Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

Summary

Aqui, descrevemos como usar a triagem automatizada e opções de coleta de dados disponíveis em um pouco de luz síncroton síncrotron. Os cientistas enviar amostras de cryocooled para o síncrotron e as propriedades de difração são selecionadas, os conjuntos de dados são recolhidos e tratados e, sempre que possível, uma solução de estrutura é realizada — tudo sem intervenção humana.

Abstract

Feixes de raios-x de alto-brilho juntamente com automação conduziram ao uso de luz síncroton síncrotron-baseado macromolecular cristalografia de raios x (MX) para mesmo os projetos mais desafiadores em biologia estrutural. No entanto, a maioria das instalações ainda exigem a presença de uma cientista no local para realizar os experimentos. Uma nova geração de automática de Luz Síncroton, dedicado à caracterização automática de e coleta de dados de, cristais de macromoléculas biológicas foi recentemente desenvolvido. Essas beamlines representam uma nova ferramenta para biólogos estruturais para a tela os resultados de ensaios de cristalização inicial e/ou a coleção de um grande número de conjuntos de dados de difração, sem ter de se controlar a trajetória de usuários. Aqui nós mostramos como configurar um experimento para triagem automática e coleta de dados, como um experimento é realizado na trajetória, como os conjuntos de dados resultantes são processados, e como, quando possível, a estrutura de cristal da macromolécula biológica está resolvida.

Introduction

Determinar a estrutura tridimensional de proteínas específicas é crucial em biologia. A informação que é derivada de fazer então lança luz sobre a função biológica e sobre a forma e a especificidade do ativos e/ou vinculante sites contidos na molécula sob estudo. Em muitos casos, isso permite que os mecanismos de ação a ser determinado ou, se for caso disso, potenciais moléculas terapêuticas a serem desenvolvidas. MX é a técnica mais comumente usada para obter informações estruturais, mas um gargalo é a determinação das condições ideais para obter cristais bem diffracting. Portanto, os ensaios de cristalização são realizados em condições diferentes numerosos e são então selecionados, para encontrar os melhores cristais deve ser usado para coleta de dados de difração. A automatização da instalação de cristalização ensaios¹ ajudou claramente a este respeito. No entanto, as etapas subsequentes (ou seja, montagem de cristal, triagem de difração e coleta de dados de Difração) são geralmente realizadas manualmente, levando um monte de tempo, esforço e recursos. A automação de difração triagem e recolha de dados, portanto, significa um enorme ganho em tempo e eficiência.

Coleção de rastreio e dados de difração no MX mais geralmente é realizada no Síncrotron MX de luz síncroton no qual automação em grande medida facilitou este processo. No entanto, na maioria dos casos, é necessário que o cientista para estarem presentes a trajetória durante um experimento ou operá-lo remotamente. Recentemente, uma nova geração de completamente automatizado de luz síncroton MX tem sido desenvolvidos². Aqui, os usuários não precisam estar presentes, fisicamente ou remotamente, durante uma sessão experimental. Isso permite que os cientistas a gastar mais tempo com menos tarefas de rotina, ao invés de passar dias inteiros e muitas vezes noites, cristais de triagem e coleta de dados de difração. Trajetória de totalmente automatizada primeira do mundo é o maciçamente automatizada amostra seleção usina integrada (maciço-1, ID30A-1)^2,3 na radiação síncrotron Europeu Facility (ESRF). Tem um ambiente único exemplo em que uma alta capacidade contendo amostra dewar opera em conjunto com um alterador robótico amostra que também atua como goniômetro^{4,5 a trajetória}. MACIÇO-1 é uma trajetória de undulator equipada com um único fóton-contagem de híbrido pixel detector⁶, que opera no comprimento de onda fixo de 0.969 Å (12.84 keV) com um feixe intenso de raio-x (2 x 10¹² fótons/s). O tamanho do feixe na posição de amostra pode ser ajustado entre um mínimo de 10 µm (feixe redondo) a um máximo de 100 µm x 65 µm (horizontal pelo tamanho vertical do feixe). Em média, a trajetória pode processar, em um totalmente automático da forma 120 cristais (veja abaixo), em 24 h. A operação da trajetória é baseada em uma série de fluxos de trabalho⁷, cada uma das quais toma decisões inteligentes com base no resultado das etapas anteriores do fluxo de trabalho, para assegurar a medição dos melhores dados possíveis da amostra em estudo. Em particular, a avaliação das características de difração de uma amostra individual leva em conta cristal volume e fluxo e garante, onde o cristal é maior do que o feixe de raios-x, que só a melhor região do cristal é usado para dados subsequentes coleção. Conjuntos de dados de difração são, assim, otimizados para uma resolução máxima com a radiação minimizada dano^2,3. Exigentes protocolos de coleta de dados, como estratégias de coleção pseudo helicoidal (multi-posições) dados para ambos coleta de dados de difração anômala nativo e single-comprimento de onda (SAD), também estão disponíveis⁸.

Experimentos completamente automáticos no maciço-1 envolvem cryocooling e montagem de cristais em um monte de amostra magnética adequado para o padrão de equipamento desejado beamline pinos da coluna⁹, inserindo os parâmetros desejados e experimentais no ' difração plano ' da tabela no sistema integrado de cristalografia de proteínas de luz síncroton (ISPyB)¹⁰, um sistema de gestão de informação baseado na web para experimentos de MX e envio de amostras para a trajetória. A ESRF, todos os custos do transporte das amostras de/para a trajetória são com o apoio do escritório do usuário ESRF (consulte o site do ESRF¹¹ para obter detalhes). No maciço-1, sem restrições são colocadas sobre o tamanho do laço ou qualidade de cristal. Ao escolher um plano de difração por um cristal de determinado, o usuário pode usar as configurações padrão ou escolher entre fluxos de trabalho específicos, que podem ser personalizados para cada amostra. Dispõem de vários fluxos de trabalho pré-programados. O fluxo de trabalho³ MXPressE, o loop de amostra contendo primeiro é alinhado para a posição de amostra usando a centragem óptica. Então, X-ray-based centralização assegura que a melhor região do cristal é centralizado para o feixe de raio-x. Estratégias de coleta de dados, em seguida, são calculadas usando eEDNA, um framework para o desenvolvimento de aplicativos baseados em plugin especialmente para análise de dados on-line no campo de experimentos de raios-x, tendo em conta cristal volume e o fluxo em tempo real com a trajetória. Após a recolha de um conjunto de dados completo de difração, isto é então processado usando uma série de condutas de tratamento automático de dados¹² e os resultados são disponibilizados para inspeção e download em ISPyB. O fluxo de trabalho do MXPressE SAD³ visa cristais selenometionina-contendo da proteína alvo e explora o fato de que a energia de funcionamento do maciço-1 é apenas acima da borda Se K. Aqui, a estratégia de coleta de dados de eEDNA MXPressE é otimizada para coleta de dados triste (ou seja, alta redundância e com a resolução definida para onde o R_mesclagem entre pares Bijvoet é inferior a 5%). Para as propriedades de difração de uma série de cristais sem coleta de dados subsequentes da tela, o fluxo de trabalho do MXScore³ pode ser usado para produzir uma avaliação de qualidade total dos cristais analisados. O fluxo de trabalho³ MXPressI, dos dados de rotação de 180 ° são coletados usando oscilações de 0,2 ° e o ângulo phi inicial e a resolução determinada por uma estratégia de eEDNA. MXPressO ³ inclui uma resolução de preobserved para o fluxo de trabalho (padrão: d_min = 2 Å). Para fazer uma avaliação inicial dos cristais resultantes de uma julgamento de cristalização, MXPressM³ fluxo de trabalho é oferecido. Isto executa uma malha do elevado-dose varredura sobre a orientação mais ampla do suporte de amostra com nenhuma coleção de dados ou centralização. Recentemente, dois novos experimento fluxos de trabalho, MXPressP e MXPressP_SAD, que realizam coletas de dados pseudohelical, têm sido implementadas⁸. A execução de todas as etapas em todos os fluxos de trabalho pode ser acompanhada on-line e em tempo real pelo usuário, através de ISPyB.

Aqui nós mostramos como preparar um experimento MX totalmente automatizado no maciço-1 e como recuperar e analisar os dados resultantes da experiência. Como exemplo, usamos a proteína de sistema de clivagem de glicina mitocondrial humano H (GCSH). Esta proteína de contendo ácido lipoico é parte do sistema de clivagem da glicina responsável pela degradação da glicina. Mais, este sistema inclui a proteína P, uma descarboxilase de glicina dependente de fosfato de piridoxal, a proteína de T, uma enzima tetrahidrofolato-reque e a proteína L, um lipoamide desidrogenase. GCSH transfere o grupo metilamina de glicina da proteína P para a proteína de T. Defeitos na proteína H são a causa de nonketotic hyperglycinemia (NKH) em seres humanos¹³.

Protocol

Nota: A produção, purificação e cristalização de GCSH são descritos no arquivo complementar 1.

1. breve descrição da preparação off-line e montagem de cristal

1. Posição um loop de nylon ou outro suporte de montagem de cristal já fixado um pino da coluna sob um ou mais cristais e levantá-los fora da solução de precipitação (20 µ l de 0,5 M de sódio formiato pH 4.0 + 25 µ l de solução de proteína).
   1. Remova o líquido em massa ao redor do crystal(s) tocando a montagem com uma mecha de papel para chupar qualquer excesso de líquido.
2. Mergulhe o crystal(s) na cryoprotective solução contendo a solução de precipitação mais 30% de glicerol; Então, remova o suporte de cristal e o crystal(s).
   1. Remova o líquido em massa ao redor do crystal(s) tocando a montagem com uma mecha de papel para chupar qualquer excesso de líquido.
3. Mergulhar a montagem de um frasco de coluna preenchido com nitrogênio líquido e armazená-lo, juntamente com quaisquer outros cristais preparados da mesma forma, em um laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) / ESRF amostra trocador disco⁹ a temperatura do nitrogênio líquido.
   Nota: Os crystal(s) é estáveis nessa condição até que o beamtime está disponível.

2. solicitando beamtime no maciço-1

1. Solicite beamtime tão cedo quanto possível, na página inicial da ESRF (em http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Nota: Há um número de modos possíveis de acesso para o MX ESRF de luz síncroton. Laboratórios podem aplicar coletivamente como parte de um grupo de alocação de bloco (saco), ter beamtime alocado por 2 anos. Se grupos que pretendam candidatar-se individualmente, eles podem aplicar para rolar o acesso, o que lhes permite acesso rápido para o de Luz Síncroton, após revisão por pares. A proposta do grupo será analisada e liberada pelo grupo de segurança ESRF quem pode solicitar detalhes adicionais. Se a proposta for aceite, serão comunicadas uma experiência número e senha. Pesquisa proprietária pode ser realizada através da compra de beamtime.
2. Complete o treinamento de segurança requeridos on-line (em http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Livro beamtime do calendário maciço-1.
   Nota: É possível reservar a um máximo de 50 titulares de amostra para ser analisada por turno.
4. Preencha uma forma de declarar um experimento pelo correio (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), juntamente com as informações de segurança necessárias, para as amostras que estão a ser medido.

3. criação de um plano de difração em ISPyB

Nota: O plano de difração contém todas as informações necessárias para uma amostra em ISPyB e pode conter informações adicionais para adequar o experimento realizado para cada amostra.

1. Abrir ISPyB (em https://exi.esrf.fr/).
2. Escolha as experiências de MX.
3. Fazer login com o experimento número e senha.
4. Clique na expedição | Adicionar nova e fornecer as informações necessárias. Clique em salvar.
5. Clique em Adicionar parcela e preencha as informações solicitadas. Clique em salvar.
6. Em seguida, clique em Adicionar recipiente, dar o código de barras do disco como o nome e escolher o disco vertebral. Clique em salvar.
7. Clique sobre o símbolo do contentor e Editare preencha as informações necessárias, como nome de proteína, trabalho preferido, posição de cristal no disco, etc., sobre as amostras.
8. Escolha a proteína (por exemplo, GCSH ou lisozima) que tenha sido aprovada pelo grupo de segurança ESRF.
9. Digite um nome exclusivo de amostra para identificar cada amostra individual. É possível, opcionalmente, digitalizar o código de barras do pino. O resto da informação abaixo é opcional.
10. Insira as informações opcionais.
    1. Para cada amostra individual, insira o tipo de experimento (i.e., MXPressE_SAD, pontuação ou MXPressO, etc., padrão MXPressE) sob Exp. tipo. Isso define qual fluxo de trabalho automático será usado para processar cada cristal. Dado que os cristais GCSH são agulhas, escolha MXPressP.
    2. Inserir um grupo de espaço (por exemplo, P1, P2 ou C2₁2₁2₁), se conhecido. Se estiver presente, este será usado para cálculos de estratégia de coleta de dados e pelos pipelines de processamento automático de dados disponíveis.
    3. Digite a resolução desejada (padrão: d_min = 2,0 Å). Define a distância de cristal-para-detector de varreduras de malha inicial, caracterização e coleta de dados padrão.
    4. Defina a resolução limite desejado (por exemplo, 1.5 Å ou 2.3Å), para evitar que a coleção de conjuntos de dados cheios de cristais que não difração para esse limite. Isto pode salvar tempo de análise e espaço de armazenamento de dados.
    5. Definir a integralidade necessária (padrão: 0,99). Definir a multiplicidade exigida (padrão: 4). se mais de um cristal está contido o suporte de amostra, defina o número máximo de cristais para ser analisado. O valor padrão é 1 ou 5 para MXPressP.
    6. Selecione o tamanho apropriado do feixe (padrão: 50 µm). Se um valor específico não estiver seleccionado, o X-ray-centralização e cálculos de estratégia de coleta de dados serão executados com um tamanho de feixe de 50 µm.
       Nota: Durante qualquer subsequente coleção completas de conjuntos de dados, o tamanho do feixe será adaptado automaticamente.
    7. Colocar no grupo de espaço, se conhecido, na coluna espaço forçada do grupo. Defina a radiação-sensibilidade dos cristais (0.5 – 2.0 para baixa a alta sensibilidade, com um valor padrão de 1).
11. Se desejar, defina o ângulo de rotação total a recolher para a coleção de conjunto de dados completo (padrão: o ângulo de rotação total determinado pelo eEDNA).
12. Salve os valores. Clique em retornar às transferências. Pressione Enviar remessa de ESRF.
13. Imprimir a etiqueta de envio e enviar as amostras. Os usuários devem organizar uma pick-up com um mensageiro, usando os detalhes de conta ESRF.
    Nota: É muito importante selecionar incluir rótulo retorno para permitir o regresso sem emenda de amostras (ver https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. recuperação, visualização e coleta de dados

Nota: No dia do experimento, as amostras são transferidas para o maciço-1 alta capacidade Dewar (HCD). Trajetória de cientistas e iniciar a coleta de dados, que pode ser seguida pelos usuários remotamente. Para cada tipo de amostra diferente, os usuários recebem um e-mail informando que a coleta de dados foi iniciada. Como já observado, a execução de todas as etapas em todos os fluxos de trabalho pode ser acompanhada on-line e em tempo real pelo usuário através do ISPyB, do qual os resultados podem ser vistos e baixados.

1. Para cada amostra analisada, examine os resultados do experimento automático em ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Logar-se, usando o experimento número e senha e clique na sessão desejada experimental em ID30A-1.
   2. Selecione o preferencial (top-marcando) autoprocessamento pipeline (por exemplo, granadas ou XDS_APP) e baixar os dados escritos para fora no grupo espaço correto com a integridade mais alta e mais alta resolução clicando na Última coletar resultados e, em seguida, fazer o Download.
      Nota: Todas as imagens de malha, linha e caracterização são em um subdiretório para cada amostra, chamado /MXPressE_01. A ESRF automaticamente executa cinco pacotes de transformação separada, ou seja EDNA_proc¹², granadas¹², XDS_APP¹⁴, autoprocedimento¹⁵e XIA2¹⁶. Integração de dados baseia-se na XDS, com excepção dos XIA2, que é baseado em mostradores. Todos os pacotes também são executados em modos anómalos e nonanomalous, permitindo a detecção automática de um sinal anômalo, se estiver presente nos dados, para ser usado em SAD eliminação de protocolos. Cada pacote usa parâmetros diferentes e árvores de decisão, significando que alguns pacotes executar melhores com determinadas. No entanto, isso pode fazer para um grande número de resultados quando o número de pacotes e grupos de espaço possível é contabilizado. Os resultados são, portanto, classificados mais ou menos baseado na resolução e outras métricas de qualidade, tais como R_mesclagem no escudo de resolução mais baixo, CC(1/2) e completude. Isto é destinado a orientar o usuário para os melhores conjuntos de dados, mas todos os grupos de espaço possível e os resultados devem ser cuidadosamente inspecionados.
2. Descompacte a pasta de download, que incluirá todos os arquivos de log e XDS_ASCII não mesclado. HKL e arquivos .mtz mesclado e dimensionado.
   Nota: no caso da estrutura (no formato PDB) da proteína de interesse ou um homólogo perto foi enviada para o ISPyB no início do experimento, o pipeline de autoprocessamento no ESRF executará automaticamente uma substituição molecular (MR) executada usando essa estrutura como o modelo de pesquisa sobre a melhor solução de pontuação. Os resultados do senhor pipeline são exibidos em ISPyB e podem ser encontrados na pasta de dados processados (por exemplo, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Aqui, o modelo final será denominado coot1.pdb e o sidechains.mtz de dados de reflexão. Observe que o gasoduto pode reduzir a simetria da célula (redução de célula primitiva) a fim de aumentar a probabilidade de encontrar uma solução. No caso aqui, o senhor pipeline escreveu a solução em uma célula monoclínica (C2) em vez de uma célula ortorrômbica (C222₁). Detalhes sobre como realizar uma substituição molecular executarem manualmente (exemplificado para a solução de autoprocessamento segunda melhor pontuação) estão incluídos nos Arquivos complementares.

Representative Results

O fluxo de trabalho de MXPressP foi usado na trajetória do ESRF maciço-1 para, totalmente automática, montar, centro com o feixe de raios-x, caracterizar e coletar os conjuntos de dados de difração completa de uma série de cristais de GCSH humana. As amostras foram montadas e o loop analisado para uma área de varredura (Figura 1, à esquerda). Após a análise de difração, quatro pontos foram selecionados dentro do cristal para coleta de dados (Figura 1, direita). Posterior processamento por gasodutos de análise automatizada de dados, incluindo o pipeline do senhor, rendido a conjuntos de dados de alta qualidade (tabela 1) para que uma solução de deputado foi encontrada. Este último permite que os usuários rapidamente avaliar se o conjunto de dados obtido e o modelo de pesquisa utilizados são adequados para eliminação por substituição molecular. Além disso, a presença de ligantes pode ser julgada, permitindo ao usuário focar apenas os conjuntos de dados mais promissoras para uma análise mais aprofundada. Determinação da estrutura manual pelo Sr rendeu um mapa de densidade de elétrons de alta qualidade depois automatizada de um único ciclo de refinamento (Figura 2a). Para este conjunto de dados, o pipeline automatizado corta os dados em um 1.32 Å resolução; no entanto, os usuários ainda podem decidir cortar os dados com uma resolução menor para chegar a estatísticas de qualidade diferente (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_meas) na camada mais alta resolução. A estrutura de cristal da estrutura GCSH humana é similar da proteína bovina (3KlR)¹⁶.

Densidade de elétrons contínua é visível para a cadeia inteira de aminoácido, além da marca de histidina N-terminal. Das quatro substituições que distinguem a GCSH humana e bovina, três são facilmente identificáveis da densidade de elétrons (Ile/Val66, Asp/Glu98 e Leu/Phe149; Figura 2b -d). Isto é menos claro para a substituição de Asp/Lys125 para que a densidade de elétrons da cadeia lateral é apenas parcialmente resolvida devido a flexibilidade (Figura 1e). O modelo atualmente obtido tem R_trabalhar e R valores_livre de 20,4% e 23,8%, respectivamente e pode ser ainda mais otimizado por mais ciclos de construção automatizada e manual modelo e refinamento.

	Pipeline de granadas	Pipeline de XDS_APP
Processamento e coleta de dados
Fonte de raio-x / Beam linha	ESRF / MACIÇO-1
Comprimento de onda (Å)	0.966
Resolução (Å)	41.88 – 1.48 (1.53-1.48)	41.86-1.32 (1.39-1.32)
Reflexões de total/exclusivo	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Grupo de espaço para indexação, dimensionamento e fusão	C222	C2221
Dimensões da célula
a, b, c (Å)	42.20, 83,75, 95.85	42,19, 83.72, 95,82
Mosaicity	0.05	0.05
Rmeas (%)	10.0 (110,7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9.6 (1.3)	7.6 (0.7)
CC1/2 (%)	99.7 (53,9)	99.7 (19,1)
Completude (%)	99.6 (99,6)	99,5 (98,6)
Multiplicidade	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
Substituição molecular e refinamento do modelo preliminar
Grupo de espaço para eliminação gradual	C2	C2221
Dimensões da célula
a, b, c (Å)	83.74, 42.18, 95,82	42,19, 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Modelo de pesquisa para deputado (PDB)	3KLR	3KLR
Moléculas de proteína / ASU	2	1
Resíduos de proteína	250	125
Rtrabalhar/rlivre (%) após 1º refinamento	24,3 / 26.5	20,4 23.8
Distância de ligação RMSD (Å) após 1º refinamento	0.01	0.01
Ângulo de ligação RMSD (°) após 1º refinamento	1.2	1.83
Rotamer outlier (%) após 1º refinamento	1,07	4.29
Roberta favorecida/permitido/não permitido (%) após 1º refinamento	95.93 / 4,07 / 0	95.12 / 4.88 / 0

Tabela 1: estatísticas de coleção, refinamento e validação de dados de difração de raios x. Valores para o shell de resolução mais alta são dadas entre parênteses.

Figura 1: amostra de análise antes da coleta de dados. (A) a região selecionada para digitalização é mostrado por uma caixa vermelha. (B) a análise de imagens de difração é mostrada como um mapa de calor. Quatro posições dentro do cristal localizado foram selecionadas para coleta de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: validação Visual dos mapas de densidade de elétrons obtidos após refinamento. Mapas de densidade de elétrons contorneados em 2 x nível r.m.s em torno de (um) Trp143, (b), Val66 (Ile de GCSH humana) e (c), Glu98 (Asp na GCSH humana) e mapas de contorno em 1 x r.m.s nível em torno de (d), Phe149 (Leu em GCSH humana) e (e) Lys125 (Asp na GCSH humana). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Totalmente automáticos beamlines fornecer automatizada caracterização e recolha de dados de um grande número de cristais macromoleculares sem a presença de um cientista, na trajetória ou remotamente, sendo necessário. Uso de luz síncroton completamente automatizado tem muitas vantagens em comparação com operação manual. Por exemplo, a amostra automatizado, centrando-se, com base em malha de raio-x e a linha varreduras, é mais precisa do que o realizado com o olho humano como não é afetado pelos efeitos térmicos ou ópticos. Com efeito, esses exames de malha e linha fornecem dados adicionais (ou seja, detalhadas dimensões de cristal e o melhor diffracting região do cristal) que são importantes em determinar o tamanho do feixe correto a ser usado para coleta de dados — especialmente para pequenos cristais ¹⁸— e muitas vezes resultam em uma melhoria da qualidade dos dados obtidos de difração. Além disso, tirando proveito dos parâmetros definidos pelo usuário na instalação de experimentos automáticas, as etapas em fluxos de trabalho específicos podem ser adaptadas para melhor se adequar ao sistema sob estudo, otimizando ainda mais a taxa de sucesso do experimento.

Juntos, levando a confiabilidade dos fluxos de trabalho disponíveis, o acesso directo da trajetória (usuários agendar Self, usando um calendário [veja acima]) e a abordagem totalmente automatizada de maciço-1 fornece um rigoroso, alta produtividade e economia de tempo alternativa à clássicas experiências práticas de MX e o potencial para implementar mais avançados procedimentos e aplicações em fluxos de trabalho automáticos. Num futuro próximo, cartografia de cristal em 3D¹⁹ será implementada para melhorar a precisão de centragem de raio-x, enquanto protocolos mais complexos, tais como experimentos de desidratação cristal²⁰, serão automatizados. Espera-se que a coleta de dados totalmente autónoma vai se tornar um método padrão no MX, fornecendo dados de alta qualidade para telas de fragmento pequeno-molécula, otimizando a seleção de um grande número de mal diffracting cristais e fornecendo automaticamente fase informações para resolver o cristal estruturas de novo. Em combinação com a evolução da colheita automatizada de cristais²¹, a possibilidade de solução de estrutura de cristal da proteína como um serviço automatizado bem poderia se tornar uma realidade.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
AUTO processing of images		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
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