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Neuroscience

一种用于监测 ampa 受体贩运的高含量检测方法

doi: 10.3791/59048 Published: January 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

神经兴奋性可以通过兴奋性电离谷氨酸受体的内和外渗的动态过程来调节。这里描述的是一个可访问的, 高含量的检测定量表面和内部受体群体池。

Abstract

突触后贩运受体进出细胞表面是神经元调节其对不同刺激的反应的重要机制。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 (ampa) 受体负责神经元中快速兴奋突触传递, 被贩运到突触后表面, 并从突触后表面动态改变神经元的兴奋性。ampa 受体贩运是突触可塑性所必需的, 可在神经疾病中中断。然而, 对受体贩运进行量化的流行方法忽略了整个受体池, 过于耗时和劳动密集型, 或有可能破坏正常的贩运机制, 从而使对由此产生的数据的解释复杂化。我们提出了一个高含量的检测定量表面和内部 ampa 受体群培养的原代海马神经元使用双荧光免疫标记和近红外荧光96井微板扫描仪。这种方法有助于快速筛选批量内化和表面受体密度, 同时最大限度地减少样品材料。然而, 我们的方法在获得单细胞分辨率或进行活细胞成像方面存在局限性。最后, 该协议可能适合其他受体和不同的细胞类型, 提供适当的调整和优化。

Introduction

神经元兴奋性的大小和时间动力学在很大程度上取决于传递电化学信号的表面受体群的可用性和组成。虽然新的受体 (或受体亚基) 的合成通常是一个能量成本高、相对漫长的过程, 但大量专门用于现有受体内和分泌的细胞机制为它们的快速插入提供了一种手段和去除到和从膜1.因此, 除了转录和转化调节受体, 翻译后受体贩运是神经元兴奋性的一个重要调节剂。

突触可塑性, 或有经验的神经元之间连接的变化强度, 被认为构成学习和记忆2,3的基础。突触的增强和减弱, 分别称为长期增强 (ltp) 和长期抑郁 (ltd), 可以通过贩运α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 (ampa) 受体来调节4 个,5. ampa 受体是由四个亚基 (glua1-4) 组成的异质体, 并在大脑中介导大部分快速兴奋突触传递 6.因此, 神经元的兴奋性在很大程度上是突触后表面 ampa 受体数量的函数, 可由谷氨酸激活。ltd 通常与 ampa 受体内吞的增加有关, 而 ltp 主要与 ampa 受体外分泌的增加有关。ampa 受体的突触后表面表达要求腔内传递到外细胞蛋白, 然后与质膜融合以钙依赖的方式7,8,9,10,11,12,13,14. 还有许多机制可以调节活动依赖性 ampa 受体内吞。这方面的一个例子是通过立即早期基因 arce/ag3.1 (arc)。在其他功能15中, 弧通过其结合伙伴促进 ampa 受体内吞, 包括内皮细胞蛋白 ap-2、内皮素-3 和动力-2, 从而介导交代谷氨酸受体 (mglur) 依赖 ltd。16,17,18,1 9日, 在克拉林涂层坑 2 0、2 1.内化 ampa 受体可以回收回质膜, 也可以指定用于降解22,23

重要的是, ampa 受体的亚基组成有助于其贩运动态24。主要的相关性是细胞内 c 端域的亚基, 其中大多数的翻译后修改和贩运相关的蛋白质相互作用发生。glua1 和 glua4 含有亚单元的 ampa 受体在 ltp 期间特别容易被贩运到细胞表面, 部分原因是它们的 pdz 配体存在, ~ 90个氨基酸序列通过与各种 pdz 的相互作用促进膜锚固含域蛋白25,26。另一方面, 含有谷胱甘肽2且缺乏 glua1 或 GluA2 的 ampa 受体往往被共同贩运, 但在细胞内积累, 具有突触活性27。glua2 亚基进行 rna 编辑, 除了促进内质网28中的保留外, 还使通道孔对29 不渗透, 进一步将亚单位特异性贩运作为神经元的关键中介体稳态和可塑性。有趣的是, 泛素依赖性电弧降解的破坏已被证明会增加 glua1 内吞, 并增加 GluA1 含有亚元 ampa 受体的表面表达, 在诱导 mglur-ltd 与选择性组 i mglur 激动剂后(s)-3, 5-二羟基苯基甘氨酸 (dhpg), 表明关于亚单元特异性 ampa 受体贩运的机制和作用还有很多东西需要学习.

观察受体表面表达变化的方法通常是繁琐的, 耗时的, 或带来不必要的混淆。基于生物素的检测是一种普遍的、市售的检测方法。生物素化表面受体的亲和力纯化就是这样一个例子, 然而, 进行电泳的必要性需要大量的样品材料, 并可能使多种治疗的筛选时间过长得令人望而却步过程31。延长这种检测方法, 其中多个时间点的标记和免疫沉淀进行, 以量化一个初始信号的逐渐退化, 类似地忽略了添加新的-或回收-受体到细胞表面, 只会加剧时间和材料要求。

其他方法利用嵌合结构或添加荧光标记来观察受体贩运 32, 有时使用活细胞成像33,34。虽然这些设计具有潜在的强大功能, 但由于这些蛋白质中引入的突变或分子量的剧烈变化, 这些设计会影响受体的正常贩运模式。使用标记亚细胞隔间的染料,低 ph 值34,35 为标签, 是非特异性的, 并使区分不同的细胞内隔间对受体贩运很重要 (例如溶酶体)和蛋白酶体) 困难。最后, 利用共聚焦显微镜来可视化受体与贩运和降解相关标记的共化, 如外染色体蛋白或氯转素, 同时有可能提供有用的洞察特定定位与亚细胞分辨率, 是时间, 劳动密集型, 和昂贵的, 由于需要单独分析每个细胞和共聚焦或超分辨率显微镜的要求。

在这里, 我们演示了一种与原代神经元培养制剂30兼容的高含量受体贩运检测方法.该方法分别标记固定神经元的表面和细胞内受体池, 从而实现数据与该受体的归一化表面或内化受体密度的比率。这种方法的高含量性质是在短时间内筛选多种治疗和/或基因型的理想选择, 只需要标准的细胞培养和抗体培养专业知识。

简单地说, 原生神经元生长在标准的96孔微板中, 然后按照实验设计进行处理, 用原生抗体孵育, 清洗和固定。然后用二级抗体培养细胞来标记表面受体, 然后再进行另一个固定步骤。然后发生渗透, 并使用第二二级抗体标记内部受体池。最后, 使用红外荧光微板扫描仪对细胞进行成像, 以量化每个受体群体的综合密度。图 1总结了我们的高含量检测, 与传统的生物素化分析进行了比较。

虽然这里提供的协议是优化和特定的 ampa 受体贩运在初级海马神经元培养, 这一程序可以在理论上扩展和适应不同的受体在各种细胞类型。

Protocol

这里描述的所有方法都得到了佐治亚州立大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 原发性海马神经元的制备 (层流罩)

  1. 从出生后混合性日 (p) 0-1 小鼠中分离原发性海马神经元, 如前所述 36
  2. 96孔多 d-赖氨酸中的板神经元在密度为 2 x 10 4 的微板上, 每口井 2x 10 4个细胞。
  3. 通过添加 50x b-27 的10毫升, 准备为神经元提供培养基, 5 毫升为100x 谷氨酰胺, 242μl 为 10 mgml 5-氟-2 '-脱氧尿嘧啶 (fudr), 10μl 为 10 mg/ml gentamycin 至 485 ml 的神经介质 (见材料表)。
  4. 通过从每口井中去除一半 (100μl) 的预先存在的介质 (称为条件介质, 其中包含支持神经元存活的成分) 来喂养36的源神经元, 并以100μl 的37°c 预热加热介质取代在步骤1.3 中每3-4天准备一次。将每个进料的有条件介质存放在4°C 步骤2.3。

2. 测量 ampa 受体贩运对 dhpg 的反应 (在层流罩)

  1. 在体外 (div) 14 日, 使用细胞培养级水, 在浓度为 2 mm 的情况下制备500μl 的四地毒素 (ttx) 库存溶液。
    注意事项:ttx 是一种神经毒素。小心处理, 避免与皮肤接触。
  2. 使用多通道移液器, 从96孔神经元微板的每口井中取出 100μl, 并将介质集中。
  3. 在步骤2.2 中的池化条件介质的1毫升中添加2μl 的 ttx 库存解决方案, 以创建 ttx 的4μm 解决方案。如果没有足够的池化有条件的媒体, 则使用步骤1.4 中的一些存储的有条件媒体。
  4. 从步骤2.3 开始, 用 ttx 的4μm 溶液对100μl/井处理神经元。将微板置于37°c 的 5% co2 孵化器中 4小时.
  5. 将无菌玻璃巴斯德移液器连接到吸线上, 并将无菌200μl 移液器端连接到移液器的尖端。小心地从每口井中取出介质。避免接触神经元所在的微板底部。
  6. 在每口井中加入200μl 的室温神经元介质。
  7. 在室温将微板孵化 15分钟, 最好在 5% co2 中孵化, 但不是必要的。

3. 免疫标记 (在层流罩中)

  1. 准备 1: 150 稀释神经元介质中的抗葡萄糖 a1 或抗谷蛋白 a2 抗体。
  2. 删除步骤2.6 中添加的神经元介质。在室温下, 将抗谷蛋白 a1 或抗谷蛋白 a 抗体溶液添加50μl 到相应的井中 20分钟, 以允许抗体结合。在二级抗体中加入50μl 的神经介质, 仅用于控制井。
  3. 删除步骤3.2 中添加的抗体溶液。用 100μl/井室温神经元介质清洗微板 3次, 以去除任何未结合的抗体。
  4. 在神经元培养基或细胞培养级水中制备 50 mm 的 dhpg 库存溶液。旋涡溶液短暂地完全溶解 dhpg。在实验的同一天准备新的解决方案。避免使用旧的或解冻的解决方案。
  5. 将神经元介质中的库存溶液稀释至 1:500, 以产生100μm 溶液。
  6. 从每个井中取出现有介质。从步骤3.5 开始, 在 100μm dhpg 库存解决方案中加入100μl/井。在5°c 二氧化碳37°c 的孵化器中孵育微板10分钟。
  7. 取出步骤3.6 中添加的 dhpg 溶液, 并添加100μlwell 神经元介质。重复此步骤一次。将微板置于孵化器在 37°c 5% co 2 中 5分钟.
  8. 在实验当天加入蔗糖, 使4% 的对苯二醛-% 蔗糖溶液在 pbs 中。避免使用旧的或解冻的解决方案。删除步骤3.7 中添加的媒体。加入 100μl/井, 加入4% 的对苯二醛-% 蔗糖溶液。对每个额外的时间点重复步骤3.6–3.8。完成后, 在4°c 下孵育微板20分钟。
    注意事项:在烟罩中处理甲醛库存。
  9. 从步骤3.8 中取出固定剂, 加入100μl/井的冷 1x dpbs。
  10. 删除 dpbs。加入150μl 井封堵剂 (tbs 中的一种即用型, 参见材料表), 在室温下孵育 90分钟, 然后在4°c 下孵育过夜。

4. 贴标签的地面感受器

  1. 制备 1: 1500 稀释680rd 山羊抗小鼠 igg 二级抗体的阻滞缓冲液。
  2. 从步骤3.10 中删除阻塞缓冲区。加入50μl/井的二级抗体溶液, 在室温下孵育 60分钟, 一旦添加二级抗体, 保持微板不受光的影响。在随后的孵化过程中, 一定要继续保护微板不受光线的影响。
  3. 从步骤4.2 中删除解决方案。加入 100μlwell tbs (50 mm Tris-HCl, 150 mm ncl, ph 7.6), 在室温下孵育 5分钟. 重复此步骤4。
  4. 从步骤4.3 中删除 tbs。在 pbs 中加入 100μl/井, 加入4% 的对戊二醛-% 蔗糖, 在室温下孵育15分钟。
  5. 从步骤4.4 中删除解决方案。加入 100μlwell tbs, 在室温下孵育 5分钟. 再重复此步骤2次。

5. 给内化受体群体贴标签

  1. 准备含有0.2% 皂甙的 tbs。旋涡溶液短暂地完全溶解皂甙粉末。使用0.2μm 滤光片过滤溶液, 去除任何可能导致自动荧光的颗粒。
  2. 加入含有0.2% 皂甙的 150μl tbs, 在室温下孵育15分钟。
  3. 从步骤5.2 中去除皂甙溶液, 并添加150μl·well 封堵剂。在室温下孵化90分钟。
  4. 准备 1: 1500 稀释800cw 驴抗小鼠 igg 二级抗体在阻断缓冲液中。
  5. 从步骤5.3 中去除阻滞剂, 并加入50μl/井的二级抗体溶液。在室温下孵化60分钟。
  6. 加入 100μlwell tbs, 在室温下孵育 5分钟, 再重复4次。

6. 成像和分析

  1. 根据制造商的说明, 使用红外激光成像系统对96孔微板进行成像。根据所使用的96孔微板的基高, 将扫描分辨率设置为 84μm, 将扫描质量设置为中等, 并将焦点偏移。点击 "图像工作室" 菜单按钮→导出→数字媒体图像→以 300 dpi 分辨率导出图像, 以 tiff 格式。
  2. 下载图片 j "斐济" 在 https://imagej.net/Fiji/Downloads
  3. 在图像 j "斐济" 中打开图像。点击 "图像" 菜单拆分颜色通道
    颜色→拆分通道。
  4. 从 "分析" → "工具" 中打开投资回报率管理器。选中投资回报率管理器中的 "标签" 框, 用数字标记圆圈。
  5. 在红色通道 (680 nm 表面受体池) 中, 通过选择圆形工具并绘制精确适合第一口井的圆, 选择感兴趣的区域 (roi)。按 ctrl + t。
  6. 将圆圈拖到下一个井, 然后按 ctrl + t. 重复, 直到所有井都被圈起来。
  7. 在投资回报率管理器中, 点击 "测量"。选择显示的值并将其复制到电子表格中。
  8. 单击绿色通道 (800 纳米内部受体池), 然后将选定的 roi 从步骤6.6 转到图像。在投资回报率管理器中, 点击 "测量"。选择显示的值并将其复制到电子表格中。
  9. 计算二次控制井的平均综合密度值。从平均二次控制表面受体池的综合密度值中减去每个实验井的综合密度值。对内部受体池重复此步骤。
  10. 使用 r计算表面受体表达的变化, 其中 r代表表面受体的综合密度, rt 表示表面受体 + 积分密度的综合密度。内部受体。

Representative Results

arcs· arg3.1 通过与 acp-2、内皮素-3 和动力-2 16、18后 mglur激活37的相互作用,加速ampa 受体吞。在弧形敲入鼠标 (arckr) 中, 弧形蛋白中的赖氨酸268和269被突变为精氨酸, 这干扰了弧形的泛素的吸收。这会损害电弧的蛋白酶依赖性周转, 延长其在神经元21,30中的半衰期。本实验采用高含量 ampa 受体贩运法检测了 arc 在调节 ampa 受体贩运中的持久性。神经元用 na +通道阻滞剂 ttx 治疗, 抑制动作电位, 降低弧38, 其次是 dhpg, 诱导弧形翻译和泛素 37,39。在 dhpg 冲洗后5分钟和15分钟测量了谷胱甘肽 a-(图 2a) 和含 GluA1 (图 3 a) 的表面和内化池 (图 3 a)。这个特殊的实验使用了3个独立实验的三个技术复制。与 wt 神经元相比, 与 wt 神经元相比, arckr 神经元在 dhpg 治疗时显示出更多的谷氨酸 a1 内吞, 这种效应在仅用 ttx 治疗神经元时是看不到的 (图 2b)。与 wt 神经元相比, glua2 亚基的表面表达在短时间内显著增加 (图 3b), 表明有可能的亚基替换30。有些井使用二级抗体治疗, 只是为了控制非特异性结合引起的背景荧光。

Figure 1
图 1: ampa 受体高含量贩运试验与受体生物素化测定的比较。与标准的生物素化检测相比, 高含量的贩运检测消耗的时间和资源较少。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: wt 和 arckr 海马神经元中 glua1 ampa ampa 受体亚基的表面和内部种群.(a) 表面 (sglua1) 和内化 (sGluA1) 含有谷蛋白 a1 受体亚基在 wt 和 arckr 海马神经元在5分钟和15分钟后 dhpg 冲洗。与 wt 相比, arckr 神经元在 dhpg 冲洗5分钟和15分钟后, 含有 sglua1 的 ampa 受体池进一步减少。(b) 图表示归一化为总荧光强度的表面荧光。统计比较是使用单向方差分析, 配对和未配对学生 t 测试。*p ≤0.05 ;n = 3个独立实验的3个技术副本。值表示平均值±sem。这一数字已从 wall、m. j. 等人的 2018年30修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: wt 和 arckr 海马神经元中 glua2 ampa 受体亚基的表面和内部种群.(a) 与图 2相同的实验条件。与 wt 相比, arckr 神经元在 dhpg 冲洗5分钟后, 含有 sglua2 的 ampa 受体池增加。(b) 图表示归一化为总荧光强度的表面荧光。使用单向方差分析、配对和未配对学生 t 测试进行统计比较。*p ≤0.05 ;n = 3个独立实验的3个技术副本。值表示平均值±sem。这一数字已从 wall、m. j. 等人的 2018年30修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

ampa 受体是一种离子性谷氨酸受体亚型, 是神经元功能的组成部分, 包括突触形成、突触稳定性和突触可塑性。ampa 受体中断与多种神经疾病24 有关, 被认为是有吸引力的药物靶点40。例如, 研究表明, 阿尔茨海默氏症 (ad) 最早的症状之一是突触丢失和突触受体水平降低41,42。有趣的是, 添加淀粉样物质----低聚物会损害突触43时含有谷蛋白 a1 的 ampa 受体表达.此外, 癫痫持续状态在海马神经元死亡44之前对其葡萄糖和蛋白质进行下调.在肌萎缩侧索硬化症 (als) 中, tar dna 结合蛋白 (tdp-43) 病理学, 一种 als 特异性分子异常, 与效率低下的 glua2 qsr 站点-rna 编辑45有关。

高含量 ampa 受体贩运检测为测量神经元网络内受体贩运谱的体积变化提供了一种有效的方法, 与替代方法相比, 所消耗的时间和材料要少得多。一个96孔微板提供了许多井运行多个技术复制和控制不同的实验条件下在同一板。与 5 x10 5 细胞井密度相比, 镀层密度低, 为 2 x10 4.井, 显著减少了每次实验所需的动物数量和材料 (图 1)。红外扫描仪一次最多可以成像 6个96孔的微板。该检测还可以修改为384井微板 46, 如果该检测是在难以获得或培养成本高昂的珍贵样品 (如人体样本和诱导多能干细胞) 上进行, 则具有特别的价值。整个检测可以在同一天完成和分析, 从而节省宝贵的时间 (图 1)。

为了成功和有效地完成检测, 需要考虑一些要点。首先, 在神经元治疗的同一天制备 dhpg 溶液是很重要的。不要再利用或冻结 dhpg 股票。pbs 溶液中4% 的对苯二醛-% 的蔗糖也应在实验当天制成新鲜。其次, 只用 ttx 或车辆处理的控制井需要确保观察到的效果是治疗所特有的。同样重要的是, 要包括只使用二级抗体处理的井, 以控制非特异性结合产生的背景荧光。请注意, 第二个固定步骤 (在冲掉二级抗体后) 是减少二级抗体背景效应和实现受体亚基有效标记的关键。

妥协和限制, 就像任何方法一样, 是存在的。此检测方法不提供单细胞 (或亚细胞) 分辨率, 也不允许像其他方法323335 一样实时跟踪受体贩运。此外, 在神经元的渗透过程中必须采取适当的注意, 因为这种方法在过度渗透的情况下, 对细胞内成分的泄漏是敏感的。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢扎卡里·艾伦的技术援助。这项工作得到了白厅基金会 (赠款 2017-05-35) 和 cleon c. arrington 研究启动赠款方案 (rig-93) 对 a. m. m. m. a. g. 和 d. w. y. 的支持, 这两个项目都得到了佐治亚州立大学神经基因组学2ci 研究金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

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