Summary
Nous présentons ici un protocole visant à isoler les membrane plasmique, cytoplasme et les mitochondries des cellules U937 sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse. Cette technique peut servir à purifier les fractions subcellulaires pour un examen subséquent de la localisation de la protéine par immunoblotting.
Abstract
Dans ce protocole, nous détaillons une méthode pour obtenir des fractions subcellulaires des cellules U937 sans l’utilisation d’ultracentrifugation ou détergents sans discernement. Cette méthode utilise des tampons hypotoniques, digitonine, lyse mécanique et centrifugation différentielle pour isoler le cytoplasme, la mitochondrie et la membrane plasmique. Le processus peut être adapté pour répondre aux besoins des chercheurs, est peu coûteux et simple. Cette méthode permettra aux chercheurs de déterminer la localisation des protéines dans les cellules sans centrifugeuses spécialisés et sans l’utilisation de kits commerciaux, qui peuvent être prohibitifs. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour séparer cytosolique, la membrane plasmique et la protéines mitochondriales chez la lignée monocytaire humaine U937.
Introduction
Une identification fiable de la localisation de la protéine est souvent nécessaire lors de l’examen des voies moléculaires dans les cellules eucaryotes. Méthodes pour obtenir des fractions subcellulaires sont utilisés par les chercheurs à examiner de plus près les composants cellulaires d’intérêt.
La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire existant tombe généralement dans deux grandes catégories, à base de détergent1,2 et axée sur l’ultracentrifugation3,4,5, qui peut être différenciés par la vitesse, de précision et de coût. Protocoles de base détergents reposent sur l’utilisation de tampons avec augmentation de la force de détergent pour solubiliser des composantes distinctes de la cellule. C’est une méthode rapide et pratique pour le traitement des échantillons et peut être rentable si le nombre et la taille des échantillons sont de petite taille. Détergent à base de produits peuvent être achetés pour isoler cytoplasmique, membrane/organelle (fraction mixte) et des fractions nucléaires des cellules. Cependant, plusieurs inconvénients liés à ces kits limitent leur utilité pour les chercheurs. Ils sont conçus pour isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais sont incapables d’isoler toutes les fractions auprès d’un échantillon en même temps. L’utilisation de détergents signifie que la membrane plasmique et l’enveloppe membranaire organites vont être tout aussi solubilisées et, par conséquent, impossible d’être séparés l’un de l’autre. Une complication supplémentaire vient les composants propriétaires dans ces kits, qui empêche les chercheurs de modifier les conditions pour des applications spécifiques. Enfin, ils sont limités en nombre d’utilisations et peuvent être prohibitifs pour des expériences à échelle plus grandes. Kits de base non détergente existent pour l’isolation des mitochondries, cependant, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et le rendement de l’échantillon est nettement inférieure à celle de la centrifugation de densité basée isolement protocoles6,7 .
Les méthodes qui utilisent l’ultracentrifugation pour obtenir des fractions sont plus prendrait beaucoup de temps, mais souvent le résultat dans les fractions plus purs que le détergent à base de produits. Pour isoler les membranes plasmiques des cellules sans premier solubilisation eux (entraînant la contamination avec les organites membranaires) doit pouvoir être lysées par une méthode non détergente suivie de la séparation des composants cellulaires via différentiel centrifugation — avec l’isolement de la membrane plasmique nécessitant des vitesses de 100 000 × g d’accomplir. Dans bien des cas, centrifugation différentielle doit être suivie d’une centrifugation gradient de densité isopycnique pour davantage de séparation des fractions cellulaires ou enlèvement de contaminants. Bien que ces méthodes soient approfondies et modifiable, les inconvénients incluent coût, consommation de temps et la nécessité d’une ultracentrifugeuse pour la séparation des fractions et autres purification par centrifugation gradient de densité. La plupart des centrifugeuses à grande vitesse sont à un coût qui est prohibitif pour les chercheurs individuels et sont souvent partagés, core équipement aux institutions académiques. Ainsi, la disponibilité ultracentrifugeuse devient prohibitive dans ces situations.
Dans ce protocole de fractionnement, nous démontrons l’isolement des fractions subcellulaires sans l’utilisation de détergents de solubilisation et sans centrifugation à haute vitesse. Cette méthode permettra aux chercheurs d’isoler la membrane plasmique, les mitochondries et les composants cytoplasmiques d’une cellule eucaryote avec contamination minime entre les fractions.
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Protocol
1. Préparez les tampons et les réactifs
Remarque : Voir le tableau 1.
- Préparer des solutions de tampons A, tampon de lyse B, tampon et digitonine.
- Préparer, tampon A en ajoutant 8,77 g de NaCl et 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) à 900 mL d’eau désionisée, ajuster le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée.
Remarque : Les concentrations finales sont NaCl 150 mM et 50 mM HEPES. - Préparer le tampon de lyse B en ajoutant 20 mL d’HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl2, 2 mL d’acide Tétraacétique (EDTA 0,5 M), 2 mL d’éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tétraacétique (0,5 M EGTA) , 38,26 g de mannitol et 23,96 g de saccharose dans 900 mL d’eau désionisée, ajuster le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée.
Remarque : Les concentrations finales sont 20 mM HEPES, KCl 10 mM, 2 mM MgCl2, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA, 210 mM de mannitol et saccharose de 70 mM. - Préparer, solution tampon en ajoutant 0,01 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 mL de tampon tris salin (SCT) pour une concentration finale de 0,1 % SDS.
- Préparer une solution de digitonine en ajoutant 25 mg de digitonine dans 100 mL d’eau désionisée (concentration finale est 250 µg/mL).
- Stockez toutes les solutions tampon à 4 ° C et la digitonine à-20 ° C jusqu’au début de l’expérience.
- Préparer, tampon A en ajoutant 8,77 g de NaCl et 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) à 900 mL d’eau désionisée, ajuster le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée.
- Préparer des solutions fraîches des inhibiteurs de la protéase et la phosphatase à ajouter aux solutions tampons avant addition aux cellules.
- Préparer une solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) en ajoutant des 17,4 mg de PMSF à 1 mL d’éthanol à 100 % (concentration finale est de 100 mM).
Attention : Porter des équipements de protection appropriés et être prudent lorsque vous manipulez le PMSF. Le PMSF est dangereux en cas d’ingestion et légèrement dangereux en cas de contact cutané (irritant), contact avec les yeux (irritant) ou par inhalation ; Il est corrosif pour les yeux et la peau. - Préparer un cocktail d’inhibiteur de protéase commercialement disponibles (100 ×) selon les instructions du fabricant (voir la Table des matières).
- Préparer une solution d’orthovanadate de sodium (SOV) en ajoutant des 92 mg de SOV à 1 mL d’eau désionisée (concentration finale est 500 mM).
Attention : Porter des équipements de protection appropriés et soyez prudent lorsque vous manipulez. SOV est dangereux en cas de contact avec les yeux (irritant), par ingestion ou inhalation. Surexposition sévère peut entraîner la mort.
- Préparer une solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) en ajoutant des 17,4 mg de PMSF à 1 mL d’éthanol à 100 % (concentration finale est de 100 mM).
2. PBS lavage
- Concentrer et laver les cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant le fractionnement.
- Centrifuger la suspension cellulaire à une vitesse appropriée pour créer une boulette. Par exemple, centrifuger une suspension de cellules U937 à 400 × g pendant 10 min.
- Retirer le surnageant, resuspendre le culot dans du PBS à température ambiante à une concentration finale de 4 × 106 cellules/mL et pipette doucement pour briser les mottes.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min granuler des cellules.
- Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans glacée tampons A à une concentration finale de 2 × 107 cellules/mL.
Remarque : Toutes les étapes subséquentes devraient être effectuées à 4 ° C ou sur glace et tous les tampons doivent être préalablement réfrigérées.
3. cytosolique protéines isolement
- Extraire des protéines cytosoliques par incubation avec la digitonine détergente.
- Juste avant la remise en suspension des cellules (étape 3.1.3) ajouter 10 µL de stock PMSF (100 mM), 10 µL de l’inhibiteur de protéase (× 100), 2 µL de stock SOV (500 mM) et 100 µL de stock digitonine (250 µg/mL) à 878 µL de tampons A (concentrations finales sont PMSF 1 mM , 1 × inhibiteur de la protéase, 1 mM SOV et 25 µg/mL digitonine ; ajuster le volume final selon le nombre de cellules utilisées). Conserver la solution sur la glace jusqu'à plus de culot.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min et enlever le surnageant.
- Resuspendre le culot dans solution tampons A contenant des inhibiteurs et digitonine (préparé à l’étape 3.1.1) à une concentration finale de 2 × 107 cellules/mL, pipette doucement pour briser les mottes.
- Incuber la suspension cellulaire sur une coiffe plus fin à 4 ° C pendant 20 min.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min. à frais virés le surnageant et le placer dans un tube à centrifuger propre.
- Centrifuger le liquide surnageant collecté à 18 000 x g pendant 20 min granuler les débris cellulaires.
- Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre.
- Répétez les étapes 3.1.5 et 3.1.6 jusqu'à ce qu’aucune granule n’est obtenu par centrifugation.
- Récupérer le surnageant contenant les protéines cytosoliques et le stocker à 4 ° C (courte durée) ou à-20 ° C (long terme).
- Supprimer les excès digitonine et protéines cytosoliques par centrifugation.
- Resuspendre le culot de cellules perméabilisées à la digitonine (de l’étape 3.1.5) dans les tampons A à une concentration finale de 4 × 106 cellules/mL et pipette doucement pour briser les mottes.
- Centrifuger la suspension de cellules perméabilisées de digitonine à 400 × g pendant 10 min et enlever le surnageant.
Remarque : Les lavages répétés dans les tampons A peuvent être effectuées pour éliminer les contaminants cytosoliques excès.
4. cellule homogénéisation
- Incuber les cellules sur la glace dans le tampon de lyse B et leur lyse par des moyens mécaniques.
- Juste avant la remise en suspension des cellules (étape 4.1.2) ajouter 10 µL de stock PMSF (100 mM) et 2 µL de stock SOV (500 mM) à 988 µL de tampon de lyse B (concentrations finales sont PMSF 1 mM et 1 mM SOV, ajuster le volume final, pour accueillir le nombre de cellules sont lysées) et garder les solu tion sur la glace jusqu'à plus de culot.
- Resuspendre le culot cellulaire (de l’étape 3.2.2) dans contenant PMSF et SOV (préparé à l’étape 4.1.1) à une concentration finale de 4 × 106 cellules/mL de solution tampon B de lyse glaciale .
- Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 30 min.
- Transférer la suspension cellulaire dans un homogénéisateur Dounce préalablement réfrigérée (avec un pilon de B serrés) sur la glace et effectuer 40 passes avec le pilon homogénéisateur en lent, même mouvements.
Remarque : Utiliser alternativement autres moyens de la lyse de la mécanique cellulaire tel que décrit dans la section « discussion ». - Recueillir l’homogénat et transférez-le dans un tube à centrifuger propre.
- Laver le homogénisateur pilon et le tube avec un petit volume (1 à 2 mL) de tampon de lyse B et ajoutez-le à l’homogénat.
- Centrifuger l’homogénat à 400 × g (ou la vitesse minimale requise pour granuler cellules ininterrompues) pendant 10 min.
- Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre.
Remarque : Si une pastille importante reste 4.1.4 par 4.1.6 pour augmenter le rendement des fractions comme répéter les étapes détaillées dans la section « discussion ». Le protocole peut être suspendu ici et l’homogénat stockés à 4 ° C à court terme (24 h).
5. différentielle Centrifugation
- Centrifuger l’homogénat à l’augmentation de la vitesse pour enlever les débris cellulaires, les mitochondries isolat et les fractions membranaires.
- Centrifuger le surnageant (de l’étape 4.1.8) à 500 × g pendant 10 min. transfert surnageant dans un tube à centrifuger propre et éliminer toute pellet.
- Centrifuger surnageant (de l’étape 5.1.1) à 1 000 × g pendant 10 min. transfert le surnageant dans un tube à centrifuger propre et éliminer toute pellet.
- Centrifuger le surnageant (de l’étape 5.1.2) à 2 000 × g pendant 10 min. transfert le surnageant dans un tube à centrifuger propre et éliminer toute pellet.
- Centrifuger le surnageant (de l’étape 5.1.3) à 4 000 × g pendant 15 min. transfert surnageant dans un tube à centrifuger propre, garder des granulés contenant des mitochondries.
- Resuspendre le culot de mitochondries dans un petit volume (0.5\u20121 mL) de tampon de lyse B.
- Centrifuger le culot suspendu à 4 000 × g pendant 15 min. retirer le surnageant et remettre le mitochondrial culot dans le volume final désiré de solution tampon (par exemple, 250 et 500 µL, selon la taille de la pastille et désiré (concentration).
- Centrifuger le surnageant (de l’étape 5.1.4) à 4 000 × g pendant 15 min. transférer le liquide surnageant dans un tube à centrifuger propre. Répétez cette étape jusqu'à ce qu’aucune granule n’est obtenu par centrifugation.
- Faites tourner le surnageant à 18 000 × g pendant 3 h.
- Retirez le surnageant et garder le culot contenant des protéines de la membrane. Resuspendre le culot de membrane dans un petit volume (0,5 à 1 mL) de la lyse de la mémoire tampon B.
- Centrifuger le culot suspendu à 18 000 × g pendant 1 h.
- Retirez le surnageant et resuspendre le culot de membrane dans le volume final désiré de solution tampon (250 à 500 µL, selon la taille de la pastille et la concentration désirée).
- Laisser agir les boulettes d’échantillon pour 3 s dans un bain de glace à un réglage de puissance de 5 (50 % de la puissance maximale de 125 W à 20 kHz, voir La Table des matières).
- Stocker les échantillons à 4 ° C (courte durée) ou à-20 ° C (long terme).
- Examiner les échantillons pour la pureté de fractionnement en effectuant une tache occidentale utilisant des anticorps dirigés contre des marqueurs protéiques dans les compartiments de cytoplasme, mitochondries et la membrane de la cellule (reportez-vous à la section résultats représentatifs).
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Representative Results
Succès le fractionnement des indifférenciées U9378 cellules cultivées en suspension a été accompli en utilisant le protocole indiqué ci-dessus et illustré à la Figure 1. Les échantillons obtenus avec cette méthode ont été soumis à western blotting9 utilisant une méthode de transfert humide sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La membrane a été sondée par la suite avec des anticorps contre cytoplasmique, mitochondriale et membrane localisée marqueurs protéiques (Figure 2, Figure 3, Figure 4). L’extraction réussie de protéines cytoplasmiques peut être vérifiée en sondant la tache avec des anticorps dirigés contre la protéine cytosolique glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase10 (GAPDH), normalement localisée dans le cytoplasme de la cellule. Comme en témoigne l’immunoblot (Figure 2; panneau inférieur, voies 1 et 2), GAPDH se trouve principalement dans la digitonine extraite des échantillons et aucune contamination est observée dans les 4 000 × g granules (Figure 4; pistes 3 et 4 sur le panneau de fond) ou 18 000 × g granulés (Figure 4; voies 5 et 6 sur le panneau du bas). Sondage pour le canal anionique voltage-dépendants (CAVD), une protéine localisée dans la membrane mitochondriale externe11, montre la réussite de l’isolement des mitochondries dans les 4 000 × g granules (Figure 4; pistes 3 et 4 sur le milieu groupe d’experts), alors que l’absence de cette protéine dans d’autres fractions montre l’absence de contamination mitochondriale dans les 18 000 × g granules ou extraites à l’aide de la digitonine échantillons. Sondage pour la sous-unité α1 de Na/K-ATPase, partie d’un hétérodimère membranaires intrinsèques trouvé principalement dans la membrane plasmique12, montre la majorité de cette protéine dans les 18 000 × g granules (Figure 4; voies 5 et 6 sur le dessus groupe d’experts). Cette protéine est également détectée dans les 4 000 × g granules (Figure 4, pistes 3 et 4 du panneau supérieur), suggérant la possibilité de contamination avec la membrane plasmique, bien que cette possibilité est peu probable à la basse vitesse avec laquelle cette pastille a été obtenue. Une explication plus plausible est la présence du réticulum endoplasmique (ER) dans les 4 000 × g granules d’échantillon, comme le transport de Na, sous-unités de K-ATPase de l’ER à la membrane plasmique a été démontrée par des chercheurs de13. L’absence de Na, protéine α1 K-ATPase dans les échantillons de la digitonine extraite (Figure 4, voies 1 et 2 sur le panneau du haut) illustre la pureté de cette fraction.
Par contraste avec les résultats observés pendant un fractionnement réussi (Figure 2), mauvaise exécution du protocole peut entraîner la contamination des composants cellulaires (Figure 3, Figure 4). Une forte concentration de Na, K-ATPase α1 de protéines dans les 4 000 × g granulés, par rapport aux 18 000 × g granulés (Figure 3 {panneau supérieur, voie 2-3] et Figure 4 b [panneau supérieur, voies 5-12]), indique que la fraction de l’organite a été contaminées avec des protéines de la membrane plasmique. La présence de GAPDH dans les fractions autres que l’échantillon cytoplasmique extraites à l’aide de la digitonine (Figure 3 [panneau de fond, piste 4] et Figure 4 a [panneau inférieur, voies 5-12] est un indicateur de défaillance pour enlever les protéines cytoplasmiques dans les étapes suivantes.
Figure 1 : schéma du protocole de fractionnement cellulaire. Une vue d’ensemble du protocole fractionnement cellulaire représenté comme un organigramme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : réussite de l’isolement du cytoplasme des cellules U937, organite et Fractions membranaires. Des transferts Western des fractions cellulaires isolement de deux cultures de cellules U937 et sondé pour marqueurs de membrane (Na, K-ATPase α1, panneau supérieur), les mitochondries (CAVD, panneau central) et le cytoplasme (GAPDH, panneau inférieur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : échec de fractionner des composants de cellules U937. Des transferts Western des fractions de cellules isolées d’une culture de cellules U937 unique montrant la contamination de la fraction d’organelle (piste 2) avec la Na, K-ATPase α1 (panneau supérieur) et la perte de composants cytoplasmiques dans le surnageant de la pastille de membrane (piste 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : traverser la Contamination du cytoplasme et constituants membranaires durant le fractionnement. Tentative de fractionnement (A) avec une contamination croisée cytoplasmique de GAPDH organelle (panneau inférieur, voies 5-8) et des fractions de membrane (panneau inférieur, voies 9-12). (B) fractionnement tenter avec la contamination de la membrane plasmique de la Na, K-ATPase dans les fractions mitochondriales (panneau supérieur, voies 5-8). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom | Composition (concentration en stock) | Concentration finale |
| Tampon A | NaCl (150 mM) et HEPES (50 mM) | 1 x (le même que le stock) |
| Tampon de lyse B | HEPES (20 mM), KCl (10 mM), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 mM), EGTA (1 mM), Mannitol (210 mM) et saccharose (70 mM) | 1 x (le même que le stock) |
| Solution tampon | Dodécylsulfate de sodium (0,1 %) en tampon Tris salin | 1 x (le même que le stock) |
| Digitonine | La digitonine (250 µg/ml) dans l’eau désionisée | 25 µg/ml |
| Fluorure de Phénylméthanesulfonyle | Fluorure de Phénylméthanesulfonyle (100 mM) dans l’éthanol à 100 % | 1 mM |
| Cocktail d’inhibiteur de protéase | Varie (voir la fiche fabricant produit) | 1 X |
| Orthovanadate de sodium | Orthovanadate de sodium (500 mM) dans l’eau désionisée | 1 mM |
Tableau 1 : tampons et Solutions. Composition des tampons et des solutions requises pour la procédure.
| Étape du protocole | Facteur critique | Explication | Problèmes potentiels | Solutions possibles |
| Préparation de cellules | Concentration cellulaire | La concentration optimale de cellules qui peut traiter cette méthode doit être déterminée empiriquement pour le type de cellule en cours d’élaboration avec afin d’obtenir les meilleurs résultats. | Suspensions cellulaires très concentré peuvent entraîner la lyse inefficace, conduisant à des rendements faibles des mitochondries et membrane fractions. | Effectuez la procédure initiale avec une gamme de concentrations de cellules afin de déterminer les meilleurs résultats. |
| Prétraitement des cellules | Les cellules doivent être en suspension de la procédure de fractionnement, il faut retirer des cellules adhérentes des surfaces de culture ou d’homogénéisation des tissus. | Traitement inefficace peut entraîner un rendement faible fraction, contamination entre fractions subcellulaires ou autres résultats inattendus croisée. | Veiller à ce que la méthode employée résultats dans les cellules suffisants pour la procédure. Compter les cellules en suspension pour déterminer la concentration après traitement et ajuster en conséquence. | |
| Si la méthode employée compromet la membrane plasmique, lyse prématurée peut se produire, entraînant la contamination des fractions croisée. | Assurer le maintien de l’intégrité de la membrane plasmique lors de récolte de cellules à l’aide de méthodes qui ne pas endommager la cellule. Vérifiez l’intégrité membranaire lors d’un examen au microscope avec l’inclusion d’un colorant de membrane imperméable (par exemple, le bleu Trypan). | |||
| Isolement des protéines cytosoliques | Concentration de la digitonine | La concentration optimale de la digitonine doit être déterminée pour éviter la lyse des cellules tout en permettant une extraction de la protéine cytosolique par formation de pores. | Des concentrations élevées de digitonine peuvent conduire à la rupture des membranes, lyse cellulaire et la contamination de la fraction cytosolique. Des concentrations suboptimales entraînera inefficace d’extraction des protéines cytosoliques et possibilité de contamination croisée des fractions suivantes. | La concentration de la digitonine devrait être réduite en cas de lyse cellulaire excessive. Une boulette de petites cellules obtenue après incubation digitonine peut indiquer la rupture des membranes et la lyse des cellules. |
| Lavage après Extraction | Déménagement de digitonine protéines cytosoliques de cellules perméabilisées doit être effectuée pour éviter toute contamination croisée. | Défaut de laver les cellules suffisamment après que extraction cytosolique peut entraîner report de protéines cytosoliques d’autres fractions. | Complémentaire lave avec un tampon qui suit une incubation digitonine diluera la digitonine et autres protéines cytosoliques. | |
| Isolement mitochondriale | Lyse cellulaire | Lyse méthodes doivent être approfondies pour libérer le contenu cellulaire, tout en préservant une intégrité mitochondriale pour l’isolation ultérieure. | La lyse des cellules mécanique peut être inefficace, en épargnant les cellules intactes et qui en résulte dans les faibles rendements des protéines mitochondriales. | La quantité de force nécessaire pour lyser les cellules et les mitochondries de sortie doit être déterminée empiriquement pour différents types de cellules. Gros granulés obtenus après l’étape de lyse (ainsi que petits granules mitochondriales et membrane) peuvent indiquer la lyse sous-optimale. Augmenter la quantité de force (coups de pilon, passages d’aiguille, etc.) afin de minimiser le culot de lyse post. |
| Trop de force mécanique peut lyser des mitochondries, contaminer la fraction de membrane plasmique avec des protéines de la membrane mitochondriale. | Diminuer la quantité de force si des marqueurs de protéines mitochondriales sont trouvées dans les échantillons de membrane. | |||
| Enlèvement des débris | Les cellules intactes et les plus grands fragments doivent être retirés de l’homogénat après lyse pour éviter de contaminer les échantillons mitochondriales. | Mitochondriales échantillons peuvent être contaminés par composants cytoplasmiques ou protéines de la membrane plasmique si les cellules intactes et les débris ne sont pas supprimés avant enrobage des mitochondries. | Augmenter le nombre d’étapes de centrifugation à vitesse réduite avant l’essorage isolement mitochondriale. Si le rendement mitochondriale est faible, il peut être nécessaire sauver des pastilles de basse vitesse tours et vérifier via la tache occidentale pour marqueurs mitochondriales. | |
| Isolation après lavage | Mitochondriales échantillons doivent être lavés soigneusement pour enlever les débris contaminantes qui peuvent à pellets avec eux. | Cellule des fragments mai aggregate et associé avec les mitochondries, conduisant à la contamination de cytoplasmique croisée ou de protéines membranaires. | Veiller à ce que les granulés sont suffisamment lavés avec tampon pour éliminer les contaminants. | |
| Isolement de membrane | Temps de centrifugation | Temps de centrifugation devra peut-être être repoussée pour augmenter le rendement de l’échantillon de fraction de membrane. | Selon le nombre total de cellules transformées et l’efficacité de la lyse cellulaire, rendement de membrane fraction échantillon peut être faible. | Augmenter le temps de centrifugation peut-être améliorer le rendement de la fraction des membranes plasmiques. Alors que la durée suggérée est suffisante pour une grande quantité de départ des cellules, plus longs peuvent être nécessaires pour des quantités plus petites. |
Tableau 2 : étapes cruciales. Tableau récapitulatif des étapes du protocole, les problèmes potentiels et des solutions possibles pour le dépannage du protocole.
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Discussion
L’élaboration du présent protocole est née de l’incapacité de séparer les mitochondries et les échantillons de membrane, utilisant des kits disponibles dans le commerce, pour l’analyse de la localisation des protéines au cours de la necroptosis14. Les limitations primaires de kits préfabriqués sont leur incapacité à être adapté aux besoins des chercheurs individuels, leur coût par échantillon et le nombre limité d’échantillons peuvent être traitées. La méthode présentée ici peut être effectuée sans l’utilisation des réactifs coûteux et sans la nécessité d’équipements coûteux. Cette méthode peut être adaptée pour tenir compte de n’importe quel nombre de cellules et est susceptible d’être modifié en fonction des besoins des chercheurs. Cela permet le rendement de chaque fraction d’augmenter, la confection des étapes de la recherche en cours et la flexibilité dans l’exécution de la méthode. L’ajout d’orthovanadate de sodium dans les mémoires tampons peut être omis si les chercheurs examinent pas l’état de phosphorylation de protéines dans les échantillons finals. L’inclusion du SDS dans la dernière mémoire tampon de même peut être omise que si les chercheurs veulent purifier davantage l’échantillons par densité centrifugation en gradient de. Alors que nous avons seulement utilisé cette méthode pour fractionner des cellules U937, une lignée de cellules non adhérentes monocyte, avec succès la procédure devrait fonctionner avec plusieurs lignées de cellules et de tissus, avec des modifications mineures. Les cellules cultivées en suspension peuvent être granulées de même aux cellules U937 détaillées ici, tandis que les lignées de cellules adhérentes exigent la dissociation de la surface de croissance avant le début du présent protocole. De même, tissus doivent être soigneusement homogénéisés avant fractionnement de cellules. Ceci peut être accompli en utilisant un raccord lâche Dounce homogénéisateur, un homogénéisateur de verre-polytetrafluoroethene Potter-Elvehjem ou par d’autres méthodes (commercial)15.
Il y a un certain nombre d’étapes cruciales dans le protocole nécessitant une attention particulière afin d’obtenir des résultats optimaux et pures fractions (tableau 2). La concentration de cellules (étapes 2.1.2 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 et 4.1.2) recommandées ici sont spécifique aux cellules U937 et ont été déterminée par tâtonnement. Ces valeurs peuvent devoir être ajustée pour tenir compte des différents types de cellules si des résultats sous-optimaux sont obtenus lors de l’exécution du protocole. Au cours de l’étape d’extraction cytoplasmique (étape 3.1), la concentration de la digitonine doit être suffisante pour permeabilize la membrane de plasma sans complètement lyser les cellules. Après l’incubation, les cellules doivent être lavés soigneusement pour enlever les étapes suivantes des protéines cytosoliques ou contamination croisée se produira dans les échantillons en aval (Figure 4 a). L’étape d’homogénéisation (étape 4.1.4) peut être accompli avec toute forme de lyse mécanique, bien que les résultats présentés ici ont été obtenus avec un homogénéisateur Dounce. Plutôt que d’utiliser un homogénéisateur Dounce est à plusieurs reprises passer des cellules à travers une aiguille de voie étroite (27 G recommandé, passes de 20-40) jusqu'à la lyse cellulaire suffisant est atteint. Il peut être nécessaire d’augmenter le nombre de traits (ou seringue passes) si un grand culot de cellules ininterrompues est obtenu après homogénéisation (étape 4.1.7). Chercheurs devront probablement déterminer la quantité optimale d’homogénéisation pour le type de cellule étant fractionnée. Élimination des débris cellulaires après l’homogénéisation doit être minutieuse pour éviter la contamination de la fraction d’organelle avec des composants de la membrane plasmique (Figure 4 b). Dans ce cas, plus basse vitesse centrifugation étapes devraient être effectuées afin d’éliminer les débris cellulaires. Au cours du développement de cette méthode, jusqu'à 18 h de centrifugation à 18 000 × g a été testée, avec une augmentation minime du rendement de la membrane plasmique sur les tours de 3 h (Figure 2, voies 5-6). Les chercheurs peuvent trouver il est nécessaire d’augmenter le temps de centrifugation afin d’obtenir de meilleurs rendements de l’échantillon de la membrane plasmique.
La méthode présentée ici est limitée en comparaison avec les méthodes de purification plus approfondis impliquant l’ultracentrifugation. Sans l’utilisation de centrifugation isopycnique en densité, il n’est pas possible de séparer les organites individuels obtenus après homogénéisation de la cellule. Tandis que les 4 000 × g fractions contiennent des mitochondries (comme en témoigne la présence de VDAC, Figure 2), ils ont probablement contiennent également ER, golgi et autres organites intracellulaires. La fraction de l’organite devrait être vérifiée par l’utilisation des anticorps supplémentaires pour marqueurs protéiques des autres organites s’il s’agit d’importance pour les recherches en cours.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts
Acknowledgments
Travaux ont été subventionnés par les NIH-1R15HL135675-01 à Timothy J. LaRocca
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
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