我们描述了一个定量实时体外细胞解检测系统,以评估嵌合抗原受体T细胞针对液体和固体肿瘤细胞的效力。该协议可以扩展以评估其他免疫效应细胞,以及联合治疗。
治疗癌症的奇美抗原受体(CAR)T细胞治疗,对儿童急性淋巴细胞白血病等耐药和耐火血液恶性肿瘤有显著的临床效益。目前正在努力将这种有前途的疗法推广到固体肿瘤,以及其他血液学癌症。在这里,我们描述了在固体和液体肿瘤细胞上以抗原为目标的强效CAR T细胞的开发和生产。 然后,使用基于高灵敏度阻抗的xCELLigence测定,实时评估这些CAR T细胞的体外效力。具体来说,考察了不同成本信号域的影响,如糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关蛋白(GITR)对CAR T细胞体外效力的影响。本报告包括:使用慢病毒基因转导的临床前研究生成CAR T细胞,扩大CAR T细胞,验证CAR表达,以及运行和分析xCELLigence效力测定。
近年来,CAR T细胞治疗是复发和难治性造血恶性肿瘤的癌症免疫治疗最突出的突破之一。与最近的美国 美国食品和药物管理局(FDA)批准CD19定向CAR T细胞用于急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和扩散性大B细胞淋巴瘤,并指定突破性治疗B细胞成熟抗原(BCMA)导向的CAR T细胞用于多发性骨髓瘤,该技术在科学界引起了极大的轰动,并推动了全球众多基础、应用和临床研究。 4,5.2019年1月,临床试验数据库登记了700多项临床试验(clinicaltrials.gov);其中约450项试验即将开始或正在积极招募患者。大多数临床试验都集中在血液恶性肿瘤,利用CAR T细胞靶向CD20,CD22和BCMA,除了CD19,临床试验正在进行以及6,7。虽然大多数试验都使用自体CART细胞疗法,其中相当一部分也在探索异源性CART细胞8、9、10的效用。尽管血液恶性肿瘤取得了可喜的结果,但事实证明,使用CAR T细胞靶向实体肿瘤的难度要大得多,原因多种多样,包括但不限于缺乏肿瘤中唯一表达的良好靶点,实体肿瘤和肿瘤”逃逸”的异质性,以及CAR T细胞在进入肿瘤微环境11、12、13、14方面遇到的困难。15.迫切需要开发固体肿瘤特异性CAR T细胞,以克服这些疗效障碍和”靶向肿瘤”毒性问题。虽然在设计和测试CAR T细胞时需要多种体外和体内方法,但强健和预测性的体外效力测定是最重要的16,17。
为了评估CAR T细胞的效力,已经开发出各种体外方法。一般来说,这些效力测定可以分为两大类,这取决于它们(i)是否直接测量CAR T细胞对靶性肿瘤细胞的细胞解物活性,或(ii)测量替代标记物,如CAR T细胞在杀死目标细胞时释放的细胞因子。直接测量细胞解物活性的技术包括铬-51释放测定(CRA)18、利用荧光探针19、20测量目标细胞凋亡的成像测定法,以及检测凋亡靶细胞21的流式细胞测定测定。在这些测定中,CAR T细胞通常与目标细胞共同培养,这些细胞已预先标记了放射性或荧光探针,然后进行适当的测量。虽然它长期以来因其敏感性而被认为是该领域的黄金标准,但CRA有一些缺点。首先,它是端点测定,不提供动力学信息。其次,目标细胞需要贴上铬-51的标签,铬-51倾向于从细胞中渗出,并能显著增加背景噪声22。最后,它要求采取适当的预防措施和处置放射性废物。替代测定法测量CAR T细胞与靶细胞相互作用的副产品,作为效力的表示,包括使用基于流细胞学的方法或酶链接免疫吸附剂测定的CAR T细胞释放的各种细胞因子的定量。再次,这些是终点测定,测量细胞因子在给定时间点的累积释放,因此,不一定反映CAR T细胞的实际细胞解物活性。
当开发效力测定时,尤其是定义基于细胞的治疗的释放标准(如 CAR T-cell)的测定标准时,分析必须涉及最少的操作和动手时间,因为每次相互作用都是另一个需要考虑的变量,并且会降低测定的整体鲁棒性和一致性。此外,CAR T细胞与肿瘤细胞的相互作用是一个动态过程,提供有关这些动态相互作用的信息,如细胞分析率,对于效力评估至关重要。考虑到这些标准,我们为CAR T细胞开发了无标签动力学效力测定,利用xCELLigence实时细胞分析(RTCA)平台。xCELLigence 利用专用的微子板 (E-Plates),每个井底部都嵌入了金色生物传感器。这些生物传感器使用粘附固体肿瘤细胞或使用特定抗体系结的液体癌细胞,实时监测目标细胞数、细胞大小、细胞基质附着强度和细胞-细胞相互作用(即屏障功能)17、23、24、25、26、27、28的变化。工作流程很简单,只需将目标细胞播种到电子板的孔中,然后以不同的效应器与目标比率添加 CAR T 细胞(图 1)。随后,当生物传感器持续监测目标细胞的生存能力时,数据会自动实时显示。
在过去的15年中,xCELLigence测定已经验证了评估自然杀伤细胞(NK)细胞、T细胞、CAR T细胞、检查点抑制剂、双特异性抗体、溶酶病毒以及一些联合疗法17、29、30、31、32、33、34的效力。最近,xCELLigism效力测定被评估为制造T细胞受体(TCR)工程T细胞35。在这里,我们报告使用RTCA系统来评估CAR T细胞的体外效力,旨在靶向临床治疗中的实体肿瘤和液体肿瘤。
奇美抗原受体是由细胞外单链可变片段(scFv区域)、铰链区、跨膜区域和细胞质域组成的多域蛋白,由来自CD28和OX4011、40等受体的TCR信号域和附加成本化域组成。为了设计安全、选择性和有效 CARs,必须使用体外效力测定以及最终的动物模型对 CARs 设计中的各种排列进行彻底测试。在这项研究中,我们为实时体外效力测定如何为有效CARs的设计提供信息提供了一个协议和工作流程。
在设计任何类型的效力测定,特别是用于制造目的时,必须使测定具有敏感性、稳健性、一致性,并尽可能接近作用机制16、17、41。此处描述的实时效力测定旨在直接测量 CAR T 细胞的细胞解物活性,而不是使用代位标记物(如细胞因子释放)。重要的是,除了测定板(E-Plate)和用于维持细胞的推荐介质外,该测定不需要任何额外的成分,如染料或试剂。此外,与其他基于标签的测定42、43、44相比,该测定具有极其灵敏的灵敏度,提供高度可重复的数据。此外,xCELLigence 测定适用于使用极低的效应器与目标比,这是评估特定细胞测定的理想选择。
为了证明xCELLigence系统的灵活性和实用性,我们重点研究了两种肿瘤类型,即血液源肿瘤和实体肿瘤。为了评估CD22定向CAR T细胞的效力,Raji细胞(即B细胞淋巴瘤细胞系)使用抗CD40抗体系在E-Plates上。将 Raji 细胞与 E-Plates 底部连接,会产生阻抗信号,反映井中 Raji 细胞的存活性和数量。在加入CD22-CAR T细胞后,拉吉细胞以时间与效应素相关的方式选择性地杀死,最终导致阻抗信号的时间依赖性降低。阻抗的下降表示拉吉细胞17的细胞化或生存能力丧失。这种使用抗体的选择性系绳方法可以扩展到其他液体肿瘤细胞系。使用血液学来源的肿瘤细胞系的另一种策略是使用粘附癌细胞,这些癌细胞被设计为能稳稳地表达肿瘤抗原,如在HeLa细胞中表达的CD19。这种方法的优点是,亲HeLa细胞是现成的,并可用作负控制特异性。这种方法已经验证与CHO-CD22vsCHO细胞和CHO-BCMAs对CHO细胞29。使用这种不同的方法,CAR T细胞的设计和有效性可以很容易地测试。xCELLigence 测定具有固有的灵活性,可以调整测定条件,以最大限度地近似生理条件。
我们在这里描述的效力测定的一个主要优点是,它是一种简单的功能测定,可与基因工程技术结合使用,以高通量方式设计最佳且有效的 CAR。如此处所示,针对EGFR阳性癌细胞的CAR T细胞,该测定可用于评估不同CAR结构/突变体的相对活性。例如,我们表明,当 GITR 域位于 CD3 域的上游时,它比 CD3 域下游的细胞解解活性要强得多。
虽然它与体内CAR T细胞活性不完全相关,但体外细胞因子释放历来被用作衡量CAR T细胞效力的指标。尽管此处描述的基于 xCELLigence 的药效测定可用于在制造期间或发布用于临床应用之前评估基于细胞的疗法,但这些结果与体内疗效的关联程度尚未建立。体内的功效取决于一系列因素和变量,这些因素和变量在体外测定中可能无法重述。这些变量包括:将CAR T细胞定位到肿瘤部位,刺激和激活CAR T细胞及其在患者体内的持续存在能力,以及肿瘤微环境。通过进一步改进,xCELLigence 测定可能能够在体外对其中一些复杂过程进行建模。
此处提供的方案适用于大多数粘附性癌细胞系和一些液体肿瘤细胞系。然而,由于肿瘤类型和阶段的复杂性,临床样本,如原发性癌细胞,需要进一步测试和优化。值得注意的是,这里描述的体外效力测定系统只使用癌细胞系来反映CAR T细胞的潜在活性。人体内部的真实肿瘤情况更为复杂,特别是由于肿瘤动态环境和发展,当实体肿瘤被靶向时。因此,效力评估结果可能不会很好地转化为测试的CAR T细胞的临床疗效。
总之,基于阻抗的xCELLigence平台允许对细胞杀灭进行长时间无标签的监测,即长达10天。这种用于数据收集的长时间尺度的能力使该技术与当前使用的其他检测技术不同,后者需要为时间点收集和耗时的样本操作设置多个实验复制。此外,效应器免疫细胞的最小信号贡献简化了数据分析。该软件可以自动处理数据并生成有用的参数,如细胞分析的百分比,KT50等。该技术已经显示出高灵敏度(E:T比率低至1:20)和较大的动态范围(E:T比率从20:1到1:20),这在其他测定中不容易实现。总体而言,该技术的实施应能以更高的吞吐量规模进行更准确的数据分析,从而促进CAR T细胞试剂的开发,从而以更高的速度推进该领域的发展。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢ProMab生物技术和ACEA生物科学提供了在这项研究中使用的试剂和仪器。
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |