Summary
在这里, 我们提出了一个在不使用高速离心的情况下分离 u937 细胞的质膜、细胞质和线粒体的方案。该技术可用于纯化亚细胞组分, 以便随后通过免疫印迹检查蛋白质定位。
Abstract
在该协议中, 我们详细介绍了在不使用超离心或不滥用洗涤剂的情况下获取 u937 细胞亚细胞分数的方法。该方法利用低渗缓冲液、数字素、机械裂解和差动离心分离细胞质、线粒体和质膜。这个过程可以扩大规模, 以满足研究人员的需求, 既便宜又直接。这种方法将使研究人员能够在没有专门离心机和商业试剂盒的情况下确定细胞中蛋白质的定位, 这两种方法的成本都高得令人望而却步。我们已经成功地使用这种方法分离人单细胞系 u937 中的细胞质、质膜和线粒体蛋白。
Introduction
在检查真核细胞中的分子途径时, 通常需要可靠地识别蛋白质定位。研究人员利用获得亚细胞组分的方法来更仔细地检查感兴趣的细胞成分。
大多数现有的细胞分馏方法一般分为两大类, 即基于洗涤剂的 1、2和基于超离心的3、4、5, 它们可以是以速度、精度和成本为区别。基于洗涤剂的协议依赖于使用具有不断增加的洗涤剂强度的缓冲液来溶解细胞的不同成分。这是一种快速方便的样品处理方法, 如果样品数量和大小较小, 则具有成本效益。以洗涤剂为基础的试剂盒可以从细胞中分离细胞质、膜细胞器 (混合组分) 和核组分。然而, 与这些试剂盒相关的一些缺点限制了他们对研究人员的有用性。它们旨在轻松分离单元的一个或两个组件, 但无法同时从样本中分离所有分数。洗涤剂的使用意味着质膜和膜封闭的细胞器将同样溶解, 因此, 无法相互分离。另一个复杂因素来自于这些试剂盒中的专有组件, 这些组件阻止研究人员更改特定应用的条件。最后, 它们的用途有限, 对于规模较大的实验来说可能费用高得令人望而却步。非洗涤剂为基础的试剂盒存在于线粒体的分离, 但是, 它们不是用来分离质膜的, 样品的收率明显低于密度离心分离协议6,7.
利用超离心获得分数的方法比基于洗涤剂的试剂盒更耗时, 但往往会产生更纯净的组分。要在不首先溶解细胞的情况下从细胞中分离等离子体膜 (导致膜细胞器污染), 需要用非洗涤剂方法对其进行裂解, 然后通过差异分离细胞成分离心--质膜分离需要 100, 000xg 的速度才能完成。在许多情况下, 差动离心之后必须进行等温密度梯度离心, 以进一步分离细胞组分或去除污染物。虽然这些方法是彻底和可修改的, 缺点包括成本, 时间消耗, 以及需要一个超离心分离的分数和进一步纯化通过密度梯度离心。大多数高速离心机的费用对个别调查人员来说是令人望而却步的, 而且往往是学术机构共享的核心设备。因此, 在这些情况下, 超离心机的可用性变得令人望而却步。
在这个分馏协议中, 我们证明了在不使用溶解性洗涤剂和不高速离心的情况下分离亚细胞分数。这种方法将使研究人员能够分离真核细胞的质膜、线粒体和细胞质成分, 并将分数之间的污染降至最低。
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Protocol
1. 准备缓冲器和试剂
注: 请参见表 1。
- 准备缓冲液 a、裂解缓冲液 b、样品缓冲液和数字宁的溶液。
- 加入 8.77 g 的氯化钠和50毫升的 hepes (1 m, ph 7.4) 到900毫升去离子水, 用去离子水将最终体积调整为1升。
注: 最终浓度为 150 mm 氯化钠和 50 mm hepes。 - 加入20毫升的 hepes (1 m, ph 7.4) 制备裂解缓冲液 b, kcl 0.75 g, mgcl2, 2 ml 乙二胺四乙酸 (0.5 m edta), 2 毫升乙二醇乙基乙基 (β-氨基乙醚)-n, n, n '-四乙酸 (0.5 m egta), 38.26 克甘露醇和23.96 克蔗糖至900毫升去离子水, 用去离子水将最终体积调整为1升。
注: 最终浓度为 20 mm hepes、10 mm kcl、2 mm mgcl 2、1mm edta、1 mm egta、210 mm 甘露醇和 70 mm 蔗糖。 - 将 0.01 g 十二烷基硫酸钠 (sds) 加入10毫升的三缓冲盐水 (tbs), 最终浓度为 0.1% sds, 从而制备样品缓冲液。
- 在去离子水的100毫升中加入25毫克的数字素 (最终浓度为 250μg/ml), 准备一个数字素的库存溶液。
- 将所有缓冲液存储在 4°c, 将数字素存储在-20°c, 直到实验开始。
- 加入 8.77 g 的氯化钠和50毫升的 hepes (1 m, ph 7.4) 到900毫升去离子水, 用去离子水将最终体积调整为1升。
- 准备新的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的解决方案, 添加到缓冲溶液之前添加到细胞。
- 将17.4 毫克的 pmsf 添加到100% 乙醇的1毫升 (最终浓度为 100 mm), 制备苯甲磺酰氟化硫 (pmsf) 的库存溶液。
注意: 在处理 pmsf 时, 请佩戴适当的防护设备并谨慎行事。私营军事和废物管理基金在摄入时具有危险性, 在皮肤接触 (刺激性)、眼神接触 (刺激性) 或吸入的情况下具有轻微危险;它对眼睛和皮肤有腐蚀性。 - 根据制造商的说明准备一种市售的蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (100x) (参见材料表)。
- 在去离子水的1毫升中加入92毫克的 sov (最终浓度为 500 mm), 制备正奥瓦酸钠 (sov) 的库存溶液。
注意: 请佩戴适当的防护设备, 并在操作时小心操作。在眼睛接触 (刺激物)、摄入或吸入的情况下, sov 是危险的。严重的过度接触会导致死亡。
- 将17.4 毫克的 pmsf 添加到100% 乙醇的1毫升 (最终浓度为 100 mm), 制备苯甲磺酰氟化硫 (pmsf) 的库存溶液。
2. 公共安全
- 在分馏前, 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中浓缩和清洗细胞。
- 以适当的速度离心细胞悬浮液, 以形成颗粒。例如, 离心机将 u937 细胞悬浮在400xg 下 10分钟。
- 取出上清液, 在室温 pbs 中重新悬浮细胞颗粒, 最终浓度为 4x106 cells/mL, 轻轻将移液器分解团块。
- 以400xg 离心细胞悬浮液 10分钟以植入细胞。
- 在最终浓度为 2x107 细胞的情况下, 取出上清液并在冰冷缓冲液 a 中重新悬浮细胞颗粒。
注: 所有后续步骤应在4°c或冰上执行, 所有缓冲器应预先冷却。
3. 细胞蛋白分离
- 用洗涤剂的数字素孵育提取细胞质蛋白。
- 紧接细胞重新悬浮之前 (步骤 3.1.3) 添加10μl 的库存永磁同步体 (100 mm), 10μl 蛋白酶抑制剂 (100x)、2μl 股票 sov (500 mm) 和100μl 的股票数尼宁 (250μg/ml) 至878μl 缓冲液 a (最终浓度为 1 mm pmsf), 1x 蛋白酶抑制剂, 1mm sov 和25μgml 数联宁;根据所使用的单元格数调整最终卷)。将溶液放在冰上, 直到细胞颗粒的加入。
- 将细胞悬浮液在 400xg下离心 10分钟, 并去除上清液。
- 在液相缓冲液中重新注射细胞颗粒含有抑制剂和数字素 (3.1.1 步骤制备) 的溶液, 最终浓度为 2x107 细胞, 轻轻地将移液器分解团块。
- 在4°c 下将细胞悬浮液在端端旋转器上培养20分钟。
- 将细胞悬浮液以400xg 离心 10分钟, 收集上清液, 并将其放入干净的离心管中。
- 以 18, 000xg 离心收集的上清液 20分钟, 以颗粒细胞碎片。
- 将上清液转移到干净的离心管中。
- 重复步骤3.1.5 和 3.1.6, 直到离心后没有获得颗粒。
- 收集含有细胞质蛋白的上清液, 并将其储存在 4°c (短期) 或-20°c (长期)。
- 通过离心去除多余的数字蛋白和细胞质蛋白。
- 在最终浓度为 4x10 6 细胞的情况下, 将具有数字渗透性的细胞颗粒 (从步骤 3.1.5)重新注入缓冲液 a 中, 轻轻将团块分解。
- 将数字渗透电池悬浮液在 400xg下离心 10分钟, 并去除上清液。
注: 可以在缓冲液 a 中重复清洗, 以去除多余的细胞质污染物。
4. 细胞同质化
- 将细胞在冰上的裂解缓冲液 b 中培养, 并通过机械方法裂解。
- 在细胞重新悬浮之前 (步骤 4.1.2), 将10μl 的库存 pmsf (100 mm) 和2μl 的库存 sv (500 mm) 添加到988μl 的裂解缓冲液 b (最终浓度为 1 mm pmsf 和 1 mm sov; 调整最终体积, 以适应被裂解的细胞数量), 并保持独奏在冰上, 直到细胞颗粒的补充。
- 在含有 pmsf 和 sov 的冰冷裂解缓冲液 b 溶液中, 在 14x106 细胞的最终浓度下, 将细胞颗粒 (从步骤 3.2.2) 重新沉淀。
- 在冰上培养细胞悬浮液30分钟。
- 将细胞悬浮液转移到冰上的预冷的盎司均质机 (带紧固的 b 穿山甲), 并使用缓慢、均匀的行程与均质机穿手一起执行40次传球。
注: 或者利用讨论部分详述的其他机械细胞裂解方法。 - 收集均质, 并将其转移到一个干净的离心管。
- 用小体积 (1 至2毫升) 的裂解缓冲液 b 清洗均质机的孔和管, 并将其添加到均质化体中。
- 以 400xg (或颗粒未碎细胞所需的最小速度) 离心均匀度10分钟。
- 将上清液转移到干净的离心管中。
注意: 如果一个重要的颗粒仍然重复步骤4.1.4 通过 4.1.6, 以提高分数的产量, 详见讨论部分。协议可以在这里暂停, 在4°c 下短期 (24小时) 储存。
5. 差动离心
- 以越来越快的速度离心均质体, 以去除细胞碎片, 分离线粒体和膜组分。
- 将上清液 (从步骤 4.1.8) 以500xg 离心 10分钟 , 将上清液转移到干净的离心管中, 并丢弃任何颗粒。
- 以 1, 000x g离心上清液 (从步骤 5.1.1) 10分钟, 将上清液转移到干净的离心管中, 并丢弃任何颗粒。
- 将上清液 (从步骤 5.1.2 )以 2, 000xg 离心 10分钟, 将上清液转移到干净的离心管中, 并丢弃任何颗粒。
- 将上清液 (从步骤 5.1.3 )以 4, 000xg 离心 15分钟, 将上清液转移到干净的离心管中,保持颗粒中含有线粒体。
- 在小体积 (0.5 \ e20120121 ml) 的裂解缓冲液 b 中再利用线粒体颗粒。
- 以 4, 000xg 离心悬浮颗粒 15分钟 , 取出上清液, 并在所需的最后粒量样品缓冲液中重新悬浮线粒体颗粒 (例如, 250 至 500μl, 视颗粒的大小和所需的颗粒大小而定浓度)。
- 将上清液 (从步骤 5.1.4) 以 4, 000xg 离心 15分钟, 将上清液转移到干净的离心管中。重复此步骤, 直到离心后没有获得颗粒。
- 旋转上清液在 18, 000xg 3小时。
- 去除上清液, 并保持颗粒含有膜蛋白。将膜颗粒重新循环到小体积 (0.5–1 ml) 的裂解缓冲液 b 中。
- 以 18, 000xg 离心悬浮颗粒 1小时 。
- 取出上清液, 并在所需的最终样品缓冲液体积 (250 至 500μl, 取决于颗粒的大小和所需的浓度) 中重新悬浮膜颗粒。
- 在功率设置为 5 (20千赫的 125 w 最大功率的 50%, 见材料表) 的情况下, 在冰浴中对样品颗粒进行3秒的取样。
- 将样品存放在 4°c (短期) 或-20°c (长期)。
- 通过对细胞的细胞质、线粒体和膜隔间中的蛋白质标记物进行抗体检测样品的纯度 (参见具有代表性的结果部分)。
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Representative Results
利用上面详细的协议和图 1所示的协议, 成功地完成了悬浮液中生长的未分化 u937 8 细胞的成功分馏。用这种方法获得的样品采用湿法转移到聚偏氟乙烯 (pvdf) 膜上进行了西方印迹9 。随后用细胞质、线粒体和膜局部蛋白标记抗体对膜进行了检测 (图 2,图 3,图 4)。成功提取细胞质蛋白可以通过探测与抗体对抗细胞质蛋白甘油-3-磷酸脱氢酶10 (gapdh) 的印迹来验证, 该酶通常定位到细胞的细胞质。如免疫印迹所示 (图 2; 底部面板, 第1和2号车道), gapdh 仅在提取的数字素样本中发现, 在 4, 000xg 颗粒 (图 4; 底部面板上的通道3和 4) 中没有观察到污染。g颗粒 (图 4; 底部面板上的5号和6号车道)。对电压依赖性阴离子通道 (vdac) 的探索, 即一种定位于外线粒体膜11的蛋白质,显示了 4, 000xg 颗粒中线粒体的成功分离 ( 图 4; 中间的通道3和 4)面板), 而在其他分数中没有这种蛋白质, 表明在 18 , 000xg 颗粒或数字提取样本中没有线粒体污染。对 n\ k-atpase α1亚基的探测, 主要是在质膜12 中发现的整体膜杂二聚体的一部分, 显示了这种蛋白质的大部分位于 18 , 000xg 颗粒中 (顶部图 4; 车道5和 6)面板)。这种蛋白质也被检测到在 4, 000xg 颗粒 (图 4; 车道3和4的顶部面板), 表明可能与质膜污染, 虽然这种可能性是不可能的低速度, 以获得这种颗粒。一个更合理的解释是, 4, 000xg 颗粒样本中存在内质网 ( er), 研究人员13已证明了 na、k-atpase 子单元从 er 到质膜的迁移。在数码素提取的样本中缺乏 na, k-atpase α1蛋白 (图 4; 顶部面板上的车道1和 2) 表明了这一分数的纯度。
与成功分馏过程中观察到的结果不同 (图 2), 协议的不正确执行可能会导致细胞组件的交叉污染 (图 3,图 4)。与 18, 000xg 颗粒 (图 3 {顶板, 第2-3条线] 和图 4b [顶面板, 车道 5-12] 相比, 4, 000xg 颗粒中的 na、k-atpase α-1 蛋白浓度较高, 表明细胞器部分具有被质膜蛋白污染了gapdh 在数字提取的细胞质样本以外的任何部分 (图 3 [底部面板, 车道 4] 和图 4a [底部面板, 车道 5-12] 中的存在是在随后的步骤中未能去除细胞质蛋白的指示器。
图 1: 细胞分馏协议的示意图.作为流程图表示的单元分馏协议的概述。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 成功分离 u937 细胞细胞质、有机细胞和膜组分.从两个 u937 细胞培养物中分离出的西方细胞分数, 并对膜 (na, k-atpase α1, 顶板)、线粒体 (vdac, 中间面板) 和细胞质 (gapdh, 底板) 的标记进行了探测。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 未能对 u937 单元组件进行分馏.从单个 u937 细胞培养中分离出的西方细胞分数斑点, 显示细胞器分数 (车道 2) 与 na, k-atpase α1 (顶板) 污染, 细胞质成分丢失到膜颗粒的上清液 (车道 4)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 分馏过程中细胞质和膜成分的交叉污染.(a) 分离尝试与细胞质交叉污染的 gapdh 在细胞器 (底部面板, 车道 5-8) 和膜分数 (底部面板, 车道 9-12)。(b) 线粒体分数 (顶板, 车道 5-8) 中钠、k-atpase 的质膜污染的分馏尝试。请点击这里查看此图的较大版本.
| 名字 | 成分 (库存浓度) | 最终浓度 |
| 缓冲区 a | 氯化钠 (150 mm) 和 hepes (50 mm) | 1x (与库存相同) |
| 裂解缓冲器 b | hepes (20 mm)、kcl (10 mm)、mgcl 2 ( 2 mm)、edta (1 mm)、egta (1 mm)、mannitol (210 mm) 和 susurose (70 mm) | 1x (与库存相同) |
| 样品缓冲器 | 十二烷基硫酸钠 (0.1%) | 1x (与库存相同) |
| 数字激素 | 去离子水中的 digitonin (250μggsml) | 25μgml |
| 苯基甲基磺酰氟 | 100% 乙醇中的苯甲磺酰氟 (100 mm) | 1米 |
| 蛋白酶抑制剂鸡尾酒 | 不同 (请参阅制造商产品表) | 1x |
| 奥托瓦纳丁钠 | 去离子水中的正交钠 (500 mm) | 1米 |
表 1: 缓冲器和解决方案.程序的缓冲区和所需解决方案的组成。
| 协议步骤 | 关键因素 | 解释 | 潜在问题 | 可能的解决方案 |
| 细胞制备 | 细胞浓度 | 为了获得最佳的结果, 必须根据经验确定所使用的细胞类型所能处理的细胞的最佳浓度。 | 高浓度细胞悬浮液可能导致低效率的裂解, 导致线粒体和膜组分的低产量。 | 执行一系列细胞浓度的初始过程, 以确定最佳结果。 |
| 细胞的预处理 | 细胞必须处于悬浮状态的分馏过程中, 这需要从培养表面或均质组织中分离粘附细胞。 | 处理效率低下可能导致分数低、亚细胞分数之间的交叉污染或其他意外结果。 | 确保所使用的方法为该过程生成足够的单元格。对悬浮液中的细胞进行计数, 以确定加工后的浓度, 并进行相应调整。 | |
| 如果所采用的方法破坏了质膜, 可能会发生过早裂解, 导致分数交叉污染。 | 通过避免破坏细胞的方法, 确保在细胞收获过程中保持质膜的完整性。通过在显微镜下检查含有膜不透性染料 (如 trypan blue) 来验证膜的完整性。 | |||
| 细胞蛋白分离 | 数码素浓度 | 必须确定数字蛋白的最佳浓度, 以避免细胞裂解, 同时仍然允许通过毛孔形成细胞蛋白提取。 | 高浓度的数字蛋白可能会导致膜破裂、细胞裂解和细胞质部分的污染。次优浓度将导致细胞质蛋白的提取效率低下, 并可能对后续分数造成交叉污染。 | 如果观察到过量的细胞裂解, 应该降低数字素的浓度。在数宁培养后获得的小细胞颗粒可能表明膜破裂和细胞裂解。 |
| 萃取后清洗 | 必须从渗透细胞中去除数字蛋白和细胞质蛋白, 以避免交叉污染。 | 细胞质提取后未能充分清洗细胞, 可能会导致细胞质蛋白延续到其他部分。 | 在数宁培养后, 额外的缓冲 a 清洗会稀释数字蛋白和剩余的细胞质蛋白。 | |
| 线粒体分离 | 细胞裂解 | 裂解方法必须彻底释放细胞内容物, 同时保持线粒体完整性, 以便随后进行分离。 | 细胞的机械裂解可能效率低下, 使细胞保持完整, 并导致线粒体蛋白的低产量。 | 对于不同的细胞类型, 必须根据经验确定裂解细胞和释放线粒体所需的力量量。裂解步骤后获得的大颗粒 (以及小线粒体和膜颗粒) 可能表明裂解不理想。增加力量 (刺中风, 针道等), 以尽量减少裂解后的颗粒。 |
| 过多的机械力可能会使线粒体溶解, 用线粒体膜蛋白污染质膜部分。 | 如果在膜样本中发现线粒体蛋白标记物, 则会降低受力。 | |||
| 清除碎片 | 溶解后必须从均质体中取出完整的细胞和较大的碎片, 以避免污染线粒体样品。 | 如果在对线粒体进行造粒之前没有清除碎片和完整的细胞, 线粒体样本可能会受到细胞质成分或质膜蛋白的污染。 | 增加线粒体分离自旋前的低速离心步骤的数量。如果线粒体产量低, 可能需要从低速旋转中拯救颗粒, 并通过西方印迹检查线粒体标记。 | |
| 隔离后清洗 | 线粒体样品应彻底清洗, 以清除可能与它们一起产生颗粒的污染碎片。 | 细胞碎片可能聚集并与线粒体相关, 导致细胞质或膜蛋白的交叉污染。 | 确保用缓冲液充分清洗颗粒, 以去除污染物。 | |
| 膜分离 | 离心时间 | 离心时间可能需要延长, 以提高膜分数样品的收率。 | 根据加工细胞的总数和细胞裂解的效率, 膜分数样品的收率可能较低。 | 增加离心时间可提高质膜组分的产率。虽然建议的时间是足够的大的开始数量的细胞, 更长的时间可能是必要的较小的数量。 |
表 2: 关键步骤.协议步骤、潜在问题和协议疑难解答的可能解决方案的摘要表。
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Discussion
该方案的发展源于无法分离线粒体和膜样本, 使用商业上可获得的试剂盒, 以分析在坏死14期间的蛋白质定位.预制试剂盒的主要局限性是, 它们无法适应个别研究人员的需要, 每个样本的费用有限, 能够加工的样品数量有限。这里介绍的方法可以在不使用昂贵的试剂的情况下进行, 也不需要昂贵的设备。这种方法可以进行缩放, 以容纳任意数量的细胞, 并能够进行修改, 以适应研究人员的需要。这样可以提高每个分数的产量, 根据正在进行的研究量身定制步骤, 并在方法的执行中具有灵活性。如果研究人员不研究最终样品中蛋白质的磷酸化状态, 则可以省略在缓冲液中添加正奥瓦那酸钠。如果研究人员希望通过密度梯度离心进一步净化样品, 同样可以省略将 sds 纳入最终缓冲液。虽然我们只使用这种方法来成功地分割 u937 细胞, 一个非粘附单核细胞系, 该程序应该适用于多个细胞系和组织, 有轻微的改变。在悬浮液中生长的细胞可以像这里详细介绍的 u937 细胞一样被颗粒状, 而粘附细胞系在开始这一协议之前需要与生长表面分离。同样, 在含有细胞的分馏之前, 组织必须彻底同质化。这可以通过使用松散的装配盎司均质机, 一个波特-埃尔维赫杰姆玻璃-聚四氟乙烯均质机或通过其他 (商业) 方法15来实现。
协议中有许多关键步骤需要仔细注意才能获得最佳结果和纯分数 (表 2)。这里推荐的细胞浓度 (步骤2.1.2、2.1.4、3.1.3、3.2.1 和 4.1.2) 是 u937 细胞特有的, 是通过试验和错误确定的。如果在执行协议时获得的结果并不理想, 则可能需要调整这些值以适应不同类型的单元格。在细胞质提取步骤 (步骤 3.1) 中, 在不完全裂解细胞的情况下, 数宁的浓度必须足以渗透质膜。在此孵育之后, 必须彻底清洗细胞, 以去除随后步骤中的细胞质蛋白, 否则下游样品中就会出现交叉污染 (图 4 a)。同质化步骤 (步骤 4.1.4) 可以通过任何形式的机械裂解来完成, 尽管这里给出的结果是通过弹跳均质机获得的。使用裂解均质机的另一种方法是反复通过狭窄的细针 (建议使用 27 g, 20-40 次), 直到达到足够的细胞裂解。如果在均质后获得大量未破细胞的颗粒 (步骤 4.1.7), 则可能有必要增加中风 (或注射器通过) 的次数。研究人员可能需要确定被分割的细胞类型的最佳均质量。在均质化后, 必须彻底清除细胞碎片, 以避免用质膜成分污染细胞器部分 (图 4b)。如果发生这种情况, 应执行额外的低速离心步骤, 以清除细胞碎片。在该方法的开发过程中, 在 18, 000xg 的离心过程中进行了测试, 在3小时旋转时, 质膜产率增加最小 (图 2, 车道 5-6)。研究人员可能会发现有必要增加离心时间, 以获得更好的质膜样品的产量。
与涉及超离心的更彻底的纯化方法相比, 这里介绍的方法是有限的。如果不使用等视胶密度离心, 就不可能分离细胞均匀后获得的单个细胞器。虽然 4, 000xg 组分含有线粒体 (vdac 的存在,图 2就证明了这一点), 但它们也可能含有 er、golgi 和其他细胞内细胞器. 如果这对正在进行的研究很重要, 则应通过使用其他细胞器蛋白质标记物的额外抗体来验证细胞器的部分。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突
Acknowledgments
nih-1r15hl13565-01 为 timothy j. lrocca 提供了支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
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