Vi beskriver en kvantitativ realtid in vitro cytolys assay system för att utvärdera styrkan av chimär antigen receptor T celler inriktning flytande och fasta tumörceller. Detta protokoll kan utökas för att bedöma andra immuneffektorceller, samt kombinationsbehandlingar.
Chimeric antigen receptor (bil) T-cellterapi för cancer har uppnått betydande klinisk nytta för resistenta och refraktära hematologiska maligniteter såsom barndom akut lymfatisk leukemi. Ansträngningar för närvarande pågår för att förlänga denna lovande behandling till solida tumörer utöver andra hematologiska cancerformer. Här beskriver vi utveckling och produktion av potenta bil T-celler riktade mot antigener med unika eller förmånliga uttryck på solida och flytande tumörceller. In vitro-potensen av dessa bil-T-celler utvärderas sedan i realtid med hjälp av den mycket känsliga impedansbaserade Xcelta-analysen. Specifikt, effekten av olika Co-signalering domäner, såsom glukokortikoid-inducerad tumörnekrosfaktor receptor (tnfr)-relaterat protein (gitr), på in vitro-potensen av bil T-celler undersöks. Denna rapport innehåller protokoll för: generering av bil T-celler för prekliniska studier med hjälp av lentiviral gentransduktion, expanderande bil T-celler, validering av bil uttryck och löpning och analys av potensanalyser av Xcelys.
Under de senaste åren, bil T-cellterapi har varit en av de mest framträdande genombrott inom cancer immunoterapi för recidiverade och refraktära hematopoietiska maligniteter. Med den senaste amerikanska Food and Drug Administration (FDA) godkännande av CD19-riktade bil T-celler för akut lymfatisk leukemi, non-Hodgkins lymfom, och diffus stora b-cellslymfom, och utnämningen av genombrotts terapi för B-cell mognad antigen (bcma)-riktad bil T celler för multipela myelom, denna teknik har genererat stor spänning i det vetenskapliga samfundet och har drivs många grundläggande, tillämpad, och kliniska studier över hela världen1,2,3, 4,5. I januari 2019 registrerades mer än 700 kliniska prövningar i databasen för klinisk prövning (clinicaltrials.gov). omkring 450 av dessa prövningar var antingen på väg att starta eller var aktivt rekrytera patienter. De flesta av de kliniska prövningarna är inriktade på hematologiska maligniteter, och kliniska prövningar med hjälp av bilar T-celler inriktning CD20, CD22, och bcmas, förutom CD19, pågår också6,7. Medan de flesta av försöken använder autolog bil t-cellterapi, ett betydande antal av dem är också att utforska nyttan av allogena bil T-celler8,9,10. Trots lovande resultat med hematologiska maligniteter, användning av bil T-celler för att rikta solida tumörer har visat sig vara mycket svårare i kliniken av olika skäl, inklusive men inte begränsat till bristen på bra mål som uteslutande uttrycks i tumören, heterogenitet solida tumörer och tumör “flykt”, och svårigheten att bil T-celler har att få tillgång till tumören mikromiljö11,12,13,14, 15. det finns ett kritiskt behov av utveckling av fasta TUMÖRSPECIFIKA bil T-celler som kan övervinna dessa hinder för effekt och problemet med “på mål-off tumör” toxicitet. Medan en mängd in vitro-och in vivo-metoder är motiverade vid utformningen och provningen av bil T-celler, är en robust och prediktiv in vitro-potensanalys av primär betydelse16,17.
För att bedöma styrkan hos bil T-celler har olika in vitro-metoder utvecklats. I allmänhet, dessa potens analyser kan delas in i två breda kategorier beroende på om de (i) direkt mäta cytolytisk aktiviteten av bil T-celler mot mål tumörceller, eller (II) mäta surrogatmarkörer såsom cytokiner som släpps av bilen t-celler som de dödar målcellerna. Tekniker som mäter cytolytisk aktivitet direkt inkluderar krom-51 release assay (CRA)18, Imaging-baserade analyser som mäter apoptos av målceller med hjälp av fluorescerande sonder19,20, och flödescytometri analyser som detekterar apoptotiska målceller21. I dessa analyser är bil T-celler vanligtvis samodlade med målceller som har förmärkts med radioaktiva eller fluorescerande sonder, följt av lämplig mätning. Även om det har länge ansetts guldmynt standard i fältet på grund av dess känslighet, CRA har vissanackdelar. Först är det en Endpoint-analys och ger inte kinetisk information. För det andra måste målcellerna märkas med krom-51 som tenderar att läcka ut ur cellerna och kan avsevärt öka bakgrundsbrus22. Slutligen krävs lämpliga försiktighetsåtgärder och bortskaffande av radioaktivt avfall. Alternativa analyser, som mäter biprodukter av bil T-cells interaktion med målceller som en indikation på potens, inkluderar kvantifiering av olika cytokiner som släppts av bil T-celler med antingen flödescytometribaserade metoder eller enzymlänkade immunsorbent-analyser. Än en gång, dessa är Endpoint analyser som mäter den kumulativa frisättning av cytokiner vid en given tidpunkt och, således, inte nödvändigtvis återspeglar den faktiska cytolytisk aktivitet av bilen T-celler.
När du utvecklar en potens analys, särskilt en som definierar release kriterier för en cell-baserad behandling såsom en bil T-cell, är det viktigt att analysen innebär minimala Manipulationer och hands-on tid eftersom varje interaktion är en annan variabel som måste redovisas och kan minska den övergripande robusthet och konsekvens av analysen. Vidare, samspelet mellan bil T-celler med tumörcellerna är en dynamisk process, och ge information om dessa dynamiska interaktioner, såsom graden av cytolys, är av primär betydelse för potens utvärdering. Med dessa kriterier i åtanke har vi utvecklat en etikettfri kinetisk potens-analys för bil T-celler som utnyttjar Xceltiers realtids cell analys (RTCA)-plattform. Xcelintelligens använder specialiserade mikrotiterplattor (E-plattor) som innehåller guld biosensorer inbäddade i botten av varje brunn. Arbeta med antingen anhängare fasta tumörceller, eller flytande cancerceller som har tjudrad med hjälp av specifika antikroppar, dessa biosensorer övervaka i realtid bil T cell-inducerad förändringar i målet cellantal, Cellstorlek, cell-substrat fastsättning styrka, och cell-cell interaktioner (dvs. barriärfunktion)17,23,24,25,26,27,28. Arbetsflödet är enkelt och innebär helt enkelt sådd målceller i brunnarna av E-plattor, följt av tillsats av bil T-celler vid olika effektor till mål förhållanden (figur 1). Därefter, eftersom bio sensorerna kontinuerligt övervakar mål cellernas livskraft, visas data automatiskt i realtid.
Under de senaste 15 åren har xcelys-analysen validerats för att bedöma styrkan hos naturliga mördarceller, t-celler, bil-t-celler, Checkpoint-hämmare, bispecifika antikroppar, onkolytiska virus och vissa kombinationsterapier17,29,30,31,32,33,34. Nyligen, den Xcelssed potens analysen utvärderades för tillverkning T-cell receptor (TCR)-konstruerade T-celler35. Här rapporterar vi anställa RTCA-systemet för att utvärdera in vitro-potensen av bil T-celler utformade för att rikta solida tumörer och flytande tumörer i kliniska terapier.
Chimeric antigen receptorer är multidomänproteiner som består av en extracellulär enda kedja variabel fragment (scFv region), ett gångjärn region, en Transmembran region, och en cytoplasmiska domän består av TCR signalering domäner och ytterligare Co-domäner från receptorer såsom CD28 och OX4011,40. För att designa säkra, selektiva och effektiva bilar, är det viktigt att de olika permutationer i utformningen av bilarna är grundligt testade med in vitro potens analyser och, så småningom, djurmodeller. I denna studie, vi har tillhandahållit ett protokoll och ett arbetsflöde för hur en realtid in vitro potens analys kan informera utformningen av effektiva bilar.
Vid utformningen av någon typ av styrka assay, särskilt för tillverknings ändamål, är det viktigt att analysen vara känslig, robust, konsekvent, och så nära verkningsmekanismen som möjligt16,17,41. I realtid potens analysen beskrivs här är utformad för att mäta cytolytisk aktivitet av bilen T-cellen direkt snarare än att använda en surrogatmarkör som cytokin release. Viktigt är att analysen inte kräver några ytterligare komponenter såsom färgämnen eller reagenser än analys plattan (E-Plate) och de rekommenderade medierna för att bibehålla cellerna. Dessutom är analysen utsökt känslig och ger mycket reproducerbara data jämfört med andra etikettbaserade analyser42,43,44. Dessutom är Xcelys-analysen mottaglig för användning av mycket låga effekt-till-mål-förhållanden som är idealisk för bedömning av specifika cytolysis.
För att demonstrera flexibiliteten och nyttan av Xcellighet-systemet har vi fokuserat på två tumörtyper, nämligen tumörer av hematologiskt ursprung och solida tumörer. För att bedöma styrkan hos CD22-riktade bil T-celler, Raji celler (dvs. en B-cells lymfom cell linje) var bundna till E-plattor med en anti-CD40 antikropp. Den tjudra av Raji celler till botten av E-plattorna resulterar i en impedans signal som återspeglar livskraften och antalet Raji celler i brunnen. Efter tillsats av CD22-CAR T-celler, de Raji cellerna är selektivt dödas i en tid-och Effector-beroende sätt, som kulminerar i en tidsberoende minskning av impedansen signalen. Nedgång i impedansen innebär cytolys eller förlust av livskraft av Raji celler17. Denna selektiva tjudra tillvägagångssätt med hjälp av antikroppar kan utvidgas till andra flytande tumör cellinjer. En alternativ strategi för att använda tumör cellinjer av hematologiskt ursprung är att använda anhängare cancerceller som är konstruerade för att stabilt uttrycka tumören antigener, såsom CD19 uttrycks i HeLa celler. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att föräldrarnas HeLa celler är lätt tillgängliga och kan användas som en negativ kontroll för specificitet. Ett sådant tillvägagångssätt har redan validerats med CHO-CD22 vs. CHO celler och CHO-BCMAs vs. CHO celler29. Med hjälp av sådana olika metoder, bil T-cell design och effekt kan lätt testas. Den Xcelbalt analysen är till sin natur flexibel, och assay villkor kan justeras för att maximalt approximera fysiologiska förhållanden.
En stor fördel med styrkan analysen vi beskrev här är att det är en enkel funktionell analys och kan användas tillsammans med genteknik tekniker för att utforma optimala och effektiva bilar i en hög genomströmning mode. Som visades här för bil T-celler avsedda att rikta EGFR-positiva cancerceller, kan analysen användas för att utvärdera den relativa aktiviteten hos olika bil konstruktioner/mutanter. Till exempel, vi visade att när gitr domänen ligger uppströms CD3 domänen det visar mycket mer robust cytolytisk aktivitet än när det ligger nedströms av CD3 domänen.
Även om det inte korrelerar perfekt med in vivo bil T cell aktivitet, in vitro cytokin release har historiskt använts som ett mått på bil T cell potens. Även om den Xcelta-baserade potens-analysen som beskrivs här kan användas för att utvärdera cellbaserade terapier under tillverkningen eller innan den släpps för klinisk användning, hur väl dessa resultat korrelerar med in vivo-effekten har ännu inte Etablerade. In vivo effekt beror på en mängd faktorer och variabler som inte får rekapitueras inom en in vitro-analys. Sådana variabler inkluderar: homing av bilen T-celler till platsen för tumören, stimulering och aktivering av bilen T-cellen och dess förmåga att bestå inom patienten, och tumören mikromiljö. Med ytterligare förfining kan Xcelintelligens-analysen vara kapabel att modellera några av dessa komplexa processer in vitro.
Det protokoll som här gäller för de flesta anhängare cancer cellinjer och några av de flytande tumör cellinjer. Kliniska prover såsom primära cancerceller, emellertid, måste testas ytterligare och optimeras på grund av komplexiteten i tumörtyper och faser. Det är verkligen värt att notera att in vitro potens assay system som beskrivs här använder cancer cellinjer endast för att återspegla den potentiella aktiviteten av bil T-celler. Den verkliga tumör situationen inuti den mänskliga kroppen är mycket mer komplex, särskilt när en solid tumör är riktad, på grund av den dynamiska tumör miljö och utveckling. Därför kan potens utvärderingsresultat inte översätta mycket väl till den kliniska effekten av de testade bil T-cellerna.
Sammanfattnings, den presenterade impedansen-baserade Xcelssé plattform möjliggör etikettfri övervakning av cell avlivning under en längre tid, nämligen upp till 10 dagar. Denna kapacitet för en så lång tidsmässig skala för datainsamling skiljer tekniken från andra analyser som används för närvarande och som kräver att du ställer in flera experimentella replikat för tidspunkt insamling och mödosam prov manipulation. Dessutom förenklar det minimala signal bidraget från effektorens immunceller dataanalys. Programvaran kan bearbeta data automatiskt och generera användbara parametrar såsom andelen cytolys, KT50, etc. Tekniken har redan visat hög känslighet (med E:T-förhållanden så lågt som 1:20) och ett stort dynamiskt omfång (med E:T-förhållanden från 20:1 till 1:20), vilket inte är lätt att uppnå med andra analyser. Sammantaget bör genomförandet av denna teknik möjliggöra en mer exakt dataanalys på en högre genomströmning skala som kommer att förbättra utvecklingen av bil T-cell reagenser, främja området i en mycket högre takt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar ProMab bio Technologies och ACEA Biosciences för att de tillhandahåller de reagenser och instrument som används i denna studie.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |