神经兴奋性可以通过兴奋性电离谷氨酸受体的内和外渗的动态过程来调节。这里描述的是一个可访问的, 高含量的检测定量表面和内部受体群体池。
突触后贩运受体进出细胞表面是神经元调节其对不同刺激的反应的重要机制。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 (ampa) 受体负责神经元中快速兴奋突触传递, 被贩运到突触后表面, 并从突触后表面动态改变神经元的兴奋性。ampa 受体贩运是突触可塑性所必需的, 可在神经疾病中中断。然而, 对受体贩运进行量化的流行方法忽略了整个受体池, 过于耗时和劳动密集型, 或有可能破坏正常的贩运机制, 从而使对由此产生的数据的解释复杂化。我们提出了一个高含量的检测定量表面和内部 ampa 受体群培养的原代海马神经元使用双荧光免疫标记和近红外荧光96井微板扫描仪。这种方法有助于快速筛选批量内化和表面受体密度, 同时最大限度地减少样品材料。然而, 我们的方法在获得单细胞分辨率或进行活细胞成像方面存在局限性。最后, 该协议可能适合其他受体和不同的细胞类型, 提供适当的调整和优化。
神经元兴奋性的大小和时间动力学在很大程度上取决于传递电化学信号的表面受体群的可用性和组成。虽然新的受体 (或受体亚基) 的合成通常是一个能量成本高、相对漫长的过程, 但大量专门用于现有受体内和分泌的细胞机制为它们的快速插入提供了一种手段和去除到和从膜1.因此, 除了转录和转化调节受体, 翻译后受体贩运是神经元兴奋性的一个重要调节剂。
突触可塑性, 或有经验的神经元之间连接的变化强度, 被认为构成学习和记忆2,3的基础。突触的增强和减弱, 分别称为长期增强 (ltp) 和长期抑郁 (ltd), 可以通过贩运α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 (ampa) 受体来调节4 个,5. ampa 受体是由四个亚基 (glua1-4) 组成的异质体, 并在大脑中介导大部分快速兴奋突触传递 6.因此, 神经元的兴奋性在很大程度上是突触后表面 ampa 受体数量的函数, 可由谷氨酸激活。ltd 通常与 ampa 受体内吞的增加有关, 而 ltp 主要与 ampa 受体外分泌的增加有关。ampa 受体的突触后表面表达要求腔内传递到外细胞蛋白, 然后与质膜融合以钙依赖的方式7,8,9,10,11,12,13,14. 还有许多机制可以调节活动依赖性 ampa 受体内吞。这方面的一个例子是通过立即早期基因 arce/ag3.1 (arc)。在其他功能15中, 弧通过其结合伙伴促进 ampa 受体内吞, 包括内皮细胞蛋白 ap-2、内皮素-3 和动力-2, 从而介导交代谷氨酸受体 (mglur) 依赖 ltd。16,17,18,1 9日, 在克拉林涂层坑 2 0、2 1.内化 ampa 受体可以回收回质膜, 也可以指定用于降解22,23。
重要的是, ampa 受体的亚基组成有助于其贩运动态24。主要的相关性是细胞内 c 端域的亚基, 其中大多数的翻译后修改和贩运相关的蛋白质相互作用发生。glua1 和 glua4 含有亚单元的 ampa 受体在 ltp 期间特别容易被贩运到细胞表面, 部分原因是它们的 pdz 配体存在, ~ 90个氨基酸序列通过与各种 pdz 的相互作用促进膜锚固含域蛋白25,26。另一方面, 含有谷胱甘肽2且缺乏 glua1 或 GluA2 的 ampa 受体往往被共同贩运, 但在细胞内积累, 具有突触活性27。glua2 亚基进行 rna 编辑, 除了促进内质网28中的保留外, 还使通道孔对钙29 不渗透, 进一步将亚单位特异性贩运作为神经元的关键中介体稳态和可塑性。有趣的是, 泛素依赖性电弧降解的破坏已被证明会增加 glua1 内吞, 并增加 GluA1 含有亚元 ampa 受体的表面表达, 在诱导 mglur-ltd 与选择性组 i mglur 激动剂后(s)-3, 5-二羟基苯基甘氨酸 (dhpg), 表明关于亚单元特异性 ampa 受体贩运的机制和作用还有很多东西需要学习.
