Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera plasmamembran, cytoplasman och mitokondrierna av U937 celler utan användning av höghastighetståg centrifugering. Denna teknik kan användas för att rena subcellulär fraktioner för efterföljande prövning av protein lokalisering via immunoblotting.
Abstract
I detta protokoll detalj vi en metod för att erhålla subcellulär fraktioner av U937 celler utan användning av ultracentrifugering eller urskillningslösa rengöringsmedel. Denna metod använder hypoton buffertar, digitonin, mekaniska lysis och differentiell centrifugering att isolera cytoplasman, mitokondrier och plasmamembranet. Processen kan skalas för att tillgodose behoven hos forskare, är billig och enkel. Denna metod gör att forskare att bestämma protein lokalisering i celler utan specialiserade centrifuger och utan användning av kommersiella kit, som båda kan vara oöverkomligt kostsamma. Vi har framgångsrikt använt denna metod att separera cytosoliska, plasmamembranet och mitokondrie proteiner i mänskliga monocyt cell linje U937.
Introduction
Tillförlitlig identifiering av protein lokalisering är ofta nödvändigt när man undersöker molekylära vägar i eukaryota celler. Metoder för att erhålla subcellulär fraktioner utnyttjas av forskare att närmare undersöka cellulära komponenter av intresse.
Majoriteten av befintlig cell fraktionering metoder generellt faller i två breda kategorier, diskmedel-baserade1,2 och ultracentrifugering-baserade3,4,5, som kan vara olika hastighet, precision och kostnad. Rengöringsmedel baserat protokoll är beroende av användningen av buffertar med ökande tvättmedel styrka för att solubilize olika komponenter av cellen. Detta är en snabb och bekväm metod för bearbetning av prover och kan vara kostnadseffektivt om antal och storlek av prover är små. Diskmedel-baserade Kit kan köpas för att isolera cytoplasmiska, membran/organell (blandad fraktion) och nukleära fraktioner från celler. Men begränsa flera nackdelar är associerad med dessa kit deras användbarhet för forskare. De är utformade för att enkelt isolera en eller två beståndsdelar i cellen, men är oförmögna att isolera alla fraktioner från ett prov samtidigt. Användningen av rengöringsmedel innebär att plasma membranet och membran slutna organeller kommer vara lika solubilized och därför inte kan skiljas från varandra. En ytterligare komplikation uppstår från de egenutvecklade komponenterna i dessa kit som förhindrar forskare från att ändra villkoren för specifika applikationer. Slutligen de är begränsade i antalet användningar och kan vara oöverkomligt dyrt för större skala experiment. Icke-tvättmedel baserat kit finns för isolering av mitokondrier, men de är inte avsedda att isolera plasmamembranet och prov avkastningen är betydligt mindre än det från densitet centrifugering baserat isolering protokoll6,7 .
Metoder som utnyttjar ultracentrifugering Erhåll fraktioner är mer tidskrävande, men ofta resulterar i renare fraktioner än diskmedel-baserade kit. För att isolera plasma membran från celler utan första solubilizing dem (resulterar i förorening med membran organeller) kräver dem att vara lyserat av en icke-tvättmedel metod följt av separation av cellulära komponenter via differential centrifugering — med plasmamembranet isolering som kräver hastigheter på 100 000 × g att utföra. I många fall måste differentiell centrifugering följas av isopycnic täthet lutning centrifugering för ytterligare separation av cellulära fraktioner eller avlägsnande av föroreningar. Medan dessa metoder är grundlig och modifierbara, inkluderar nackdelarna kostnad, tidsförbrukning och behovet av en ultracentrifugen för separation av bråk och ytterligare rening via täthet lutning centrifugering. De flesta höghastighetståg centrifuger är en kostnad som är oöverkomliga för enskilda utredare och ofta delade, core utrustning vid akademiska institutioner. Således blir ultracentrifugen tillgänglighet oöverkomliga i dessa situationer.
I detta fraktionering protokoll visar vi isolering av subcellulär fraktioner utan användning av solubilizing rengöringsmedel och hög hastighet centrifugering. Denna metod gör att forskare att isolera de plasmamembran, mitokondrier och cytoplasmiska komponenterna i en eukaryot cell med minimal nedsmutsning mellan fraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered buffertar och reagenser
Obs: Se tabell 1.
- Bered lösningar av buffert A, lyseringsbuffert B, prov buffert och digitonin.
- Förbereda buffert A genom att lägga till 8,77 g NaCl och 50 mL HEPES (1 M, pH 7,4) till 900 mL avjoniserat vatten, anpassa den slutliga volymen till 1 L med avjoniserat vatten.
Obs: Slutliga koncentrationer är 150 mM NaCl och 50 mM HEPES. - Förbereda lyseringsbuffert B genom tillsats av 20 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g kaliumklorid, 0,19 g MgCl2, 2 mL av etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (0,5 M EDTA), 2 mL av etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (0,5 M EGTA) , 38.26 g mannitol och 23.96 g sackaros till 900 mL avjoniserat vatten, anpassa den slutliga volymen till 1 L med avjoniserat vatten.
Obs: Slutliga koncentrationer är 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol och 70 mM sackaros. - Förbereda prov buffert genom att lägga till 0,01 g natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS) till 10 mL tris-buffrad koksaltlösning (TBS) för en slutlig koncentration på 0,1% SDS.
- Förbereda en stamlösning av digitonin genom att lägga till 25 mg digitonin 100 mL avjoniserat vatten (slutlig koncentration är 250 µg/mL).
- Lagra alla buffertlösningar vid 4 ° C och digitonin vid-20 ° C fram till början av experimentet.
- Förbereda buffert A genom att lägga till 8,77 g NaCl och 50 mL HEPES (1 M, pH 7,4) till 900 mL avjoniserat vatten, anpassa den slutliga volymen till 1 L med avjoniserat vatten.
- Förbereda färska lösningar av proteashämmare och fosfatas-hämmare läggas till buffertlösningar innan de tillsätts celler.
- Förbereda en stamlösning av phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) genom att lägga till 17,4 mg av PMSF 1 mL 100% etanol (slutlig koncentration är 100 mM).
FÖRSIKTIGHET: Använd lämplig skyddsutrustning och iaktta försiktighet vid hantering av PMSF. PMSF är farligt vid förtäring och något farligt vid hudkontakt (irriterande), ögonkontakt (irriterande) eller inandning; Det är frätande på ögon och hud. - Förbereda en kommersiellt tillgänglig proteas hämmare cocktail (100 ×) enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell för material).
- Förbereda en stamlösning av natrium orthovanadate (SOV) genom att lägga till 92 mg SOV till 1 mL avjoniserat vatten (slutlig koncentration är 500 mM).
FÖRSIKTIGHET: Använd lämplig skyddsutrustning och försiktig vid hantering. SOV är farliga vid ögonkontakt (irriterande), förtäring eller inandning. Svår överexponering kan leda till döden.
- Förbereda en stamlösning av phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) genom att lägga till 17,4 mg av PMSF 1 mL 100% etanol (slutlig koncentration är 100 mM).
2. PBS Wash
- Koncentrera sig och tvätta cellerna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innan fraktionering.
- Centrifugera cellsuspension med en lämplig hastighet för att skapa en pellet. Till exempel Centrifugera en suspension av U937 celler vid 400 × g i 10 min.
- Ta bort supernatanten, Återsuspendera cellpelleten i rumstemperatur PBS med en slutlig koncentration på 4 × 106 celler/mL och pipetten försiktigt för att bryta upp klumpar.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 × g i 10 min till pellet celler.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i iskall buffert A med en slutlig koncentration på 2 × 107 celler/mL.
Obs: Alla efterföljande steg bör utföras vid 4 ° C eller på is och alla buffertar bör före kyld.
3. cytosoliska Protein isolering
- Extrahera cytosoliska proteiner genom inkubation med den tvättmedel digitonin.
- Omedelbart före resuspension av celler (steg 3.1.3) tillsätt 10 µL av lager PMSF (100 mM), 10 µL proteas hämmare (100 ×), 2 µL lager SOV (500 mM) och 100 µL av lager digitonin (250 µg/mL) till 878 µL buffert A (slutliga koncentrationer är 1 mM PMSF , 1 × proteashämmare, 1 mM SOV och 25 µg/mL digitonin; anpassa den slutliga volymen enligt antalet celler som används). Förvara lösningen på is tills tillägg till cellpelleten.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 × g i 10 min och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i A buffertlösning innehållande hämmare och digitonin (bereddes i steg 3.1.1) med en slutlig koncentration på 2 × 107 celler/mL, pipetten försiktigt för att bryta upp klumpar.
- Inkubera cellsuspension på en över slut rotator vid 4 ° C i 20 min.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 × g i 10 min. samla supernatanten och placera det i en ren centrifugrör.
- Centrifugera insamlade supernatanten vid 18.000 × g i 20 min till pellet cellulära skräp.
- Överför supernatanten till en ren centrifugrör.
- Upprepa steg 3.1.5 och 3.1.6 tills ingen pellet erhålls efter centrifugering.
- Samla in supernatanten innehållande cytosoliska proteiner och lagra det vid 4 ° C (kort sikt) eller -20 ° C (lång sikt).
- Ta bort överflödiga digitonin och cytosoliska proteiner genom centrifugering.
- Återsuspendera cellpelleten och digitonin-permeabilized (från steg 3.1.5) i buffert A med en slutlig koncentration på 4 × 106 celler/mL och pipetten försiktigt för att bryta upp klumpar.
- Centrifugera digitonin-permeabilized cellsuspension vid 400 × g i 10 min och avlägsna supernatanten.
Obs: Upprepade tvättar i buffert A kan utföras för att avlägsna överflödig cytosoliska föroreningar.
4. cell homogenisering
- Inkubera cellerna på is i lyseringsbuffert B och lysera dem genom mekaniska processer.
- Omedelbart före resuspension av celler (steg 4.1.2) Lägg till 10 µL av lager PMSF (100 mM) och 2 µL av lager SOV (500 mM) till 988 μl lyseringsbuffert B (slutliga koncentrationer är 1 mM PMSF och 1 mM SOV; anpassa den slutliga volymen för att rymma antalet celler som lyserat) och hålla solu tion på is tills tillägg till cellpelleten.
- Återsuspendera cellpelleten (från steg 3.2.2) iskall lysis buffert B lösning innehållande PMSF och SOV (bereddes i steg 4.1.1) med en slutlig koncentration på 4 × 106 celler/mL.
- Inkubera cellsuspension på is i 30 min.
- Överföra cellsuspensionen till en pre kylda Dounce Homogenisatorer (med en åtsittande B mortelstöt) på is och utföra 40 passerar med Homogenisatorer mortelstöten med långsam, jämna drag.
Obs: Utnyttja alternativt annat mekaniska cellys som detaljerad i diskussionsavsnittet. - Samla Homogenatet och överföra det till ett rent centrifugrör.
- Tvätta Homogenisatorer mortel och rör med en liten volym (1 till 2 mL) lyseringsbuffert B och lägga till blandningen.
- Centrifugera Homogenatet på 400 × g (eller den minsta hastighet som krävs till pellet obruten celler) i 10 min.
- Överför supernatanten till en ren centrifugrör.
Obs: Om en betydande pellet förblir Upprepa steg 4.1.4 genom 4.1.6 att öka avkastningen av fraktioner som detaljerad i diskussionsavsnittet. Protokollet kan pausas här och Homogenatet lagras vid 4 ° C på kort sikt (24 h).
5. differentiell centrifugering
- Centrifugera Homogenatet öka hastigheter ta bort cellulära skräp, isolera mitokondrier och membran fraktioner.
- Centrifugera supernatanten (från steg 4.1.8) vid 500 × g i 10 min. Transfer supernatanten till en ren centrifugrör och kassera någon pellets.
- Centrifugera supernatanten (från steg 5.1.1) vid 1 000 × g i 10 min. Transfer supernatanten till en ren centrifugrör och kassera någon pellets.
- Centrifugera supernatanten (från steg 5.1.2) vid 2 000 × g i 10 min. Transfer supernatanten till en ren centrifugrör och kassera någon pellets.
- Centrifugera supernatanten (från steg 5.1.3) vid 4 000 × g i 15 min. Transfer supernatanten till en ren centrifugrör, hålla pellets som innehåller mitokondrier.
- Återsuspendera pelleten mitokondrier i en liten volym (0.5\u20121 mL) lyseringsbuffert B.
- Centrifugera det uppslammade koncentrerade extraktet vid 4000 × g i 15 min. ta bort de supernatanten och återsuspendera den mitokondriella pelleten i önskad slutlig volym av provet buffert (t.ex., det 250 till 500 µL, beroende på storleken på pelleten och önskad koncentration).
- Centrifugera supernatanten (från steg 5.1.4) vid 4 000 × g i 15 min. överför supernatanten till en ren centrifugrör. Upprepa detta steg tills ingen pellet erhålls efter centrifugering.
- Snurra supernatanten vid 18.000 × g i 3 h.
- Avlägsna supernatanten och hålla den pellets som innehåller membranproteiner. Återsuspendera pelleten membran i en liten volym (0,5 – 1 mL) av Lys buffert B.
- Centrifugera det uppslammade koncentrerade extraktet på 18.000 × g för 1 h.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten membran i önskad slutlig volym av provet buffert (250 till 500 µL, beroende på storleken på den pellets och önskad koncentration).
- Sonikera provet pellets för 3 s i ett isbad i en energiinställning 5 (50% av 125 W maximal uteffekt vid 20 kHz, se Tabell av material).
- Lagra proverna vid 4 ° C (kort sikt) eller -20 ° C (lång sikt).
- Undersöka proverna för renhet av fraktionering genom att utföra en western blot utnyttja antikroppar mot protein markörer finns i cytoplasman, mitokondrier och membran facken i cellen (se avsnittet representativa resultat).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrika fraktionering av odifferentierade U9378 celler odlas i suspension var fulländad med protokollet anges ovan och illustreras i figur 1. De prover som erhålls med denna metod utsattes för western blotting9 utnyttja en våt överföringsmetod till ett polyvinylidene fluor (PVDF) membran. Membranet var därefter utforskad med antikroppar mot cytoplasmiska, mitokondriella och membran lokaliserade protein markörer (figur 2, figur 3, figur 4). Framgångsrika utvinning av cytoplasmatiska proteiner kan verifieras genom sondering blot med antikroppar mot cytosoliska protein glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas10 (GAPDH), normalt lokaliserad till cytoplasman i cellen. Som framgår av immunoblot (figur 2, nedre panelen, körfält 1 och 2), finns GAPDH bara i den digitonin som utvinns prover och ingen förorening observeras i 4000 × g pellets (figur 4, körfält 3 och 4 på den nedre panelen) eller 18 000 × g pellets (figur 4, körfält 5 och 6 på den nedre panelen). Sondera för spänningsberoende anjon kanal (VDAC), ett protein som är lokaliserade till den yttre mitokondriella membran11, visar den framgångsrika isoleringen av mitokondrier i 4000 × g pellets (figur 4, körfält 3 och 4 på mitten ”panel), medan frånvaro av detta protein i andra fraktioner visar bristen på mitokondriell kontaminering i 18.000 × g pellets eller digitonin-extraherade prover. Sondera för Na/K-ATPas α1 subuniten, en del av en integrerad membran heterodimer finns främst i plasmamembranet12, visar majoriteten av detta protein i 18.000 × g pellets (figur 4, körfält 5 och 6 på toppen panelen). Detta protein har också upptäckts i 4000 × g pellets (figur 4, gränderna 3 och 4 i den övre panelen), vilket tyder på eventuell förorening med plasmamembranet, även om denna möjlighet är osannolikt vid låg hastighet med vilken denna pellet erhölls. En mer trolig förklaring är förekomsten av endoplasmatiska nätverket (ER) i 4000 × g pellets provet, vilket transport av Na, K-ATPas subenheter från akuten till plasmamembranet har visats av forskare13. Avsaknaden av Na, K-ATPas α1 protein i digitonin extraheras proverna (figur 4, körfält 1 och 2 på den övre panelen) visar renheten av denna fraktion.
I motsats till resultatet observerades under en framgångsrik fraktionering (figur 2), kan felaktig utförande av protokollet resultera i korskontaminering av cellulära komponenter (figur 3, figur 4). En hög koncentration av Na, K-ATPas α1 protein i 4000 × g pellets, jämfört med 18 000 × g pellets (figur 3 {övre panelen, lane 2-3] och figur 4B [övre panelen, körfält 5-12]), indikerar att andelen organell har förorenats med plasmamembranet proteiner. Förekomsten av GAPDH i någon fraktion än digitonin-extraherade cytoplasmiska provet (figur 3 [nedre panelen, lane 4] och figur 4A [nedre panelen, körfält 5-12] är en indikator på underlåtenhet att ta bort cytoplasmatiska proteiner i efterföljande steg.
Figur 1: Diagram över protokollet Cell fraktionering. En översikt av protokollet cell fraktionering representeras som ett flödesschema. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: framgångsrika isolering av U937 cellens cytoplasma, organell och membran fraktioner. Western blotting av cell fraktioner isolerade från två U937 cellkulturer och utforskad markörer av membran (Na, K-ATPas α1, övre panelen), mitokondrierna (VDAC, mellersta panelen) och cytoplasman (GAPDH, nedre panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: underlåtenhet att Fractionate U937 Cell komponenter. Western blotting av cell fraktioner isolerade från en enda U937 cellkultur visar kontaminering av den organell fraktionen (lane 2) med Na, K-ATPas α1 (övre panelen) och förlust av cytoplasmisk komponenter i supernatanten av membran pelleten (lane 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: korsa kontaminering av cytoplasmisk och membran komponenter under fraktionering. (A) fraktionering försök med cytoplasmiska korskontamination mellan GAPDH i organell (nedre panelen, körfält 5-8) och membran fraktioner (nedre panelen, körfält 9-12). (B) fraktionering försök med plasmamembranet kontaminering av Na, K-ATPas i mitokondriernas fraktioner (övre panelen, körfält 5-8). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sammansättning (lager koncentration) | Slutlig koncentration |
| Buffert A | NaCl (150 mM) och HEPES (50 mM) | 1 x (samma som lager) |
| Lyseringsbuffert B | HEPES (20 mM), KCl (10 mM), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 mM), EGTA (1 mM), Mannitol (210 mM) och sackaros (70 mM) | 1 x (samma som lager) |
| Prov buffert | Sodium dodecyl sulfate (0,1%) i Tris-buffrad koksaltlösning | 1 x (samma som lager) |
| Digitonin | Digitonin (250 µg/ml) i avjoniserat vatten | 25 µg/ml |
| Phenylmethanesulfonyl fluor | Phenylmethanesulfonyl fluor (100 mM) i 100% etanol | 1 mM |
| Proteas hämmare Cocktail | Varierar (se tillverkarens produktblad) | 1 X |
| Natrium Orthovanadate | Sodium Orthovanadate (500 mM) i avjoniserat vatten | 1 mM |
Tabell 1: buffrar och lösningar. Sammansättning av buffertar och nödvändiga lösningar för förfarandet.
| Protokoll steg | Kritisk faktor | Förklaring | Potentiella problem | Möjliga lösningar |
| Cell förberedelse | Cellkoncentrationen | Den optimala koncentrationen av celler som denna metod kan bearbeta måste bestämmas empiriskt för den celltyp som arbetas med för att få bästa resultat. | Högkoncentrerad cellsuspensioner kan leda till ineffektiva Lys, leder till låg avkastning av mitokondrier och membran fraktioner. | Utföra den inledande proceduren med en serie cell koncentrationer att bestämma bästa resultat. |
| Förbearbetning av celler | Cellerna måste vara i suspension för förfarandet för fraktionering, kräver detta demontering vidhäftande celler från kultur ytor eller homogenisering vävnader. | Ineffektiv behandling kan resultera i låg bråkdel avkastning, korskontaminering mellan subcellulär fraktioner eller andra oväntade resultat. | Säkerställa att metoden resulterar i tillräckligt med celler för förfarandet. Räkna celler i suspension att bestämma koncentrationen efter bearbetning och justera. | |
| Om metoden anställd äventyrar plasmamembranet, kan tidig Lys uppstå, vilket resulterar i korskontaminering av fraktioner. | Säkerställa att plasmamembranet integritet upprätthålls under cellen skörd med hjälp av metoder som inte skadar cellen. Verifiera membran integritet genom undersökning i Mikroskop med införandet av ett membran ogenomtränglig färgämne (t.ex. Trypan blå). | |||
| Cytosoliska Protein isolering | Digitonin koncentration | Den optimala koncentrationen av digitonin måste fastställas att undvika lys av celler samtidigt tillåta cytosoliska protein utvinning genom porerna bildas. | Höga koncentrationer av digitonin kan leda till membran bristning, cell lysis och kontaminering av den cytosoliska fraktionen. Suboptimal koncentrationer leder till ineffektiv utvinning av cytosoliska proteiner och eventuella korskontaminering av efterföljande fraktioner. | Koncentrationen av digitonin bör minskas om överdriven cellys observeras. En liten cellpelleten erhålls efter digitonin inkubation kan tyda membran bristning och cell lysis. |
| Efter extraktion Wash | Borttagning av digitonin och cytosoliska proteiner från permeabilized celler måste utföras för att undvika korskontaminering. | Underlåtenhet att tvätta cellerna tillräckligt efter cytosoliska utvinning kan resultera i föra över cytosoliska proteiner till andra fraktioner. | Ytterligare tvättar med buffert en följande digitonin inkubation kommer späd digitonin och återstående cytosoliska proteiner. | |
| Mitokondriell isolering | Cell Lysis | Lysis metoder måste vara noggrann att släppa cellulära innehållet, bibehållen mitokondriernas integritet för efterföljande isolering. | Mekaniska lys av celler kan vara ineffektiv, lämnar celler intakt och resulterar i låg avkastning av mitokondrie proteiner. | Hur mycket kraft som behövs för att lysera celler och släppa mitokondrierna måste bestämmas empiriskt för olika celltyper. Stora pellets erhålls efter steget Lys (liksom små mitokondrie och membran pellets) kan indikera suboptimala lysis. Öka mängden kraft (mortel stroke, nål passager, etc.) för att minimera post lysis pelleten. |
| För mycket mekanisk kraft kan lysera mitokondrier, kontaminerande plasmamembranet andelen med mitokondriell membranproteiner. | Minska mängden kraft om mitokondriell protein markörer finns i membranet prover. | |||
| Avlägsnande av skräp | Intakta celler och större fragment måste tas bort från Homogenatet efter Lys för att undvika kontaminering mitokondriell prover. | Mitokondriell prover kan kontamineras med cytoplasmiska komponenter eller plasma membranproteiner om skräp och intakta celler inte avlägsnas före pelletering mitokondrier. | Öka antalet lågt varvtal centrifugering steg före mitokondriell isolering spin. Om mitokondriell avkastningen är låg, kan man behöva spara pellets från låg hastighet snurrar och kontrollera via western blot för mitokondriell markörer. | |
| Efter isolering Wash | Mitokondriell prover bör tvättas noggrant för att ta bort kontaminerande skräp som kan pellets med dem. | Cellen fragment maj samlade och associate med mitokondrier, vilket leder till korskontaminering av cytoplasmisk eller membranproteiner. | Säkerställa att pellets är tillräckligt tvättas med buffert att avlägsna föroreningar. | |
| Membranet isolering | Centrifugeringstiden | Centrifugering gånger kan behöva förlängas för att öka avkastningen av membran bråkdel provet. | Beroende på det totala antalet bearbetade celler och cell lysis effektivitet, kan membran bråkdel prov avkastning vara låg. | Ökande centrifugeringstiden kan förbättra avkastningen av plasmamembranet bråkdel. Medan den föreslagna tiden räcker för en stor start mängd celler, kan längre gånger vara nödvändigt för mindre mängder. |
Tabell 2: kritiska steg. Sammanfattande tabell över protokollstegen, potentiella problem och möjliga lösningar för felsökning av protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av detta protokoll uppstod från en oförmåga att skilja mitokondrie och membran prover, med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit, för analys av protein localization under necroptosis14. De primära begränsningarna av premade kit är deras oförmåga att anpassas till behoven hos enskilda forskare, deras kostnad per prov och begränsat antal prov kunna bearbetas. Metoden presenteras här kan utföras utan användning av dyra reagenser och utan behovet av dyrbar utrustning. Denna metod kan skalas för att rymma valfritt antal celler och kan ändras för att passa behoven hos forskare. Detta gör avkastningen av respektive fraktion ökas, skräddarsy steg till den forskning som utförs och flexibilitet i genomförandet av metoden. Tillsats av natrium orthovanadate i buffertar kan utelämnas om forskare inte undersöker fosforylering tillstånd av proteiner i det slutliga provet. Införandet av SDS i slutliga bufferten kan jämväl utelämnas om forskare vill ytterligare rena prover via täthet lutning centrifugering. Medan vi har bara använt denna metod att framgångsrikt fractionate U937 celler, en icke-anhängare monocyt cellinje, bör förfarandet arbeta med flera cellinjer och vävnader, med små förändringar. Celler odlade i suspension kan vara pelleterat likaså i U937 celler som beskrivs här, medan vidhäftande cellinjer kräver dissociation från tillväxt ytan innan du påbörjar detta protokoll. Likaså måste vävnader homogeniseras grundligt innan fraktionering av celler. Detta kan åstadkommas genom att utnyttja en löst sittande Dounce Homogenisatorer, en Potter-Elvehjem glas-polytetrafluoroethene Homogenisatorer eller av andra (kommersiella) metoder15.
Det finns ett antal kritiska moment i det protokoll som behöver noggrann uppmärksamhet att erhålla optimala resultat och rena fraktioner (tabell 2). Koncentrationen av celler som rekommenderas här (steg 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 och 4.1.2) är specifika för U937 celler och var fast beslutna genom trial and error. Dessa värden kan behöva justeras för att passa olika typer av celler om suboptimala resultat erhålls när verkställande protokollet. Under cytoplasmiska utvinning steg (steg 3.1), måste koncentrationen av digitonin vara tillräckligt att permeabilize plasmamembranet utan helt lyseringslösning cellerna. Efter denna inkubation, celler måste tvättas noggrant ta bort cytosoliska proteiner från efterföljande steg eller korskontaminering sker i efterföljande prover (figur 4A). Homogenisering steget (steg 4.1.4) kan åstadkommas med någon form av mekanisk lysis, även om resultaten presenteras här erhölls med en Dounce Homogenisatorer. Ett alternativ till att använda en Dounce Homogenisatorer är att flera gånger passera celler en smalspårig nål (27 G rekommenderas, 20-40 passerar) tills tillräcklig cellys uppnås. Det kan vara nödvändigt att öka antalet stroke (eller spruta passerar) om en stor pellet av obruten celler erhålls efter homogenisering (steg 4.1.7). Forskare behöver förmodligen bestämma den optimala mängden homogenisering för typ av cell som fractionated. Borttagning av cellulära skräp efter homogenisering måste vara noggrann att undvika kontaminering av den organell fraktionen med plasmamembranet komponenter (figur 4B). Om detta inträffar, ska extra låg hastighet centrifugering åtgärder utföras för att ta bort cellulära skräp. Under utvecklingen av den här metoden testades upp till 18 h av centrifugering vid 18.000 × g , med minimal ökning av plasmamembranet avkastning över de 3 h spins (figur 2, körfält 5-6). Forskare kan finna det nödvändigt att öka centrifugering gånger att få bättre avkastning av plasmamembranet provet.
Metoden presenteras här är begränsat i jämförelse med de mer grundlig reningsmetoder som involverar ultracentrifugering. Utan användning av isopycnic täthet centrifugering är det inte möjligt att separera enskilda organeller erhålls efter cell homogenisering. Medan de 4000 × g fraktionerna innehåller mitokondrier (vilket framgår av förekomsten av VDAC, figur 2), innehålla de sannolikt också ER, golgi och ytterligare intracellulära organeller. Den organell fraktionen bör kontrolleras genom användning av ytterligare antikroppar mot protein markörer för andra organeller om detta är av betydelse för forskningen utförs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt
Acknowledgments
Arbetet stöddes av NIH-1R15HL135675-01 till Timothy J. LaRocca
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
