Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.
Abstract
In dit protocol detail wij een werkwijze te halen subcellular breuken van U937 cellen zonder het gebruik van ultracentrifugatie of willekeurige detergentia. Deze methode maakt gebruik van hypotone buffers, digitonin, mechanische lysis en differentiële centrifugeren te isoleren van het cytoplasma, de mitochondriën en het plasma membraan. Het proces kan worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van de onderzoekers, is goedkoop en eenvoudig. Deze methode zal toelaten onderzoekers om te bepalen van de lokalisatie van de eiwitten in cellen zonder gespecialiseerde centrifuges en zonder het gebruik van commerciële kits, die beide onbetaalbaar worden kunnen. We hebben met succes gebruikt deze methode om te scheiden cytosolische, plasmamembraan en eiwitten mitochondriaal in de menselijke monocyt cellijn U937.
Introduction
Betrouwbare identificatie van eiwit lokalisatie is vaak noodzakelijk, bij het onderzoek van moleculaire pathways in eukaryote cellen. Methoden om te verkrijgen subcellular breuken worden gebruikt door onderzoekers nauwer onderzoeken cellulaire componenten van belang.
Het merendeel van de bestaande cel fractionering methoden in het algemeen vallen in twee brede categorieën, wasmiddel gebaseerde,1,2 en ultracentrifugatie gebaseerde,3,4,5, die kunnen worden onderscheiden zich door snelheid, precisie en kosten. Wasmiddel gebaseerde protocollen, is afhankelijk van het gebruik van buffers met toenemende wasmiddel kracht om te solubilize van de verschillende onderdelen van de cel. Dit kan is een snelle en handige methode voor het verwerken van monsters en kosteneffectief als het aantal en de grootte van de monsters klein zijn. Wasmiddel-gebaseerde kits kunnen worden gekocht om te isoleren cytoplasmatische membraan/organel (gemengde fractie) en nucleaire breuken uit cellen. Echter, verschillende nadelen verbonden aan deze kits beperken hun nut voor de onderzoekers. Ze zijn ontworpen om te isoleren gemakkelijk een of twee onderdelen van de cel, maar zijn niet in staat om alle breuken uit een steekproef gelijktijdig te isoleren. Het gebruik van detergentia betekent dat het plasmamembraan en membraan-omsloten organellen even zal worden solubilized en dus niet van elkaar worden gescheiden. Een extra complicatie ontstaat uit de eigen componenten in deze kits die verhindert dat onderzoekers wijziging van de voorwaarden voor specifieke toepassingen. Tot slot, ze zijn beperkt in aantal toepassingen en kunnen worden onbetaalbaar voor grotere schaal experimenten. Non-wasmiddel gebaseerde kits bestaan voor de isolatie van mitochondriën, echter ze zijn niet ontworpen om te isoleren plasmamembraan en de opbrengst van het monster is aanzienlijk minder dan die van dichtheid centrifugeren op basis van isolatie protocollen6,7 .
Methoden die gebruikmaken van ultracentrifugatie voor breuken zijn meer tijdrovend, maar vaak resulteren in zuiverder breuken dan wasmiddel-gebaseerde kits. Zij worden door een niet-wasmiddel-methode die gevolgd wordt door een scheiding van cellulaire componenten via differentiële lysed moeten plasma membranen van cellen isoleren zonder eerste solubilizing hen (wat resulteert in verontreiniging met membraan organellen) centrifugeren — met plasmamembraan isolatie vereisen snelheden van 100.000 × g te bereiken. In veel gevallen moet de differentiële centrifugeren worden gevolgd door isopycnic dichtheid kleurovergang centrifugeren voor verdere scheiding van cellulaire breuken of verwijdering van verontreinigende stoffen. Terwijl deze methoden grondige en aanpasbaar zijn, zijn nadelen kosten, tijd consumptie en de noodzaak van een ultracentrifuge voor scheiding van breuken en verdere zuivering via dichtheid kleurovergang centrifugeren. Meeste high-speed centrifuges zijn tegen een kostprijs die is onbetaalbaar voor individuele onderzoekers en zijn vaak gedeeld, core apparatuur op academische instellingen. Zo wordt de ultracentrifuge beschikbaarheid onbetaalbaar is in deze situaties.
In dit protocol fractionering tonen wij de isolatie van subcellular breuken zonder het gebruik van solubilizing van detergentia en zonder hoge snelheid centrifugeren. Deze methode zal toelaten onderzoekers te isoleren van het plasmamembraan, de mitochondriën en de cytoplasmatische onderdelen van een eukaryote cel met minimale besmetting tussen breuken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prepareer Buffers en reagentia
Opmerking: Zie tabel 1.
- Bereid oplossingen van buffer A, lysis-buffermengsel B, monster buffer en digitonin.
- Bereiden buffer A door toe te voegen 8.77 g NaCl en 50 mL HEPES (1 M, pH 7.4) tot 900 mL gedeïoniseerd water, aanpassen eindvolume tot 1 L met gedeïoniseerd water.
Opmerking: Eindconcentraties zijn 150 mM NaCl en 50 mM HEPES. - Bereiden van lysis-buffermengsel B door toevoegen van 20 mL HEPES (1 M, pH 7.4), 0,75 g van KCl, 0,19 g MgCl2, 2 mL ethyleendiamminetetra zuur (EDTA 0.5 M), 2 mL ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (0.5 M EGTA) , 38.26 g van mannitol en 23.96 g van sacharose tot 900 mL gedeïoniseerd water, aanpassen eindvolume tot 1 L met gedeïoniseerd water.
Opmerking: Eindconcentraties zijn 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, mannitol 210 mM en 70 mM sacharose. - Voorbereiden op monster buffer door toevoeging van 0,01 g natrium dodecyl sulfaat (SDS) tot 10 mL tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) een eindconcentratie van 0,1% SDS.
- Bereid een stockoplossing van digitonin door 25 mg digitonin toe te voegen aan 100 mL gedeïoniseerd water (eindconcentratie is 250 µg/mL).
- Sla alle bufferoplossingen bij 4 ° C en digitonin bij-20 ° C tot de start van het experiment.
- Bereiden buffer A door toe te voegen 8.77 g NaCl en 50 mL HEPES (1 M, pH 7.4) tot 900 mL gedeïoniseerd water, aanpassen eindvolume tot 1 L met gedeïoniseerd water.
- Bereiden van verse oplossingen van protease en phosphatase inhibitors aan bufferoplossingen vóór toevoeging aan cellen worden toegevoegd.
- Bereiden van een stamoplossing van phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) door 17.4 mg PMSF toe te voegen tot 1 mL ethanol 100% (eindconcentratie is 100 mM).
Let op: Draag geschikte beschermende uitrusting en oefening voorzichtigheid bij hantering van de PMSF. PMSF is gevaarlijk indien ingeslikt en nauwelijks gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), contact met de ogen (irriterend) of inhalatie; het is corrosief voor de ogen en huid. - Bereiden van een commercieel beschikbare protease inhibitor cocktail (100 ×) volgens instructies van de fabrikant (Zie de Tabel van de materialen).
- Voorbereiden van een stamoplossing van natrium orthovanadate (SOV) door toevoeging van 92 mg SOV aan 1 mL gedeïoniseerd water (eindconcentratie is 500 mM).
Let op: Draag geschikte beschermende uitrusting en wees voorzichtig bij het hanteren. SOV is gevaarlijk in geval van contact met de ogen (irriterend), ingestie of inhalatie. Ernstige overmatige blootstelling kan resulteren in de dood.
- Bereiden van een stamoplossing van phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) door 17.4 mg PMSF toe te voegen tot 1 mL ethanol 100% (eindconcentratie is 100 mM).
2. PBS Wash
- Concentreer je en wassen van cellen in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vóór fractionering.
- Centrifuge celsuspensie op een juiste snelheid maken een pellet. Bijvoorbeeld centrifugeren een suspensie van U937 cellen bij 400 × g gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer cel pellet in kamertemperatuur PBS op een eindconcentratie van 4 × 10-6 cellen/mL en pipet zachtjes te breken van de bosjes.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten naar pellet cellen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in ijskoude buffer A op een eindconcentratie van 2 × 107 cellen/mL.
Opmerking: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C of op ijs en alle buffers moet vooraf gekoeld.
3. cytosolische eiwit isolatie
- Uittreksel cytosolische eiwitten door incubatie met het wasmiddel digitonin.
- Onmiddellijk voorafgaand aan resuspensie van cellen (stap 3.1.3) Voeg 10 µL van voorraad PMSF (100 mM), 10 µL van protease Inhibitor (100 ×), 2 µL van voorraad SOV (500 mM) en 100 µL van stock digitonin (250 µg/mL) met 878 µL van buffer A (eindconcentraties zijn 1 mM PMSF , 1 × proteaseinhibitor, 1 mM SOV en 25 µg Mo/mL digitonin; aanpassen van het eindvolume volgens het aantal cellen wordt gebruikt). Bewaar deze oplossing op ijs tot toevoeging aan cel pellet.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Resuspendeer de pellet cel in A Bufferoplossing met remmers en digitonin (bereid in stap 3.1.1) op een eindconcentratie van 2 × 107 cellen/mL pipet zachtjes te breken van de bosjes.
- Incubeer de celsuspensie op een eind over rotator bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 min. verzamelen het supernatant en breng dit in een schone centrifugebuis.
- Centrifugeer het verzamelde supernatant bij 18.000 × g gedurende 20 min naar pellet cellulaire puin.
- Het supernatant overbrengen in een schone centrifugebuis.
- Herhaal de stappen 3.1.5 en 3.1.6 om geen pellet wordt verkregen na centrifugeren.
- Het supernatant de cytosolische eiwitten bevattende diervoeders te verzamelen en op te slaan bij 4 ° C (korte termijn) of -20 ° C (lange termijn).
- Verwijder overtollige digitonin en cytosolische eiwitten door middel van centrifugeren.
- Resuspendeer de pellet digitonin-permeabel cel (uit stap 3.1.5) in A buffer op een eindconcentratie van 4 × 10-6 cellen/mL en pipet zachtjes te breken van de bosjes.
- Centrifugeer de digitonin-permeabel celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
Opmerking: Herhaalde wast in buffer A kunnen worden uitgevoerd om te verwijderen van de overtollige cytosolische contaminanten.
4. de homogenisering van de cel
- Incubeer de cellen op het ijs in lysis-buffermengsel B en lyse hen door mechanische middelen.
- Onmiddellijk voorafgaand aan resuspensie van cellen (stap 4.1.2) 10 µL van voorraad PMSF (100 mM) en 2 µL van voorraad SOV (500 mM) toevoegen aan 988 µL van lysis buffer B (eindconcentraties zijn van 1 PMSF en 1 mM SOV; aanpassen eindvolume zodat aantal wordt lysed cellen) en houden solu tion op ijs tot toevoeging aan cel pellet.
- Resuspendeer de pellet van de cel (uit stap 3.2.2) in ijskoude lysis buffer B oplossing met PMSF en SOV (bereid in stap 4.1.1) op een eindconcentratie van 4 × 106 cellen/mL.
- Incubeer de celsuspensie op ijs gedurende 30 minuten.
- De celsuspensie overbrengen in een vooraf gekoeld Dounce homogenizer (met een strakke B stamper) op ijs en 40 passen uit te voeren met de stamper van de homogenizer met behulp van traag, zelfs lijnen.
Opmerking: Als alternatief gebruik maken van andere middelen van lysis van de cel van de mechanische zoals beschreven in de sectie discussie. - Het homogenaat verzamelen en overbrengen naar een schone centrifugebuis.
- Wassen van de stamper van de homogenizer en de buis met een kleine hoeveelheid (1 tot 2 mL) lysis-buffermengsel B en toevoegen aan het homogenaat.
- Centrifugeer het homogenaat op 400 × g (of de minimale snelheid vereist voor de pellet ongebroken cellen) gedurende 10 minuten.
- Het supernatant overbrengen in een schone centrifugebuis.
Opmerking: Als een belangrijke pellet Herhaal stap 4.1.4 via 4.1.6 blijft te verhogen van het rendement van breuken als beschreven in de sectie discussie. Het protocol kan hier worden onderbroken, en het homogenaat opgeslagen bij 4 ° C voor korte termijn (24 h).
5. differentiële centrifugeren
- Centrifugeer het homogenaat op het verhogen van de snelheden cellulaire puin, isoleren mitochondriën en membraan breuken te verwijderen.
- Centrifugeer het supernatant (uit stap 4.1.8) bij 500 × g gedurende 10 min. overdracht supernatant aan een schone centrifugebuis, en gooi een pellet.
- Centrifugeer supernatant (uit stap 5.1.1) bij 1000 × g voor 10 min. overdracht de bovendrijvende substantie aan een schone centrifugebuis, en gooi een pellet.
- Centrifugeer het supernatant (uit stap 5.1.2) bij 2.000 × g gedurende 10 min. de bovendrijvende vloeistof overdracht aan een schone centrifugebuis, en gooi een pellet.
- Centrifugeer het supernatant (uit stap 5.1.3) bij 4.000 × g gedurende 15 min. overdracht supernatant aan een schone centrifugebuis houden pellet met mitochondriën.
- Resuspendeer de pellet mitochondriën in een klein volume (0.5\u20121 mL) van lysis-buffermengsel B.
- Centrifugeer de gesuspendeerde pellet bij 4.000 × g gedurende 15 min. verwijderen het supernatant en resuspendeer de mitochondriale pellet in het gewenste eindvolume van monster buffer (bijv., 250 tot 500 µL, afhankelijk van de grootte van de pellet en gewenst concentratie).
- Centrifugeer het supernatant (uit stap 5.1.4) bij 4.000 × g gedurende 15 min. het supernatant overbrengen in een schone centrifugebuis. Herhaal deze stap totdat geen pellet wordt verkregen na centrifugeren.
- Draai het supernatant bij 18.000 × g gedurende 3u.
- Verwijder het supernatant en houden van de pellet met membraaneiwitten. Resuspendeer de pellet membraan in een klein volume (0,5 – 1 mL) van lysis buffer B.
- Centrifugeer de gesuspendeerde pellet op 18.000 × g gedurende 1 uur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet membraan in de gewenste eindvolume van monster buffer (250 à 500 µL, afhankelijk van de grootte van de pellet en de gewenste concentratie).
- Bewerk de voorbeeld-pellets voor 3 ultrasone trillingen ten s in een ijsbad bij een instelling van het vermogen van 5 (50% van de 125 W maximumvermogen op 20 kHz, Zie De tabel van materialen).
- Opslaan van de monsters bij 4 ° C (korte termijn) of -20 ° C (lange termijn).
- De monsters voor de zuiverheid van fractionering onderzoeken door het uitvoeren van een westelijke vlek met behulp van antilichamen tegen het eiwit markeringen gevonden in het cytoplasma, mitochondriën en membraan compartimenten van de cel (Raadpleeg de sectie representatieve resultaten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle fractionering ongedifferentieerde U9378 cellen gekweekt in suspensie werd bereikt met behulp van het protocol hierboven is uiteengezet en geïllustreerd in Figuur 1. De monsters die met deze methode verkregen werden onderworpen aan westelijke bevlekkende9 gebruik te maken van een NAT overzetmethode naar een membraan Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride. Het membraan was vervolgens gesondeerd met antilichamen tegen cytoplasmatische, mitochondriaal en membraan gelokaliseerde eiwit markeringen (Figuur 2 Figuur 3, Figuur 4). De succesvolle winning van cytoplasmatische eiwitten kan worden geverifieerd door het sonderen van de vlek met antistoffen tegen de cytosolische eiwit glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase10 (GAPDH), normaal gelokaliseerd in het cytoplasma van de cel. Zoals blijkt uit de immunoblot (Figuur 2; onderste paneel, rijstroken 1 en 2), GAPDH komt alleen in de digitonin geëxtraheerd monsters en geen besmetting is waargenomen bij de 4.000 × g pellets (Figuur 4; rijstroken 3 en 4 op het onderste paneel) of 18.000 × g pellets (Figuur 4; rijstroken 5 en 6 op het onderste paneel). Indringende voor het spanning-afhankelijke anion kanaal (VDAC), een proteïne gelokaliseerd aan de buitenmembraan van de mitochondriale11, toont het succesvolle isolement van de mitochondriën in de 4.000 × g pellets (Figuur 4; rijstroken 3 en 4 op het midden deelvenster), terwijl de afwezigheid van dit eiwit in andere fracties het gebrek aan mitochondriale verontreiniging in de 18.000 × g pellets of digitonin-geëxtraheerde monsters toont. Indringende voor de Na/K-ATPase alpha1 subeenheid, onderdeel van een integraal membraan-heterodimer gevonden voornamelijk in het plasmamembraan12, blijkt de meerderheid van deze eiwitten ligt in de 18.000 × g pellets (Figuur 4; rijstroken 5 en 6 op de top deelvenster). Dit eiwit wordt ook aangetroffen in de 4.000 × g pellets (Figuur 4; rijstroken 3 en 4 van het bovenste gedeelte), wat suggereert mogelijke verontreiniging met plasmamembraan, hoewel deze mogelijkheid is het onwaarschijnlijk dat bij de lage snelheid waarmee deze pellet is verkregen. Een meer plausibele verklaring is de aanwezigheid van endoplasmatisch reticulum (ER) in het 4.000 × g pellets monster, zoals vervoer van Na, K-ATPase subeenheden van het ER aan het plasma-membraan heeft aangetoond door onderzoekers13. Het ontbreken van nb, K-ATPase alpha1 eiwit in de digitonin geëxtraheerd monsters (Figuur 4; rijstroken 1 en 2 in het bovenste deelvenster) demonstreert de zuiverheid van deze fractie.
In tegenstelling tot de uitkomst waargenomen tijdens een succesvolle fractionering (Figuur 2), onjuiste uitvoering van het protocol kan leiden tot versleping van cellulaire componenten (Figuur 3, Figuur 4). Een hoge concentratie van Na, K-ATPase alpha1 eiwit in de 4.000 × g pellets, in vergelijking met de 18.000 × g pellets (Figuur 3 {BOVENPANEEL, lane 2-3] en figuur 4B [BOVENPANEEL, rijstroken 5-12]), geeft aan dat de breuk organel besmet met plasma membraaneiwitten. De aanwezigheid van GAPDH in elke fractie dan het digitonin-geëxtraheerde cytoplasmatische monster (Figuur 3 [onderste paneel, lane 4] en figuur 4A [onderste paneel, rijstroken 5-12] is een indicator van het niet verwijderen van cytoplasmatische eiwitten in opeenvolgende stappen.
Figuur 1: Diagram van de cel fractionering Protocol. Een overzicht van de cel fractionering protocol weergegeven als een stroomdiagram. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: succesvolle Isolatievan U937 cel cytoplasma, organel en membraan breuken. Westelijke vlekken van cel breuken geïsoleerd van twee U937 celculturen en peilden voor markers van membraan (Na, K-ATPase alpha1, bovenste paneel), mitochondriën (VDAC, middelste deelvenster) en cytoplasma (GAPDH, onderste paneel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: niet-Fractionate U937 celbestanddelen. Westelijke vlekken van breuken van de cel van een celkweek voor één U937, tonen van besmetting van het organel breuk (lane 2) met Na, K-ATPase alpha1 geïsoleerd (bovenzijde) en verlies van cytoplasmatische onderdelen in het supernatant van de membraan pellet (lane 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Cross contaminatie van cytoplasmatische en membraan componenten tijdens fractionering. (A) fractionering probeert met cytoplasmatische kruisbesmetting van GAPDH in organel (onderste paneel, rijstroken 5-8) en membraan breuken (onderste paneel, rijstroken 9-12). (B) fractionering proberen waarbij plasma membraan besmet raakt Na, K-ATPase in mitochondriale breuken (bovenste paneel, rijstroken 5-8). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam | Samenstelling (voorraad concentratie) | Eindconcentratie |
| Buffer A | NaCl (150 mM) en HEPES (50 mM) | 1 x (zelfde als voorraad) |
| Lysis-buffermengsel B | HEPES (20 mM), KCl (10 mM), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 mM), EGTA (1 mM), Mannitol (210 mM) en Sucrose (70 mM) | 1 x (zelfde als voorraad) |
| Monster Buffer | Natrium dodecyl sulfaat (0,1%) in Tris-gebufferde zoutoplossing | 1 x (zelfde als voorraad) |
| Digitonin | Digitonin (250 µg/ml) met gedeïoniseerd water | 25 µg Mo/ml |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Phenylmethanesulfonyl-fluoride (100 mM) in 100% ethanol | 1 mM |
| Protease Inhibitor Cocktail | Varieert (Zie fabrikant productfiche) | 1 X |
| Natrium Orthovanadate | Natrium Orthovanadate (500 mM) in gedeïoniseerd water | 1 mM |
Tabel 1: Buffers en oplossingen. Samenstelling van buffers en vereiste oplossingen voor de procedure.
| Protocol stap | Kritieke Factor | Uitleg | Mogelijke problemen | Mogelijke oplossingen |
| Voorbereiding van de cel | Concentratie van de cel | De optimale concentratie van cellen die kan worden verwerkt door deze methode moet empirisch worden bepaald voor het celtype wordt gewerkt met oog op de beste resultaten. | Sterk geconcentreerde cel schorsingen kunnen leiden tot inefficiënte lysis, leidt tot lage opbrengst van de mitochondriën en membraan breuken. | Eerste procedure met een aantal uiteenlopende concentraties van de cel om de beste resultaten uitvoeren. |
| Voorbewerking van cellen | Cellen moeten worden geschorst voor de procedure fractionering, vereist dit loskoppelen Adherente cellen van cultuur oppervlakken of homogenisatie van weefsels. | Inefficiënte verwerking kan leiden tot lage breuk opbrengsten, kruisbesmetting tussen subcellular breuken of andere onverwachte resultaten. | Zorg ervoor dat de methode resultaten in voldoende cellen voor de procedure gebruikt. Graaf cellen in suspensie te bepalen van concentratie na verwerking en dienovereenkomstig aan te passen. | |
| Als de waarderingsgrondslag die werd toegepast in het gedrang het plasma-membraan brengt, kan voortijdige lysis optreden, resulterend in versleping van breuken. | Ervoor zorgen dat plasma membraan integriteit wordt gehandhaafd tijdens de oogst van de cel met behulp van methoden die te voorkomen beschadiging van de cel. Membraan integriteit controleren bij een onderzoek onder een microscoop met de toevoeging van een membraan ondoordringbare kleurstof (bijvoorbeeld blauw Trypan). | |||
| Cytosolische eiwit isolatie | Digitonin concentratie | De optimale concentratie van digitonin moet worden bepaald om te voorkomen dat lysis van cellen terwijl nog steeds cytosolische eiwit extractie door vorming van de porie. | Hoge concentraties van digitonin kunnen leiden tot breuk van de membraan, lysis van de cel en besmetting van de cytosolische breuk. Suboptimaal concentraties zal leiden tot inefficiënte extractie van cytosolische eiwitten en mogelijke kruisbesmetting van latere breuken. | De concentratie van digitonin moet worden daalde als buitensporige cellysis wordt waargenomen. Een kleincellige pellet verkregen na incubatie van digitonin kan duiden membraan breuk en lysis van de cel. |
| Na extractie Wash | Verwijdering van digitonin en cytosolische eiwit uit permeabel cellen moet worden uitgevoerd om te voorkomen van kruisbesmetting. | Niet wassen cellen voldoende nadat cytosolische extractie kan leiden tot overdracht van cytosolische eiwitten naar andere breuken. | Extra wast met Buffer een volgende digitonin incubatie verdunt digitonin en de resterende cytosolische eiwitten. | |
| Mitochondriale isolatie | Lysis van de cel | Lysis methodes moet grondig om mobiele inhoud, terwijl het handhaven van de mitochondriale integriteit voor latere isolatie vrij te geven. | Mechanische lysis van cellen mogelijk inefficiënt, waardoor cellen intact en resulterend in lage opbrengsten van mitochondriale eiwitten. | De hoeveelheid kracht moest lyse cellen en vrijgeven van mitochondriën moet empirisch vastgesteld voor verschillende soorten cellen. Grote pellets verkregen na de lysis stap (evenals kleine mitochondriale en membraan pellets) kunnen duiden op lysis van de suboptimaal. Verhogen van de hoeveelheid kracht (stamper lijnen, naald passages, enz.) om te minimaliseren van de post lysis pellet. |
| Te veel mechanische kracht kan lyse mitochondriën, verontreiniging van de Fractie van de plasmamembraan met mitochondriale membraaneiwitten. | Verlagen de hoeveelheid kracht als eiwitten mitochondriaal markeringen in membraan monsters worden gevonden. | |||
| Puin verwijderen | Onbeschadigde cellen en grotere fragmenten moeten worden verwijderd uit het homogenaat na lysis om verontreiniging van mitochondriale monsters te vermijden. | Mitochondriale monsters kunnen besmet raken met de cytoplasmatische onderdelen of plasmamembraan eiwitten als puin en onbeschadigde cellen worden niet verwijderd voordat de pillering mitochondriën. | Verhoog het aantal lage snelheid centrifugeren stappen vóór de mitochondriale isolatie spin. Wanneer mitochondriale rendement laag is, wellicht te pellets behoeden voor lage snelheid draaiingen en controleren via de westelijke vlek voor mitochondriale markeringen. | |
| Na isolatie Wash | Mitochondriale monsters moeten grondig worden gewassen om te verwijderen van contaminerende puin dat met hen pellet kan. | Cel fragmenten mei samengestelde en geassocieerd met mitochondriën, wat leidt tot verontreiniging van cytoplasmatische kruis of membraaneiwitten. | Zorg ervoor dat de pellets voldoende met buffer gewassen zijn te verwijderen van verontreinigingen. | |
| Membraan isolatie | Centrifugeertijd | Centrifugeren keer wellicht worden uitgebreid tot het verhogen van de opbrengst van membraan breuk monster. | Afhankelijk van het totaal aantal verwerkte cellen en de efficiency van lysis van de cel, kan membraan breuk monster opbrengst worden laag. | Verhoging van de centrifugeertijd kan verbeteren rendement van plasmamembraan breuk. Terwijl de voorgestelde tijd voldoende voor een grote startende hoeveelheid cellen is, kunnen langere tijden nodig zijn voor kleinere hoeveelheden. |
Tabel 2: kritische stappen. Overzicht van de stappen van het protocol, potentiële problemen en mogelijke oplossingen voor het oplossen van het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van dit protocol is ontstaan uit een onvermogen om te scheiden van mitochondriale en membraan monsters, met behulp van commercieel beschikbare kits, p.a. van eiwit lokalisatie tijdens necroptosis14. De primaire beperkingen van premade kits zijn hun onvermogen om te worden aangepast aan de behoeften van individuele onderzoekers, hun kosten per monster en beperkt aantal monsters kan worden verwerkt. De methode die hier gepresenteerd kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van dure reagentia en zonder de noodzaak voor dure apparatuur. Deze methode kan worden aangepast om een willekeurig aantal cellen aan te passen en kan worden aangepast aan de behoeften van onderzoekers. Hierdoor is het rendement van elke fractie worden verhoogd, de afstemming van de stappen aan het onderzoek wordt uitgevoerd en de flexibiliteit in de uitvoering van de methode. De toevoeging van natrium orthovanadate in de buffers kan worden weggelaten als onderzoekers zijn niet phosphorylation staat van eiwitten in de eindmonsters te onderzoeken. De opneming van SDS in de definitieve buffer kan eveneens worden weggelaten als onderzoekers willen verder zuiveren de monsters via dichtheid kleurovergang centrifugeren. Terwijl wij zijn alleen gewend deze methode met succes fractionate U937 cellen, een niet-aanhanger monocyt cellijn, zou moeten de procedure werken met meerdere cellijnen en weefsel, met kleine veranderingen. Cellen gekweekt in suspensie kunnen ook worden pelleted aan de cellen van de U937 hier, gedetailleerde terwijl aanhangend cellijnen vereisen dissociatie van het oppervlak van de groei voorafgaand aan het begin van dit protocol. Evenzo moeten weefsels grondig worden gehomogeniseerd voorafgaand aan de versplintering van met cellen. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van een loszittende Dounce homogenizer, een homogenizer van de glas-polytetrafluoroethene Potter-Elvehjem of door andere (commerciële) methoden15.
Er zijn een aantal essentiële stappen in het protocol moeten zorgvuldige aandacht voor het verkrijgen van optimale resultaten en zuivere breuken (tabel 2). De concentratie van cellen aanbevolen hier (stappen 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 en 4.1.2) zijn specifiek voor U937 cellen en waren vastbesloten via trial and error. Deze waarden wellicht worden aangepast aan verschillende soorten cellen als suboptimaal resultaten worden verkregen bij de uitvoering van het protocol. Tijdens de cytoplasmatische extractie stap (3.1), moet de concentratie van digitonin volstaan om de permeabilize van het plasma-membraan zonder volledig lysing van cellen. Na deze incubatie, cellen moeten grondig worden gewassen om te verwijderen van cytosolische eiwitten uit opeenvolgende stappen of kruisbesmetting plaatsvindt in downstream monsters (figuur 4A). De homogenisering stap (stap 4.1.4) kan worden bereikt met elke vorm van mechanische lysis, hoewel het hier gepresenteerde resultaten werden verkregen met een Dounce homogenizer. Een alternatief voor het gebruik van een Dounce homogenizer is herhaaldelijk passeren cellen een smalspoor naald (27 G aanbevolen, 20-40 passeert) tot voldoende lysis van de cel wordt bereikt. Wellicht te verhogen van het aantal lijnen (of spuit passeert) als een grote pellet ongebroken cellen wordt verkregen na homogenisatie (stap 4.1.7). Onderzoekers zal waarschijnlijk nodig om te bepalen van de optimale hoeveelheid homogenisering voor het type cel gefractioneerde wordt. Verwijdering van cellulaire puin na de homogenisering moet grondig om te voorkomen dat besmetting van de organel breuk met plasma membraan componenten (figuur 4B). Als dit gebeurt, moeten extra lage snelheid centrifugeren stappen worden uitgevoerd om te verwijderen van cellulaire puin. Tijdens de ontwikkeling van deze methode werd tot 18 h van centrifugeren op 18.000 × g getest, met minimale stijging van plasmamembraan opbrengst over de 3 h spins (Figuur 2, rijstroken 5-6). Onderzoekers vinden het noodzakelijk om te verhogen centrifugeren keer om betere opbrengsten van het plasmamembraan monster.
De methode die hier gepresenteerd is beperkt in vergelijking met de meer grondige zuivering methoden waarbij ultracentrifugatie. Zonder het gebruik van isopycnic dichtheid centrifugeren is het niet mogelijk om te scheiden van de individuele organellen verkregen na de homogenisering van de cel. Terwijl de 4.000 × g breuken bevatten mitochondriën (zoals blijkt uit de aanwezigheid van VDAC, Figuur 2), bevatten zij waarschijnlijk ook ER, golgi en extra intracellulaire organellen. Het organel breuk moet worden geverifieerd door het gebruik van extra antilichamen aan eiwit markeertekens van andere organellen, als dit is van belang voor het onderzoek wordt uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door de NIH-1R15HL135675-01 tot en met Timothy J. LaRocca
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
