker Howard Lee hos Seroclinix Corporation og Dr. Marcus Kim Agilent teknologi for diskusjonene innsiktsfulle. I tillegg bekrefter forfatterne Dr. Zainab Samaan fra Department of Psychiatry og opptreden vitenskap ved McMaster University og humør lidelse klinikken ved St. Joseph’s Hospital for tilgang til de deidentified pasienten urinprøver brukes i denne studien .
7100 Capillary Electrophoresis System | Agilent Technologies Inc. | G7100A | CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation |
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer | Agilent Technologies Inc. | G6230B | HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation |
CE-ESI-MS Sprayer Kit | Agilent Technologies Inc. | G1603A | CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette |
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser | Agilent Technologies Inc. | G1310B | Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant |
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01) | Agilent Technologies Inc. | — | Software used for control of CE-MS system |
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01) | Agilent Technologies Inc. | — | Software used for processing of CE-MS data |
Shortix Capillary Cutter | Agilent Technologies Inc. | 5813-4620 | Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries |
Capillary Window Maker | Microsolv Inc. | 07200-S | Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary |
Flexible Fused-silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies Inc. | TSP05375 | Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD) |
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE) | Cerilliant Inc. | Miscellaneous | Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine) |