Vi beskriver en kvantitativ Real-Time in vitro cytolyse assay system til at evaluere styrken af chimerisk antigen receptor T celler rettet mod flydende og solide tumorceller. Denne protokol kan udvides til at vurdere andre immun Effector celler, samt Kombinationsbehandlinger.
Chimeric antigen receptor (bil) T-celleterapi for kræft har opnået betydelige kliniske fordele for resistente og refraktære hæmatologiske maligniteter såsom barndom akut lymfocytisk leukæmi. Indsatsen er i øjeblikket i gang for at udvide denne lovende terapi til solide tumorer i tillæg til andre hæmatologiske kræftformer. Her beskriver vi udviklingen og produktionen af potente bil T-celler rettet mod antigener med unikke eller præference udtryk på faste og flydende tumorceller. In vitro-styrken af disse bil T-celler evalueres derefter i realtid ved hjælp af den meget følsomme impedans-baserede xCELLigence-analyse. Specifikt, virkningen af forskellige costimulatory signalering domæner, såsom glukokortikoid-induceret tumor nekrose faktor receptor (TNFR)-relaterede protein (GITR), på in vitro-styrken af bil T celler undersøges. Denne rapport indeholder protokoller for: generering af bil T-celler til prækliniske studier ved hjælp af lentiviral gentransduktion, ekspanderende bil-T-celler, validering af bilekspression og kørsel og analyse af xCELLigence potens assays.
I de seneste år, bil T-celleterapi har været en af de mest fremtrædende gennembrud i Cancer immunterapi for recidiverende og refraktære hæmatopoietiske maligniteter. Med den seneste amerikanske Food and Drug Administration (FDA) godkendelse af CD19-instrueret bil T celler for akut lymfoblastær leukæmi, non-Hodgkin lymfom, og diffus stor B-celle lymfom, og udpegelsen af gennembrud terapi for B-celle modning antigen (bcma)-instrueret bil T celler for multipelt Myeloma, denne teknologi har genereret stor spænding i det videnskabelige samfund og har næret talrige grundlæggende, anvendt, og kliniske undersøgelser på verdensplan1,2,3, 4,5. I januar 2019 blev der registreret mere end 700 kliniske forsøg i databasen over kliniske forsøg (clinicaltrials.gov). omkring 450 af disse forsøg var enten ved at starte eller var aktivt at rekruttere patienter. De fleste af de kliniske forsøg er fokuseret på hæmatologiske maligniteter, og kliniske forsøg udnytter bil T celler rettet mod CD20, CD22, og bcmas, ud over CD19, er i gang samt6,7. Mens de fleste af de forsøg, der bruger autologt bil t-celleterapi, et betydeligt antal af dem er også at udforske nytten af allogen bil t celler8,9,10. Trods lovende resultater med hæmatologiske maligniteter, brugen af bil T celler til at målrette solide tumorer har vist sig at være langt vanskeligere i klinikken for en række forskellige årsager, herunder men ikke begrænset til manglen på gode mål, der udelukkende udtrykkes i tumoren, heterogeniteten af solide tumorer og tumor “undslippe”, og den vanskelighed, at bil T celler har i adgang til tumor mikromiljø11,12,13,14, 15. der er et kritisk behov for udvikling af solide TUMOR specifikke bil-T-celler, som kan overvinde disse barrierer for effektivitet og problemet med “on Target-off tumor” toksicitet. Mens et væld af in vitro og in vivo tilgange er berettiget i design og afprøvning af bil T-celler, en robust og forudsigende in vitro-styrke analyse er af primær betydning16,17.
For at vurdere styrken af bil T-celler, forskellige in vitro-metoder er blevet udviklet. Generelt kan disse potens analyser opdeles i to brede kategorier, afhængigt af om de (i) direkte måler den cytolytiske aktivitet af bil t-celler mod måltumor celler, eller (II) måler surrogatmarkører som cytokiner, der frigives af bilens t-celler, da de dræber målcellerne. Teknikker, der måler cytolytisk aktivitet direkte omfatter chrom-51 Release assay (CRA)18, Imaging-baserede assays, som måler apoptose af målceller ved hjælp af fluorescerende sonder19,20, og flow flowcytometri assays at detektere apoptotiske mål celler21. I disse assays, er bil T celler typisk Co-kultiveret med målceller, som er blevet præ-mærket med radioaktive eller fluorescerende sonder, efterfulgt af passende måling. Selv om det længe har været betragtet som guldstandarden på området på grund af sin følsomhed, CRA har nogle ulemper. For det første er det en endepunkts analyse og giver ikke kinetisk information. For det andet skal målcellerne mærkes med chrom-51, som har tendens til at udtrænge ud af cellerne og kan øge baggrundsstøjen22markant. Endelig kræver det passende forholdsregler og bortskaffelse af det radioaktive affald. Alternative assays, som måler biprodukter af bil T-celle interaktion med målceller som en indikation af potens, omfatter kvantitation af forskellige cytokiner frigivet af bil T-celler ved hjælp af enten flow cytometri-baserede metoder eller enzym-sammenkædede immunosorbent assays. Endnu en gang er der tale om endepunkts analyser, som måler den kumulative frigivelse af cytokinerne på et givet tidspunkt, og som således ikke nødvendigvis afspejler den faktiske cytolytiske aktivitet i bil-T-cellerne.
Ved udvikling af en styrke analyse, især en, der definerer frigivelse kriterier for en celle-baseret terapi såsom en bil T-celle, er det afgørende, at analysen involverer minimal manipulationer og hands-on tid, fordi hver interaktion er en anden variabel, der skal regnskabsmæssigt og kan mindske den samlede robusthed og konsistens af analysen. Desuden er samspillet mellem bil T-celler med tumorcellerne en dynamisk proces, og tilvejebringelse af oplysninger om disse dynamiske interaktioner, såsom hastigheden af cytolyse, er af største betydning for styrke evaluering. Med disse kriterier i tankerne, vi udviklet en label-fri kinetiske styrke assay for bil T-celler, der udnytter xcelligence real-time celle analyse (rtca) platform. xCELLigence udnytter specialiserede mikrotiterplader (E-plader), der indeholder guld biosensorer indlejret i bunden af hver brønd. Arbejde med enten klæber solide tumorceller, eller flydende kræftceller, der er blevet tøjret ved hjælp af specifikke antistoffer, disse biosensorer overvåge i realtid bil T celle-induceret ændringer i Target celle nummer, Cellestørrelse, celle-substrat vedhæftningsstyrke, og celle-celle interaktioner (dvs. barriere funktion)17,23,24,25,26,27,28. Arbejdsprocessen er enkel og involverer blot såning målcellerne i brøndene af E-plader, efterfulgt af tilsætning af bilen T celler ved forskellige Effector-til-mål nøgletal (figur 1). Efterfølgende, da Biosensorerne løbende overvåger levedygtigheden af målcellerne, vises dataene automatisk i realtid.
I løbet af de sidste 15 år xcelligence assay er blevet valideret til vurdering af styrken af naturlige Killer (NK) celler, t-celler, bil T-celler, check point-hæmmere, bispecifikke antistoffer, onkolytisk vira, og nogle Kombinationsbehandlinger17,29,30,31,32,33,34. For nylig blev xCELLigence-styrke analysen evalueret for fremstilling af T-celle receptor (TCR)-konstruerede T-celler35. Her rapporterer vi ansætte RTCA system til at evaluere in vitro-styrken af bil T-celler designet til at målrette faste tumorer og flydende tumorer i kliniske behandlinger.
Chimeric antigen receptorer er multi Domain proteiner bestående af en ekstracellulær enkelt-kæde variabel fragment (scfv region), en hængsel region, en transmembran region, og en cytoplasmisk domæne sammensat af TCR signalering domæner og yderligere costimulatory domæner fra receptorer såsom CD28 og OX4011,40. At designe sikre, selektive og effektive biler, er det bydende nødvendigt, at de forskellige permutationer i udformningen af bilerne er grundigt testet ved hjælp in vitro-potens assays og, i sidste ende, dyremodeller. I denne undersøgelse har vi givet en protokol og en arbejdsgang for, hvordan en real-time in vitro styrke analyse kan informere udformningen af effektive biler.
Ved udformningen af nogen form for styrke analyse, især til fremstillings formål, er det bydende nødvendigt, at analysen være følsom, robust, konsekvent, og så tæt på virkningsmekanismen som muligt16,17,41. Den realtids styrke analyse, der er beskrevet her, er designet til at måle den cytolytiske aktivitet i bilens T-celle direkte i stedet for at bruge en surrogatmarkør såsom cytokinfrigivelse. Det er vigtigt, at analysen ikke kræver yderligere komponenter såsom farvestoffer eller reagenser bortset fra analyse pladen (E-pladen) og de anbefalede medier til vedligeholdelse af cellerne. Derudover er analysen udsøgt følsom og giver meget reproducerbare data sammenlignet med andre etiketbaserede assays42,43,44. Desuden er xCELLigence-analysen modtagelig for at anvende meget lave effektor-til-mål-nøgletal, som er ideelle til vurdering af specifik cytolyse.
For at demonstrere fleksibiliteten og nytten af xCELLigence systemet, har vi fokuseret på to tumortyper, nemlig tumorer i Hæmatologisk oprindelse og solide tumorer. For at vurdere styrken af CD22-rettede bil T-celler, blev Raji-celler (dvs. en B-celle lymfom cellelinje) bundet til E-pladerne ved hjælp af et anti-CD40 antistof. Tethering af Raji celler til bunden af E-pladerne resulterer i et impedans signal, som afspejler levedygtigheden og antallet af Raji celler i brønden. Efter tilsætning af CD22-bil T-celler, er de Raji celler selektivt dræbt i en tid-og Effector-afhængige måde, kulminerende i en tidsafhængig fald i impedans signal. Faldet i impedans betyder cytolyse eller tab af levedygtighed af Raji celler17. Denne selektive tethering tilgang ved hjælp af antistoffer kan udvides til andre flydende tumorcellelinjer. En alternativ strategi til at bruge tumorcellelinjer af Hæmatologisk oprindelse er at bruge vedlige kræftceller, der er konstrueret til stabilt at udtrykke tumor antigener, såsom CD19 udtrykt i HeLa celler. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at forældrenes HeLa-celler er let tilgængelige og kan bruges som en negativ kontrol for specificitet. En sådan fremgangsmåde er allerede blevet valideret med CHO-CD22 vs. CHO cells og CHO-BCMAs vs. CHO cells29. Ved hjælp af sådanne forskellige tilgange, bil T-Cell design og effektivitet kan let testes. XCELLigence-analysen er i sagens natur fleksibel, og Analysebetingelserne kan justeres for at opnå maksimalt omtrentlige fysiologiske forhold.
En stor fordel ved styrken assay vi beskrev her er, at det er en simpel funktionel analyse og kan bruges i forbindelse med genteknologi teknikker til at designe optimale og effektive biler i en høj gennemløb mode. Som det blev vist her for bil T celler designet til at målrette EGFR-positive kræftceller, analysen kan bruges til at evaluere den relative aktivitet af forskellige BILKONSTRUKTIONER/mutanter. For eksempel viste vi, at når GITR-domænet er placeret opstrøms for CD3-domænet, viser det meget mere robust cytolytisk aktivitet, end når det er placeret neden for CD3 domænet.
Selv om det ikke korrelerer perfekt med in vivo bil T celle aktivitet, in vitro cytokinfrigivelse har historisk set været brugt som et mål for bil T celle potens. Selv om den xCELLigence-baserede styrke analyse, der er beskrevet her, kan anvendes til vurdering af cellebaserede terapier under fremstillingen, eller før den frigives til klinisk anvendelse, er det endnu ikke blevet påvist, hvor godt disse resultater korrelerer med in vivo-effekt Etableret. In vivo effekt afhænger af en række faktorer og variabler, som ikke kan gentages i en in vitro-analyse. Sådanne variabler omfatter: homing af bilen T celler til stedet for tumoren, stimulering og aktivering af bilen T celle og dens evne til at fortsætte inden for patienten, og tumor mikromiljø. Med yderligere raffinement xCELLigence assay kan være i stand til at modellere nogle af disse komplekse processer in vitro.
Protokollen forudsat her gælder for de fleste vedlige Cancer cellelinjer og nogle af de flydende tumorcellelinjer. Kliniske prøver såsom primære cancerceller, dog, skal testes yderligere og optimeres på grund af kompleksiteten af tumortyper og faser. Det er bestemt værd at bemærke, at in vitro-styrken analyse system, der er beskrevet her, bruger Cancer cellelinjer kun for at afspejle den potentielle aktivitet af bilen T-celler. Den virkelige tumor situation inde i den menneskelige krop er meget mere kompleks, især når en solid tumor er målrettet, på grund af den dynamiske tumor miljø og udvikling. Derfor kan styrken evaluering resultat ikke oversætte meget godt i den kliniske effekt af de testede bil T-celler.
Kort sagt, den præsenterede impedans-baserede xCELLigence platform tillader label-fri overvågning af celle drab i en længere periode, nemlig op til 10 dage. Denne kapacitet til en så lang tidsmæssig skala for dataindsamling differentierer teknologien fra andre analyser, der i øjeblikket er i brug, og som kræver opsætning af flere eksperimentelle replikater til tidspunkt indsamling og omstændelig prøve manipulation. Desuden forenkler det minimale signal bidrag fra Effector immuncellerne dataanalyse. Softwaren kan behandle data automatisk og generere nyttige parametre såsom procentdelen af cytolyse, KT50, etc. Teknologien har allerede vist høj følsomhed (med E:T ratio så lavt som 1:20) og et stort dynamisk område (med E:T nøgletal fra 20:1 til 1:20), som ikke let opnås med andre assays. Samlet set bør gennemførelsen af denne teknologi give mulighed for en mere præcis dataanalyse på en højere gennemløbs skala, der vil forbedre udviklingen af bil T-celle reagenser, fremme feltet i et meget højere tempo.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker ProMab Biotechnologies og ACEA Biosciences for at levere de reagenser og instrumenter, der udnyttes i denne undersøgelse.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |