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Medicine

小鼠胸腹主动脉超声检查确定动脉瘤大小

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/59013
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,2, 1,2
1Saha Cardiovascular Research Center, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Kentucky

Summary

超声成像已成为确定小鼠胸动脉瘤和腹主动脉瘤腔内面积的常用方法。该协议描述了获取可靠和可重复的二维超声图像的上升和腹主动脉小鼠的程序。

Abstract

当代高分辨率超声仪器有足够的分辨率, 以方便测量小鼠主动脉。这些仪器已被广泛用于测量主动脉瘤小鼠模型中的主动脉尺寸。主动脉瘤被定义为主动脉的永久性扩张, 最常见的是在上升和腹部区域。超声对主动脉尺寸的顺序测量是评估主动脉瘤在体内发展和进展的主要方法。尽管许多报告的研究使用超声成像来测量主动脉直径作为主要终点, 但也有一些混淆因素, 如探针位置和心脏循环, 可能会影响数据采集、分析和解释的准确性。该方案的目的是为使用超声波以可靠和可重复的方式测量主动脉直径提供实用的指导。该协议介绍了小鼠和仪器的制备、适当超声图像的采集以及数据分析。

Introduction

主动脉瘤是常见的血管疾病, 其特征是胸腹和/或腹主动脉永久扩张 1,2,3,4。目前还没有建立预防主动脉瘤扩张和破裂的药物治疗方法, 这就强调了对发病机制的深入了解。为了阐明主动脉瘤的机制, 基因或化学操作产生的小鼠模型已被广泛使用4,5,6, 7,8,9,10,11,12. 小鼠主动脉直径的准确定量是主动脉瘤研究的基础。

高频超声的发展提高了图像的空间和时间分辨率, 以检测主动脉维度13、14、15 的微小差异。这使得小鼠主动脉直径的顺序测量成为主动脉瘤小鼠研究中主动脉直径的首选方法。虽然超声成像是一项简单的技术, 但需要了解主动脉解剖和生理学知识, 以获得准确测量、数据分析和解释的适当图像。主动脉是一个脉动的圆柱形器官, 在胸近端区域16具有可变曲率。这可能会导致在通常获得的二维 (2d) 图像中不准确地确定主动脉尺寸。在动脉瘤状态17中, 主动脉扭转可能会进一步影响主动脉测量的准确性。为了获得可靠和可重复的主动脉扩张测量, 该协议为使用高分辨率超声系统测量小鼠胸部近端和腹主动脉直径提供了实用指南。

Protocol

小鼠超声成像是经肯塔基州大学动物护理和使用机构委员会批准进行的 (iacuc 协议编号: 2018-2967)。在成像过程中, 使用异氟醚 1%-3% vol/vol 对小鼠进行麻醉, 并将其放置在加热平台上, 以减少程序压力并防止体温过低。使用眼润滑剂来防止角膜损伤, 因为在麻醉过程中失去了眨眼反射。

1. 设备设置

  1. 打开超声波机、加热平台和凝胶加热器 (图 1)。
  2. 打开超声波程序。输入学习信息, 如学习名称和鼠标信息。
  3. 检查异氟烷蒸发器和o2罐。如果含量较低, 请填充异氟醚蒸发器, 或将其更换为新的 o2罐。
  4. 将麻醉清除过滤器连接到感应室和鼻锥。
  5. 打开感应室的分支。
  6. 打开 o2储罐。
  7. 将麻醉蒸发器上的 o2和异氟醚旋钮分别旋转到 1 l/min 和 0% vol/vol, 以填充室中的 o2.

2. 鼠标的制备

  1. 将小鼠放入充满o2的诱导室, 以最大限度地减少因麻醉而产生的不必要的心血管变化。
  2. 打开异氟醚蒸发器 (1.5%–2.5% vol/vol)。
  3. 确认没有后肢戒断反射。
  4. 将鼠标从腔中取出, 并在每只眼睛中放置一滴无菌的眼科润滑剂。
  5. 将麻醉重定向到鼻锥, 并将流量关闭到诱导室。
  6. 将老鼠放在加热平台上, 鼻子放在麻醉鼻锥中。
  7. 用棉签将脱毛霜涂在胸部或腹部。最大限度地减少脱毛膏的用量, 以避免刺激。
  8. 等待 1分钟, 然后, 轻轻擦拭所有的奶油和头发。
  9. 用温水冲洗该区域, 并将其擦干, 以完全去除奶油。
  10. 平台上四个铜引线上的点胶。
  11. 将每个爪子垫带到心电图 (ecg) 读数的引线上 (手掌向下)。这将提供麻醉时的心电图和小鼠呼吸生理学。
  12. 验证心率在450-550 比茨/min 之间。由于麻醉会影响心功能, 从而改变主动脉直径, 调整麻醉的分娩率, 使心率在适当的范围内。
  13. 将预热超声波凝胶涂在准备好的部位。
  14. 将探头连接到支架上。
  15. 旋转平台以获得最佳扫描效果, 并降低探头, 直到与超声波凝胶接触。

3. 胸主动脉的成像

  1. 将平台向下倾斜到鼠标的左侧。
  2. 将探头放在鼠标胸骨的右边缘 (图 2a)。将探头上的参考标记定向。
    请注意:探头上的参考标记指示探头方向, 与超声波系统显示器上的制造商一致 (图 2a-d)。标记的形状在每个超声系统中各不相同。
  3. 在胸主动脉上使用彩色多普勒来确认血液流动。
  4. 调整舞台和探针角度以清楚地显示主动脉 (图 3a、b)。
    请注意:主动脉瓣、无名动脉和肺动脉可用于右侧副长轴视图的解剖地标。因此, 从这个角度来看, 主动脉图像可以包括主动脉瓣和无名动脉, 在一个框架内 (图 3a)。如果很难在一次扫描中捕获整个上升主动脉, 由于主动脉扩张和扭转等主动脉疾病, 则应分别拍摄图像。由于分离的图像有可能导致对主动脉测量的低估, 因此需要对舞台和探头进行精细定位。右半路长轴视图是成像整个上升主动脉的最佳选择 (图 3c)。然而, 在这种观点下, 往往很难捕捉到主动脉窦, 特别是在动脉瘤性主动脉。左侧副轴长轴视图允许从主动脉根部捕获到近端上升主动脉作为替代方法, 尽管此视图无法捕获一个帧中的主动脉弓 (图 3c)。对于左侧的准轴长轴视图, 将探头放在胸骨的左边缘 (图 2b)。舞台是平的或稍微倾斜到鼠标的权利。以与右侧母轴长轴视图相同的方式执行该过程的其他步骤。表 2描述了这些探头位置的优点和缺点。主动脉图像必须在右或右副长轴视图中一致捕获。
  5. 裁剪超声波图像以提高帧速率, 使用旋钮进行图像深度和宽度。
  6. 改变上升主动脉背侧的焦点深度, 使用旋钮进行焦点深度。
  7. 验证超声波参数。表 1描述了此协议的超声波设置。
  8. 使用 x 轴和 y 轴舞台旋钮轻轻移动探头, 以捕获最大直径的纵向主动脉图像。
  9. 存储一个 cine 循环。

4. 腹主动脉的成像

  1. 横向放置探针, 就在胸骨和小管过程的正下方 (图 2c)。探头上的参考标记应面向鼠标的右侧。腹主动脉应位于下腔静脉和门静脉 (图 3d) 旁边。
  2. 用彩色多普勒可视化腹主动脉, 以确认脉动流。
    请注意:如果多普勒角与血流垂直, 主动脉中就不会出现彩色多普勒信号。除了彩色多普勒成像, 腹主动脉可以区分从静脉和门静脉通过稍微按下探头。静脉静脉和门静脉是可压缩的, 而主动脉保持通畅。
  3. 裁剪超声波图像以提高帧速率。
  4. 将焦点深度改变为腹主动脉后壁。
  5. 将探针直观地移动, 以显示腹腔和肠系膜上动脉的分支点。
  6. 找到右肾动脉, 并将其作为地标。
    请注意:由于腹主动脉瘤可能导致主动脉扭转, 调整探针角度, 垂直成像腹主动脉。对于内部控制, 应捕获右肾分支点的一张图像。
  7. 捕获感兴趣区域的 cine 循环, 显示腹主动脉的最大扩张 (图 3d, e)。
    请注意:主动脉瘤的定位在每个动物模型中各不相同。血管紧张素 ii 诱导小鼠主动脉扩张主要发生在主动脉上, 而 cacl2或弹性酶诱导小鼠主动脉下动脉瘤。

5. 后扫描鼠标护理和清洁

  1. 擦拭超声波凝胶, 用温水灌溉胸部或腹部, 轻轻擦拭小鼠干燥。
  2. 将鼠标返回到其保持架上, 保持在加热垫上。
  3. 关闭异氟烷蒸发器和o2罐。如果异氟醚水平较低, 请填充蒸发器。
  4. 用软布和异丙醇或戊二醛湿巾清洁超声波机、探针和平台。
  5. 下载扫描过程中收集的所有文件。
  6. 关掉超声波机。
  7. 这些老鼠从麻醉中恢复后, 返回动物房室。

6. 分析

  1. 胸主动脉图像分析
    1. 启动分析软件并打开超声波数据。一个分析软件的示例图像 (vevo lab 3.0.0) 如补充图 1所示。
    2. 从 cine 环路中选择一个主动超声图像进行测量 (图4 a、c、e、g和补充图 1)。
      请注意:此协议通常在一个 cine 循环中检测到6到7个检测信号。由于收缩期和舒张期的主动脉直径不同 (图 4a-g), 因此需要在心脏周期的一致阶段进行测量。系统是从 r 波定义到 t 波结束的。一般情况下, t 波在小鼠心电图中很难识别。因此, 收缩期的主动脉直径应在生理收缩期测量, 通过目视检查来定义 (图 4i)。主动脉最大扩张时的心脏期应该是收缩期中期。在心电图的 r 波上很容易定义端部舒张 (图 4i)。在区分心脏周期方面, 终末期舒张期的主动脉测量比收缩期中期的测量简单。
    3. 在主动脉腔的中心画一条线。此中心线将用于确保测量线与主动脉垂直 (图 4b、d和补充图 1)。
    4. 绘制垂直线, 通过中心线从腔内边缘到内缘在主动脉窦和最大上升主动脉水平 (图 4b, d和补充图 1)。
    5. 测量至少三个独立的心跳中的主动脉直径, 并计算测量的平均值。
      请注意:vevo2100 系统使用 vevo lab 分析软件测量主动脉尺寸。每个按钮的简要说明如下。测量模式 (补充图 1a): 必须为主动脉测量选择此模式。cine 循环的滑块 (补充图 1b): 超声波框架是使用此滑块选择的。跟踪距离 (补充图 1c): 使用此函数绘制中心线。线性距离 (补充图 1d): 使用此函数测量主动脉尺寸。
  2. 腹主动脉图像分析
    1. 启动分析软件并打开超声波数据。
    2. 从 cine 循环中选择要分析的主动脉图像 (图 4e, g)。
      请注意:与胸主动脉测量类似, 心脏循环可能会影响腹主动脉的直径和面积。测量应在心脏周期的一致阶段确定。
    3. 绘制一条穿过最大管径的线, 从血管腔的内缘到内缘 (图 4f, h)。
    4. 追踪主动脉腔内边缘的腔内 (图 4f, h)。
    5. 获取至少三个独立的心跳的主动脉测量, 并计算数据的平均值。

Representative Results

图 3 a 和图 3c 分别显示了非动脉瘤胸近端和腹主动脉的代表性超声图像。上升主动脉位于肺动脉旁边, 形成一个弯曲的管, 在拱形区域有三个分支: 无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉 (图 3a)。腹主动脉背处检测到下腔静脉 (图 3d)。图 3 b 和图 3 3 显示了胸部和腹主动脉瘤的代表性图像, 并与图 3 a 和图 3d 中的正常直径相比发生了深刻扩张 h, 分别。所有的超声波图像都是在终末期拍摄的。

在收缩期中段和终期 (图 4a、c、e、g)处拍摄了具有代表性的胸腔和腹主动脉超声图像。图 4b、d、f、h 显示了显示测量值的代表性图像。上升主动脉中心的绿线用于规范主动脉窦和上升主动脉直径 (图 4b, d)。垂直绘制线到主动脉窦 (黄线) 和最大上升主动脉直径 (红线) 的腔的两个内缘之间的绿线。收缩期和舒张期胸主动脉和腹主动脉的腔直径不同 (图 4a-h)。对于腹主动脉, 测量了主动脉最大直径 (红色) 和腔面积 (绿色) (图 4f,h)。监视器心电图的一个代表性图像如图4 i所示。心脏循环需要考虑准确的测量。端部舒张和收缩期分别用白色虚线和粉红色线表示。

为了验证该协议的准确性和重现性, 我们进行了一项试点研究。代表性胸主动脉超声和体外图像如图 5a所示。对于上升主动脉直径, 这些图像的直径没有重大差异 (超声波: 1.67 毫米与体外: 1.67 毫米)。由于主动脉窦在体外图像中很难看到, 主动脉窦直径没有在体内测量。该协议的间和内重现性如图 5b、c所示。为了确定潜在的变异性, 超声成像是由两个观察者独立进行的, 即由一位有经验的心脏病专家和一名没有经验的本科生在两个不同的日子里使用相同的老鼠 (n = 5)。所有点都位于图 5b、c中的平均值±1.96 sd 之间, 这表明此协议没有主要的观测器间或观察器内变量。

Figure 1
图 1: 工作站设置.该工作站包括麻醉诱导室、麻醉清除过滤器、加热平台、超声波凝胶和凝胶加热器。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 胸近端和腹主动脉成像探针放置的例子.探针位置为 (a) 右和 (b) 主动脉根的左副长轴视图, 上升和拱形区域, 和 (c) 腹主动脉的短轴视图。(d) 具有代表性的超声波系统监测图像。黑色箭头指示探头上的参考标记。黄色箭头指示参考标记的一侧。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 具有代表性的胸腹主动脉超声图像.(a) 从右侧的后长轴视图来看, 非动脉瘤和 (b) 动脉瘤上升主动脉。(c) 非动脉瘤上升主动脉, 从左侧的副轴长轴视图。(d) 非动脉瘤和 (e) 腹主动脉动脉瘤。asc o = 上升主动脉, ia = 非提名动脉, 生命周期 = 左颈动脉, lsa = 左锁骨下动脉, pa = 肺动脉下动脉, 窦 = 主动脉窦, ivc = 下腔静脉, 和 abd o = 腹主动脉。黄色三角形表示主动脉瘤。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 主动脉图像的测量.胸主动脉的图像在(a) 收缩期中期和 (c) 终末期拍摄。显示 (b) 收缩和 (d) 舒张期间胸近端主动脉区主动脉直径测量值的图像。绿线表示上升主动脉的中心。黄线和红线分别表示主动脉窦和上行主动脉的直径。黄色和红色的数字分别表示主动脉窦和上升主动脉的实际直径。腹主动脉的图像在 (e) 收缩期中期和 (g) 结束舒张处拍摄。显示 (f) 收缩期中段和 (h) 终末期主动脉测量值的图像。红线和绿线分别表示腹主动脉的直径和腔面积。红色和绿色的数字分别表示腹主动脉的实际直径和直径。(i) 监测图像采集过程中记录的心电图 (ecg)。绿色和黄色线分别表示心电图和呼吸周期。白色虚线表示终末, 紫色线表示收缩期。p = p 波和 r = r 波。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 超声成像的准确性和重现性.(a) c57bl/6j 雄性小鼠 (10-12) 胸主动超声和体外图像的代表性图像。bland-altman 图显示了本协议的 (b) 间和 (c) 观测器内变量。asc o = 上升主动脉, ia = 非命名动脉, 生命周期 = 左颈总动脉, lsa = 左锁骨下动脉, pa = 肺动脉, 和窦 = 主动脉窦。绿线表示上升主动脉的中心。黄线和红线分别表示主动脉窦和上行主动脉的直径。红色的数字表示在超声和体外图像中测量的上升主动脉的实际直径。黑色虚线表示平均值和平均值±1.96 sd. 请点击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 1
补充图 1: 超声分析软件的示例图像.超声波数据分析必须在 (a) 测量模式下进行。选择一张主动超声图像, 利用 (b) cine 环路的滑块从 cine 环路进行分析。中心线使用 (c) 跟踪的距离函数绘制。主动脉尺寸是通过 (d) 线性距离函数来测量的。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

该方案为利用高频超声系统获取小鼠胸主动脉和腹主动脉的图像提供了技术指南。超声主动脉成像具有潜在的混淆, 如探针位置和心脏循环, 这可能会损害主动脉测量的准确性, 特别是在胸近端主动脉。该协议描述了图像采集、测量和数据分析的详细说明和策略, 以便准确测量主动脉尺寸。

对于胸近端主动脉的成像, 有几种方法来探针放置。在本协议中, 右旁长轴视图用于超声成像。这种观点有助于从主动脉窦到主动脉弓部分获取高质量的图像。由于超声波的干扰, 它不是下降主动脉的最佳选择。该方案适用于大多数小鼠模型的胸主动脉瘤, 因为他们表现出腔扩张主要是在主动脉根部到上升主动脉。这包括慢性血管紧张素 ii. 输液, 导致小鼠 18,19,20,21,22,23的上升主动脉形成动脉瘤。马凡综合征小鼠模型 (纤维素 1C1041G/+和纤维素 1mgrgrmgr小鼠) 同时显示主动脉根和上升主动脉扩张 23,24,25。Loeys-Dietz 综合征小鼠模型 (在平滑肌细胞中产后删除 tgf-β受体1或 2) 也会在主动脉根部和上升主动脉出现动脉瘤18,26, 27,28.因此, 在这些胸主动脉瘤小鼠模型中, 右副长轴视图适用于主动脉成像。另一方面, 右后轴短轴视图有可能对角线捕捉主动脉图像, 因为动脉瘤往往因主动脉扭转而复杂化, 这可能会导致直径的高估。与胸主动脉不同的是, 在这一方案中, 短轴视图被用于腹主动脉的成像。由于腹主动脉的主动脉曲率和扭转率与胸主动脉相比是适度的, 因此在短轴视图中获取图像可以根据主动脉的直径进行改进。需要注意的是, 不同的探头位置提供不同的视角, 并且主动脉直径在每个视角中可能会有所不同。因此, 通过在研究中对所有图像应用相同的探头位置, 可以增强可靠的主动脉直径测量。有趣的是, 最近有29、30、31、32的三维 (3d) 心脏和主动脉超声图像被报道。此外, 当前的超声系统可以获得三维图像随着时间的推移作为四维图像33。因此, 这些三维成像技术有可能更精确地展示主动脉结构, 从而解决探针定位问题。

超声图像可以在二维亮度模式 (b 模式) 或一维运动模式 (m 模式) 下捕获。虽然有些文章使用 m 模式测量主动脉直径, 但 b 模式最好是 15、34、35、36.m 模式具有在两个维度中进行成像的能力, 以提高时间和空间分辨率。然而, 这种模式依赖于主动脉是一个同心圆柱体垂直成像到超声波的假设。这种假设在动脉瘤状态下可能不成立, 上升主动脉的曲率使这一困难, 即使在非动脉瘤状态下也是如此。此外, 在整个心脏周期37中, 主动脉并不保持固定位置。因此, m 模式可能会导致测量误差, 包括过度和低估。

还需要注意的是, 心脏循环会影响主动脉的腔直径。如预期的那样, 收缩期的主动脉直径大于舒张 (图 4a-h), 后者与主动脉壁弹性和应变有关。主动脉壁弹性和应变可以通过收缩期和舒张期主动脉直径的差异来计算。与正常主动脉31、34、35、38、39、40相比, 动脉瘤性主动脉的弹性和应变降低。主动脉僵硬不能通过超声波直接测量。测量脉冲波速 (pwv) 可以评估其作为代理的刚度, 据报道, 在动脉瘤性主动脉31、35、41、42 中, 刚度会增加。利用脉冲波多普勒图像及其对应的距离, 根据两个动脉部位之间的传输时间计算 pwv。与临床检查不同的是, 与临床检查不同的是, 小鼠主动脉测量的心脏相位没有严格的标准化。因此, 目前仍不清楚哪种心脏期适合主动脉测量。然而, 为了确保可靠和可重复的比较, 主动脉直径应测量在一个定义的阶段的心脏周期。

该协议为主动脉成像和数据分析提供了详细的指导, 以便准确测量主动脉尺寸。使用该协议进行的主动脉测量与实际的体外主动脉直径一致 (图 5a)。我们还证实了观察者间和内的重现性的一致性 (图 5b, c)。该协议中的所有步骤, 尤其是探头位置和心脏循环, 都是准确测量所必需的。然而, 即使使用适当的程序, 超声成像过程中的伪影也是不可避免的。肋骨和肺的位置, 以及呼吸和心脏脉动, 都会影响胸主动脉的图像质量。肠道气体也会导致腹部成像中的伪影。因此, 我们建议在主动脉图像不佳的情况下, 在遵循此协议时定义排除标准。

随着高分辨率超声系统的出现, 小鼠的主动脉结构可以进行精确的检查, 包括连续检查和常规检查, 从而极大地促进了对主动脉瘤的理解。超声成像, 与上述方案, 是一种可靠和可重复的无创方法, 定量的主动脉瘤在小鼠。

Disclosures

提交人没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者的研究工作得到了国家卫生研究院心脏、肺和血液研究所的支持, 该研究所的奖项编号为 r01hl133723 和 r01hl139748, 美国心脏协会 sfrn 在血管疾病方面 (18sfrn33960001)。h. s. 由 aha 博士后研究金 (18post33990468) 提供支持。j. c. 由 ncats ul1tr001998 提供支持。本手稿的内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
Isothesia (Isoflurane) Henry Schin NDC11695-6776-2 Anesthetic Agent
Omnicon F/Air Anesthesia Gas Filter Canister A.M. Bickford Inc. 80120 Scavenging System for Anesthesia
Puralube Vet Ointment Dechra NDC17033-211-38 Lubricating Eye Drops
Aquasonic  Parker Laboratories 01-08 Ultrasound Gel
Nair Nair Depilliating Cream
Transeptic Transducer Cleaning Solution Parker Laboratories 341-09-25 Cleaning spray for probes
Name of Equipment
Vevo 2100 VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Machine
Vevo LAB 3.0.0 VisualSonics Vevo LAB 3.0.0 Ultrasound Analysis Software
MS-550D VisualSonics MS-550D Ultrasound Probe
EX3 Vaporizer Patterson Veterinary EX 3 Analogue Anestheic Vaporizer
Heating Pad Sunbeam E12107 Heating Pad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Sawada, H., Chen, J. Z., Wright, B. C., Moorleghen, J. J., Lu, H. S., Daugherty, A. Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions. J. Vis. Exp. (145), e59013, doi:10.3791/59013 (2019).

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