Vi beskriver en kvantitativ Real-Time in vitro cytolyse analysen system for å evaluere styrken av chimeric antigen reseptor T-celler rettet mot flytende og solide tumorceller. Denne protokollen kan utvides til å vurdere andre immun Effektor celler, samt kombinasjonsbehandlinger.
Chimeric antigen reseptor (CAR) T-celle terapi for kreft har oppnådd betydelig klinisk nytte for resistente og ildfast hematologiske ondartet som barndommen akutt lymfatisk leukemi. Arbeidet er for tiden i gang for å forlenge denne lovende terapi til solide svulster i tillegg til andre hematologiske kreft. Her beskriver vi utvikling og produksjon av potente CAR T-celler målretting antigener med unike eller fortrinnsrett uttrykk på faste og flytende tumorceller. In vitro-styrken til disse CAR T-cellene evalueres deretter i sanntid ved hjelp av den svært følsomme impedans-baserte xCELLigence-analysen. Nærmere bestemt er virkningen av ulike costimulatory signalering domener, slik som glukokortikoid-indusert tumor nekrose faktor reseptor (TNFR)-relatert protein (GITR), på in vitro potens av CAR T-celler undersøkt. Denne rapporten inneholder protokoller for: generere CAR T-celler for prekliniske studier ved hjelp av lentiviral gen Transduction, utvide CAR T-celler, validere CAR uttrykk, og kjører og analysere xCELLigence styrke analyser.
I de senere årene, bil T-celle terapi har vært en av de mest fremtredende gjennombrudd i kreft immunterapi for tilbakefall og ildfast blodkreft ondartet. Med den nylige US Food and Drug Administration (FDA) godkjennelse av CD19-regissert bil T celler for akutt lymfatisk leukemi, ikke-Hodgkins lymfom, og diffus stor B-celle lymfom, og betegnelsen på gjennombrudd terapi for b-celle modning antigen (BCMA)-regissert bil T celler for flere myelom, denne teknologien har generert stor spenning i det vitenskapelige samfunnet og har fueled mange grunnleggende, anvendt, og kliniske studier over hele verden1,2,3, 4,5. I januar 2019 ble det registrert mer enn 700 kliniske studier i den kliniske testdatabasen (clinicaltrials.gov). om 450 av disse studiene var enten i ferd med å starte eller var aktivt rekruttere pasienter. De fleste av de kliniske studiene er fokusert på hematologiske ondartet, og kliniske studier utnytte bil T celler rettet mot CD20, CD22, og BCMAs, i tillegg til CD19, er pågående også6,7. Mens de fleste av forsøkene bruker autologous bil T-Cell Therapy, et betydelig antall av dem er også å utforske nytten av allogenic bil T celler8,9,10. Til tross for lovende resultater med hematologiske ondartet, bruk av bil T celler til målet solide svulster har vist seg å være mye vanskeligere i klinikken for en rekke årsaker, inkludert men ikke begrenset til mangelen på gode mål som er utelukkende uttrykt i svulsten, heterogenitet av solide svulster og tumor “Escape”, og vanskeligheten at bilen T celler har tilgang til tumor mikromiljøet11,12,13,14, 15. det er et kritisk behov for utvikling av solide tumor-spesifikke Car T-celler som kan overvinne disse barrierene for effekt og problemet med “på målet-off tumor” toksisitet. Mens en rekke in vitro og in vivo tilnærminger er berettiget i design og testing av bil T celler, en robust og prediktiv in vitro potens analysen er av primær betydning16,17.
For å vurdere styrken på CAR T-cellene har ulike in vitro-metoder blitt utviklet. Generelt, disse styrke analysene kan deles inn i to hovedkategorier avhengig av om de (i) direkte måle cytolytisk aktivitet av Car t-celler mot målet tumorceller, eller (II) måle surrogat markører som cytokiner som er utgitt av Car t-cellene som de dreper målcellene. Teknikker som måler cytolytisk aktivitet direkte inkludere Chromium-51 Release analysen (CRA)18, Imaging-baserte analyser som måler apoptose av målceller ved hjelp av fluorescerende sonder19,20, og flyt flowcytometri analyser som oppdager apoptotisk Target celler21. I disse analysene, CAR T-celler er vanligvis co-kultivert med målceller som har vært pre-merket med radioaktive eller fluorescerende sonder, etterfulgt av passende måling. Selv om det har lenge vært betraktet gullstandarden i feltet på grunn av sin følsomhet, har CRA noen ulemper. Først er det et endepunkt analysen og gir ikke kinetisk informasjon. For det andre må målcellene merkes med krom-51 som har en tendens til å lekke ut av cellene og kan signifikant øke bakgrunnsstøyen22. Til slutt, det krever riktig forholdsregler og deponering av radioaktivt avfall. Alternative analyser, som måler biprodukter av bil T-celle interaksjon med målceller som en indikasjon på potens, inkluderer kvantifisering av ulike cytokiner utgitt av CAR T-celler ved hjelp av enten flyte flowcytometri metoder eller enzym-koblet immunosorbentanalyse analyser. Nok en gang er disse ende punkts analysene som måler den kumulative utgivelsen av cytokiner på et gitt tidspunkt, og dermed ikke nødvendigvis gjenspeiler den faktiske cytolytisk aktiviteten til CAR T-cellene.
Når du utvikler en potens analysen, spesielt en som definerer utgivelsen kriteriene for en celle-basert terapi som en bil T-celle, er det avgjørende at analysen innebære minimale manipulasjoner og hands-on tid fordi hver interaksjon er en annen variabel som må regnskapsføres og kan redusere den generelle robusthet og konsistens av analysen. Videre samspillet av CAR T-celler med tumorceller er en dynamisk prosess, og gi informasjon om disse dynamiske interaksjoner, for eksempel frekvensen av cytolyse, er av primær betydning for potens evaluering. Med disse kriteriene i tankene, utviklet vi en etikett-fri kinetisk styrke analysen for CAR T-celler som utnytter xCELLigence sanntids celle analyse (RTCA) plattform. xCELLigence benytter spesialiserte mikrotiterbrønnene plater (E-plater) som inneholder gull biosensors innebygd i bunnen av hver brønn. Arbeide med enten tilhenger solide tumorceller, eller flytende kreftceller som er bundet ved hjelp av spesifikke antistoffer, disse biosensors overvåke i sanntid bil T celle-indusert endringer i målet celle nummer, Cellestørrelse, celle-substrat vedlegg styrke, og celle-celle interaksjoner (dvs. barrierefunksjon)17,23,24,25,26,27,28. Arbeidsflyten er enkel og innebærer bare seeding målet cellene i brønnene av E-plater, etterfulgt av tillegg av CAR T-celler på ulike effektor-til-Target prosenter (figur 1). Deretter, når biosensors kontinuerlig overvåker levedyktigheten til målcellene, vises dataene automatisk i sanntid.
I løpet av de siste 15 årene xCELLigence analysen har blitt validert for å vurdere styrken på Natural Killer (NK) celler, T celler, bil T celler, Checkpoint hemmere, bispecific antistoffer, oncolytic virus, og noen Kombinasjonsbehandling17,29,30,31,32,33,34. Nylig ble xCELLigence styrke analysen evaluert for produksjon T-celle reseptor (TCR)-konstruerte T-celler35. Her rapporterer vi ansette RTCA system for å evaluere in vitro potens av CAR T-celler designet for å målrette solide svulster og flytende svulster i kliniske terapier.
Chimeric antigen reseptorer er replikasjonen proteiner bestående av en ekstracellulære enkelt kjede variabel fragment (scFv region), en hengsel region, en transmembrane region, og et cytoplasmatiske domene sammensatt av TCR signalering domener og ytterligere costimulatory domener fra reseptorer som CD28 og OX4011,40. Å designe trygge, selektive og effektiv biler, er det viktig at de ulike variasjoner i utformingen av bilene er grundig testet med in vitro potens analyser og, til slutt, dyremodeller. I denne studien har vi gitt en protokoll og en arbeidsflyt for hvordan en Real-Time in vitro potens analysen kan informere utformingen av effektiv CARs.
I utformingen av alle typer styrke analysen, spesielt for produksjon formål, er det viktig at analysen være følsom, robust, konsistent, og så nær virkningsmekanismen som mulig16,17,41. Det virkelig-tid styrke analysen beskrevet her over er beregnet på mål det cytolytisk aktivitet av bilen T cellen direkte snarere enn benytter en surrogat Farm land som cytokin løslate. Viktigere, ikke analysen ikke krever noen ekstra komponenter som fargestoffer eller reagenser enn analysen plate (E-plate) og de anbefalte mediene for å opprettholde cellene. I tillegg er analysen utsøkt følsom og gir svært reproduserbar data sammenlignet med andre Label-baserte analyser42,43,44. Videre er xCELLigence-analysen mottagelig for å bruke svært lave effektor-to-Target prosenter som er ideelt for vurdering av spesifikke cytolyse.
For å demonstrere fleksibiliteten og nytten av xCELLigence systemet, har vi fokusert på to tumor typer, nemlig svulster av hematologiske opprinnelse og solide svulster. For å vurdere styrken på CD22-regissert CAR T-celler, ble Raji celler (dvs. en B-celle lymfom cellelinje) bundet til E-platene ved hjelp av et anti-CD40 antistoff. Den tethering av Raji celler til bunnen av E-plater resulterer i en impedans signal som reflekterer levedyktigheten og antall Raji celler i brønnen. Etter tilsetning av CD22-bil T-celler, Raji cellene er selektivt drept i en tid-og effektor-avhengig måte, som kulminerte i en tidsavhengig reduksjon i impedans signalet. Fall i impedans betyr cytolyse eller tap av levedyktighet av Raji cellene17. Denne selektive tethering tilnærming ved hjelp av antistoffer kan utvides til andre flytende tumor cellelinjer. En alternativ strategi for å bruke tumor cellelinjer av hematologiske opprinnelse er å bruke tilhenger kreftceller som er konstruert for å stabilt uttrykke tumor antigener, slik som CD19 uttrykt i HeLa celler. Fordelen med denne tilnærmingen er at foreldre jakten cellene er lett tilgjengelig og kan brukes som en negativ kontroll for spesifisitet. En slik tilnærming har allerede blitt validert med CHO-CD22 vs. CHO celler og CHO-BCMAs vs CHO celler29. Ved hjelp av slike ulike tilnærminger, bil T-celle design og effekt kan lett testes. Den xCELLigence analysen er iboende fleksibel, og analysen forhold kan justeres for å maksimalt omtrentlige fysiologiske forhold.
En stor fordel av styrken analysen vi beskrev her er at det er en enkel funksjonell analysen og kan brukes i forbindelse med genetisk engineering teknikker for å designe optimale og effektiv biler i en høy-gjennomstrømning mote. Som ble vist her for CAR T-celler designet for å målrette EGFR-positive kreftceller, kan analysen brukes til å evaluere den relative aktiviteten til forskjellige bil konstruksjoner/mutanter. For eksempel viste vi at når GITR domenet ligger oppstrøms av CD3 domenet det viser mye mer robust cytolytisk aktivitet enn når det ligger nedstrøms av CD3 domenet.
Selv om det ikke samsvarer perfekt med in vivo CAR T celle aktivitet, in vitro cytokin Release har historisk vært brukt som et mål på CAR T celle potens. Selv om den xCELLigence-baserte styrke analysen som beskrives her, kan brukes til å evaluere cellebasert behandling under produksjon eller før den blir frigitt for klinisk anvendelse, hvor godt disse resultatene samsvarer med in vivo-effekten har ennå ikke blitt Etablert. In vivo-effekt avhenger av en rekke faktorer og variabler som kanskje ikke er sammenfattet innenfor en in vitro-analyse. Slike variabler inkluderer: homing av CAR T-celler til området av svulsten, stimulering og aktivering av CAR T-cellen og dens evne til å vedvare i pasienten, og svulsten mikromiljøet. Med ytterligere raffinement den xCELLigence analysen kan være i stand til å modellere noen av disse komplekse prosesser in vitro.
Protokollen gitt her gjelder for de fleste tilhenger kreftcelle linjer og noen av de flytende tumor cellelinjer. Kliniske prøver som primær kreftceller, men må være ytterligere testet og optimalisert på grunn av kompleksiteten i tumor typer og faser. Det er absolutt verdt å merke seg at in vitro styrke analysen systemet beskrevet her bruker kreftcelle linjer bare for å gjenspeile den potensielle aktiviteten til CAR T-cellene. Den virkelige tumor situasjonen inne i menneskekroppen er mye mer komplisert, spesielt når en solid svulst er målrettet, på grunn av dynamisk tumor miljø og utvikling. Derfor kan styrke evaluerings resultatet ikke oversette veldig godt inn i den kliniske effekten av CAR T-cellene testet.
Oppsummert, den presenterte impedans-baserte xCELLigence plattformen tillater etikett-fri overvåking av celle drap for en lengre periode, nemlig opp til 10 dager. Denne kapasiteten for en så lang Temporal skala for datainnsamling skiller teknologien fra andre analyser som er i bruk, og som krever å sette opp flere eksperimentelle replikerer for time Point samling og møysommelig sample manipulasjon. Videre forenkler det minimale signal bidraget fra de effektor immun cellene dataanalyse. Programvaren kan behandle data automatisk og generere nyttige parametre som prosentandelen av cytolyse, KT50, etc. Teknologien har allerede vist høy følsomhet (med E:T-forhold så lavt som 1:20) og et stort dynamisk område (med E:T-forhold fra 20:1 til 1:20), som ikke er lett å oppnå med andre analyser. Samlet sett bør gjennomføringen av denne teknologien gi en mer nøyaktig dataanalyse på en høyere gjennomstrømming skala som vil forbedre utviklingen av bil T-celle reagenser, fremme feltet på et mye høyere tempo.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker ProMab bioteknologi og ACEA biovitenskap for å gi reagenser og instrumenter benyttet i denne studien.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |