Genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan i situ Ca2 + imaging utføres. For å maksimere data utvinning fra slike innspillinger, kreves det riktige analyse av Ca2 + signaler. Protokollene i denne utredningen lette kvantifisering av Ca2 + signaler registrert i situ spatiotemporal kartlegging og partikkel-baserte analyser.
Ca2 + imaging isolert celleområde eller bestemte typer celler i intakt vev ofte avslører komplekse mønstre av Ca2 + signalering. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om den underliggende hendelser som mulig. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca2 + signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplitude kan gi noen biologiske informasjon kreves for intracellulær signalisere. Høyoppløselig Ca2 + imaging vanligvis resulterer i kjøp av store datafiler som er tidkrevende prosessen i forhold til oversette tenkelig informasjonen i kvantifiserbare data, og denne prosessen kan være utsatt for menneskelig feil og bias. Analyse av Ca2 + signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger for tilfeldig utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Denne metoden ignorerer mye viktig signalnettverk informasjonen i FOV. Derfor, for å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak med Ca2 +fargestoffer eller optogenetic Ca2 + tenkelig, passende romlige og tidsmessige analyse av Ca2 + signaler er nødvendig. Protokollene som beskrevet i denne artikkelen vil beskrive hvordan en stor mengde data kan hentes fra Ca2 + tenkelig opptak til rette mer fullstendig analyse og måling av Ca2 + signaler innspilt fra celler ved hjelp av en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca2 + signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca2 + signalering i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC), ved hjelp av GECIs.
Ca2 + er en allestedsnærværende intracellulær budbringer som styrer en rekke cellulære prosesser, for eksempel muskel sammentrekning1,2, stoffskifte3, celle spredning3,4, 5, stimulering av nevrotransmitter utgivelsen på nerve terminaler6,7, og aktivering av transkripsjon faktorer i kjernen. 7 intracellulær Ca2 + signaler ofte tar form av forbigående høyder i cytosolic Ca2 +, og dette kan være spontan eller oppstå Agonistiske stimulering avhengig av den celle type8. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca2 + signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplituden kan gi biologiske informasjon kreves for intracellulær signal5, 7 , 9. cytoplasmatiske Ca2 + signaler kan resultere av Ca2 + fra ekstracellulære plass eller via Ca2 + utgivelse fra det endoplasmatiske retikulum (ER) via Ca2 + utgivelsen kanaler som ryanodine reseptorer (RyRs) og inositol-tri-fosfat reseptorer (IP3Rs)10. RyRs og IP3Rs kan både bidra til generasjon av Ca2 + signaler og felles åpningen av disse kanalene, som kombinert med ulike Ca2 + tilstrømningen mekanismer kan resultere i en myriade av Ca2 + signalisere mønstre som er formet av tallene og åpne sannsynligheten av Ca2 + tilstrømningen kanaler, profilen for expression av Ca2 + utgivelsen kanaler, nærhet mellom Ca2 + tilstrømningen og utgivelsen kanaler, og uttrykket og distribusjon av Ca2 + reopptak og ekstrudering proteiner. Ca2 + signaler kan ta form av uniform, langvarig, høy intensitet globale svingninger som kan vare i flere sekunder eller minutter, spre intracellulær og intercellulære Ca2 + bølger som kan krysse intracellulær avstander over 100 µm10,11,12,13,14,15,16eller flere kort, romlig lokalisert hendelser som Ca2 + gnister og Ca2 + puffs som oppstår på titalls millisekund tidsrammer og spre mindre enn 5 µm17,18,19,20.
Fluorescerende mikroskopi er blitt anvendt vidt å overvåke Ca2 + signalisere isolert og kultivert celler og intakt vev. Tradisjonelt disse eksperimentene omfattet bruk av fluorescerende Ca2 + indikatorer, ratiometric og ikke-ratiometric fargestoffer som Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, blant annet 21,22,23. Disse indikatorene ble utformet permeable til celle membraner og deretter bli fanget i celler i spalting av en ester gruppe via endogene esterases. Binding av Ca2 + til høy affinitet indikatorer forårsaket endringer i fluorescens når celler og vev ble opplyst av aktuelle bølgelengder av lys. Bruk av cellen permeable Ca2 + indikatorer forbedret kraftig vår forståelse av Ca2 + signalering i levende celler og tillatt romlig oppløsning og måling av disse signalene som ikke var mulig ved assaying Ca2 + signaler på andre måter, for eksempel elektrofysiologi. Tradisjonelle Ca2 + indikatorer har imidlertid flere begrensninger, som photobleaching som skjer over utvidet opptak perioder24. Mens nyere Ca2 + indikator fargestoffer som Cal520/590 har kraftig forbedret signal til støy forhold og muligheten til å oppdage lokale Ca2 + signaler25, kan problemer med photobleaching fortsatt et problem for noen etterforskere 26,27,28. Stupbratte photobleaching begrenser også forstørrelsen, antall bildeopptak, og oppløsning som kan brukes for opptak, som økt objektive makt og høyere priser på bildeopptak krever økt eksitasjon lysintensiteten som øker photobleaching.
Disse begrensningene av tradisjonelle Ca2 + indikator fargestoffer er forverret ved registrering av Ca2 + signaler på stedet, for eksempel når innspillingen intracellulær Ca2 + signaler fra intakt vev. På grunn av problemene ovenfor, visualisering av Ca2 + signaler i situ med cellen permeable Ca2 + indikatorer har vært begrenset til strømsparingsmodus forstørrelse og reduserte priser for bildebehandling, begrenser evnen til etterforskerne å registrere og kvantifisere timelig eller romlig begrenset subcellular Ca2 + signaler. Derfor har det vært vanskelig å fange, analysere og verdsette romlige og tidsmessige kompleksiteten av Ca2 + signaler, som kan være viktig for generering av biologiske responser er ønsket, som beskrevet ovenfor. Analyse av Ca2 + signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger fra utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Tilfeldig valg av antall, størrelse og plassering av ROIs, avhengig av innfall av forskeren, kan alvorlig bias resultatene. Og iboende skjevheter med avkastningsanalyse, ignorerer denne tilnærmingen mye av viktig signalnettverk informasjonen i FOV, som dynamisk Ca2 + hendelser i opptil Avkastningen er valgt for analyse. Videre unnlater analyse av ROIs å gi informasjon om romlige karakteristikkene av Ca2 + signalene observert. For eksempel kan det ikke være mulig for å skille mellom en økning i Ca2 + som følge av en overføring av Ca2 + bølge og en sterkt lokalisert Ca2 + release event fra tabeller av Ca2 + signaler i en avkastning.
Ankomsten av genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan Ca2 + bildebehandling kan være utført i situ29,30,31,32,33 . Det er flere fordeler med å bruke GECIs over fargestoffer. Den viktigste kanskje er at uttrykk for GECI kan utføres på en celle bestemt måte, noe som reduserer uønsket bakgrunn forurensning fra cellene ikke av interesse. En annen fordel med GECIs over tradisjonelle Ca2 + indikatorer er at photobleaching reduseres (som fluorescens og consequentially photobleaching oppstår bare når celler er aktive), sammenlignet med fargestoff lastet prøver, spesielt på høy forstørrelse og høye image fange34. Dermed tenkelig med GECIs, som en GCaMP rekke optogenetic sensorer, gir etterforskerne evnen å fortegnelse korte, lokalisert sub mobilnettet Ca2 + signaler i situ og undersøke Ca2 + signalering i celler i deres innfødte miljøer som ikke er mulig tidligere. For å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak, kreves det riktige romlige og tidsmessige analyse av Ca2 + signaler. Det bør bemerkes at mens GECIs kan tilby noen klare fordeler, studier har nylig avdekket at Ca2 + bildebehandling kan utføres vellykket fra store populasjoner av ulike nevrokjemiske klasser av neurons samtidig ved hjelp av konvensjonelle Ca2 + indikatorer som ikke er genetisk kodet inn i dyr35. Denne tilnærmingen brukes post hoc immunohistochemistry for å avsløre flere forskjellige klasser av neurons skyting på høy frekvens i synkroniserte støt, og unngikk potensialet som genetiske modifikasjoner til dyret kan ha forstyrret den fysiologiske virkemåten etterforskeren søker å forstå35,36.
Protokollene i notatet rette mer fullstendig analyse og kvantifisering av Ca2 + signaler innspilt fra celler i situ med en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca2 + signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca2 + signalisere i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC). ICC er spesialiserte celler i fordøyelsessystemet (GI) som viser dynamisk intracellulær Ca2 + signalnettverk, som visualisert ved hjelp av mus uttrykke GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + transienter i ICC er knyttet til aktivering av Ca2 +-aktivert Cl– kanaler (kodet av Ano1) som er viktige i å regulere excitability av intestinal glatt muskel celler (SMCs)43, 44,45. Dermed er studiet av Ca2 + signalering i ICC grunnleggende for å forstå intestinal motilitet. Murine tynntarmen tilbyr et utmerket eksempel for denne demonstrasjonen, som det er to klasser av ICC som skilles anatomisk og kan visualiseres uavhengig: jeg) ICC ligger i området mellom den sirkulære og langsgående glatt muskelen lag, rundt myenteric plexus (ICC-min). Disse cellene som Pacemakerceller og generere den elektriske aktiviteten kjent som langsom bølger46,47,48,49; II) ICC ligger også blant en plexus rike i terminalene på motor neurons (dyp muskel plexus, dermed ICC-DMP). Disse cellene tjene som meglere svar til enteric motor neurotransmission37,39,40,50. ICC-min ICC-DMP morphologically distinkte og er Ca2 + signalnettverk virkemåtene som er vesentlig for å utføre sine oppgaver. ICC-min er stellate i form og danner et nettverk av sammenhengende celler via gapet veikryss51,52. Ca2 + signaler i ICC-min manifest som kort og romlig lokalisert Ca2 + utgivelsen hendelser på flere områder asynkront gjennom ICC-min nettverket som visualisert innenfor en FOV (fotografert med en 60 X-målet)38. Disse asynkrone signalene er timelig organisert i 1 sekund klynger som, når ordnet sammen, utgjør en netto 1 s mobilnettet økning i Ca2 +. Disse signalene overføres celle til celle i ICC nettverket og derfor organisere Ca2 + signalering, generert fra sub mobilnettet steder, i en vev bredt Ca2 + bølge. Timelige klynger og summering av Ca2 + signaler i ICC-min har blitt kalt Ca2 + forbigående klynger (CTCs)38. CTCs oppstå rytmisk (f.eks ganske like varigheter og lignende periodene mellom CTCs) 30 ganger per minutt i musen. Derimot ICC-DMP spindel formet celler, noen med sekundære prosesser, som distribuerer mellom SMCs og varicose nerve prosesser og ikke uavhengig danner et nettverk51,52. ICC-DMP skjemaet gapet veikryss SMCs, men og funksjon i denne større syncytium, kalles SIP syncytium53. Ca2 + signaler oppstår på flere områder langs lengden på cellene, men disse transienter ikke entrained eller timelig gruppert, som observert i ICC-min37. Ca2 + signaler i ICC-DMP forekommer i en Stokastisk måte, med varierende intensitet, varighet og romlig egenskaper. Protokollene nedenfor, bruker eksemplet med Ca2 + signalering i ICC-min og ICC-DMP, beskriver teknikker for å analysere komplekse signalering i bestemte typer celler i situ. Vi utnyttet induserbart grobunn-Lox p systemet for å uttrykke GCaMP6f i ICC, etter inducing aktivering av grobunn-Recombinase (grobunn) drevet av en ICC bestemt arrangøren (Kit).
Ca2 + avbilding av bestemte typer celler i intakt vev eller innen nettverk av celler ofte avslører komplekse mønstre av Ca2 + transienter. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om underliggende hendelser og kinetics av disse hendelsene som mulig. STM og PTCL analyse gir mulighet for å maksimere mengden av kvantitative data gitt opptak av denne typen.
Smalt, spindel-formet morfologi av ICC-DMP gjør dem…
The authors have nothing to disclose.
Midler ble gitt av NIDDK, via P01 DK41315.
Image J software | NIH | 1.5a | Image J software |
Volumetry | GWH | Volumetry 8Gd | Custom made analysis software |
Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL, USA | NDC 10019-360-60 | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
GCaMP6F mice | Jackson Laboratory | Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D | |
Kit-Cre mice | Gifted From Dr. Dieter Saur | c-Kit+/Cre-ERT2 | |
Ethanol | Pharmco-Aaper | SDA 2B-6 |