观察受体表面表达变化的方法通常是繁琐的, 耗时的, 或带来不必要的混淆。基于生物素的检测是一种普遍的、市售的检测方法。生物素化表面受体的亲和力纯化就是这样一个例子, 然而, 进行电泳的必要性需要大量的样品材料, 并可能使多种治疗的筛选时间过长得令人望而却步过程31。延长这种检测方法, 其中多个时间点的标记和免疫沉淀进行, 以量化一个初始信号的逐渐退化, 类似地忽略了添加新的-或回收-受体到细胞表面, 只会加剧时间和材料要求。
其他方法利用嵌合结构或添加荧光标记来观察受体贩运 32, 有时使用活细胞成像33,34。虽然这些设计具有潜在的强大功能, 但由于这些蛋白质中引入的突变或分子量的剧烈变化, 这些设计会影响受体的正常贩运模式。使用标记亚细胞隔间的染料,以低 ph 值34,35 为标签, 是非特异性的, 并使区分不同的细胞内隔间对受体贩运很重要 (例如溶酶体)和蛋白酶体) 困难。最后, 利用共聚焦显微镜来可视化受体与贩运和降解相关标记的共化, 如外染色体蛋白或氯转素, 同时有可能提供有用的洞察特定定位与亚细胞分辨率, 是时间, 劳动密集型, 和昂贵的, 由于需要单独分析每个细胞和共聚焦或超分辨率显微镜的要求。
在这里, 我们演示了一种与原代神经元培养制剂30兼容的高含量受体贩运检测方法.该方法分别标记固定神经元的表面和细胞内受体池, 从而实现数据与该受体的归一化表面或内化受体密度的比率。这种方法的高含量性质是在短时间内筛选多种治疗和/或基因型的理想选择, 只需要标准的细胞培养和抗体培养专业知识。
简单地说, 原生神经元生长在标准的96孔微板中, 然后按照实验设计进行处理, 用原生抗体孵育, 清洗和固定。然后用二级抗体培养细胞来标记表面受体, 然后再进行另一个固定步骤。然后发生渗透, 并使用第二二级抗体标记内部受体池。最后, 使用红外荧光微板扫描仪对细胞进行成像, 以量化每个受体群体的综合密度。图 1总结了我们的高含量检测, 与传统的生物素化分析进行了比较。
虽然这里提供的协议是优化和特定的 ampa 受体贩运在初级海马神经元培养, 这一程序可以在理论上扩展和适应不同的受体在各种细胞类型。
ampa 受体是一种离子性谷氨酸受体亚型, 是神经元功能的组成部分, 包括突触形成、突触稳定性和突触可塑性。ampa 受体中断与多种神经疾病24 有关, 被认为是有吸引力的药物靶点40。例如, 研究表明, 阿尔茨海默氏症 (ad) 最早的症状之一是突触丢失和突触受体水平降低41,42。有趣的是, 添加淀粉样物质—-低聚物会损害突触43时含有谷蛋白 a1 的 ampa 受体表达.此外, 癫痫持续状态在海马神经元死亡44之前对其葡萄糖和蛋白质进行下调.在肌萎缩侧索硬化症 (als) 中, tar dna 结合蛋白 (tdp-43) 病理学, 一种 als 特异性分子异常, 与效率低下的 glua2 qsr 站点-rna 编辑45有关。
高含量 ampa 受体贩运检测为测量神经元网络内受体贩运谱的体积变化提供了一种有效的方法, 与替代方法相比, 所消耗的时间和材料要少得多。一个96孔微板提供了许多井运行多个技术复制和控制不同的实验条件下在同一板。与 5 x10 5 细胞井密度相比, 镀层密度低, 为 2 x10 4.井, 显著减少了每次实验所需的动物数量和材料 (图 1)。红外扫描仪一次最多可以成像 6个96孔的微板。该检测还可以修改为384井微板 46, 如果该检测是在难以获得或培养成本高昂的珍贵样品 (如人体样本和诱导多能干细胞) 上进行, 则具有特别的价值。整个检测可以在同一天完成和分析, 从而节省宝贵的时间 (图 1)。
为了成功和有效地完成检测, 需要考虑一些要点。首先, 在神经元治疗的同一天制备 dhpg 溶液是很重要的。不要再利用或冻结 dhpg 股票。pbs 溶液中4% 的对苯二醛-% 的蔗糖也应在实验当天制成新鲜。其次, 只用 ttx 或车辆处理的控制井需要确保观察到的效果是治疗所特有的。同样重要的是, 要包括只使用二级抗体处理的井, 以控制非特异性结合产生的背景荧光。请注意, 第二个固定步骤 (在冲掉二级抗体后) 是减少二级抗体背景效应和实现受体亚基有效标记的关键。
妥协和限制, 就像任何方法一样, 是存在的。此检测方法不提供单细胞 (或亚细胞) 分辨率, 也不允许像其他方法32、33、35 一样实时跟踪受体贩运。此外, 在神经元的渗透过程中必须采取适当的注意, 因为这种方法在过度渗透的情况下, 对细胞内成分的泄漏是敏感的。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢扎卡里·艾伦的技术援助。这项工作得到了白厅基金会 (赠款 2017-05-35) 和 cleon c. arrington 研究启动赠款方案 (rig-93) 对 a. m. m. m. a. g. 和 d. w. y. 的支持, 这两个项目都得到了佐治亚州立大学神经基因组学2ci 研究金的支持。
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
(RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
B-27 Supplement (50 X), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | Cat#15710064 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |