יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו – אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.
Postsynaptic סחר של רצפטורים על פני התא ואליה הוא מנגנון חשוב שבו נוירונים לווסת את התגובה לגירויים שונים. קולטני α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא) חומצה, אשר אחראים מהר סינאפסות הסינאפסית בנוירונים, בילנאומיים מן השטח postsynaptic כדי לשנות באופן דינמי עצביים דעתנית. אמפא קולטן סחר הוא חיוני פלסטיות סינפטית, עלולות להפגע, מחלה נוירולוגית. עם זאת, גישות נפוצות עבור לכימות קולטן סחר להתעלם בריכות קולטן כולו, הם יותר מדי זמן -, עתירי עבודה, או העלול לשבש את מנגנוני לסחר בבני אדם רגיל, ולכן לסבך את הפרשנות של הנתונים המתקבלים. אנו מציגים וזמינותו גבוהים-תוכן עבור כימות של פני השטח והן פנימיים אמפא קולטן אוכלוסיות בתרבית נוירונים בהיפוקמפוס הראשי באמצעות immunolabeling פלורסנט כפול וסורק microplate 96-ובכן פלורסנט-סגול. גישה זו מקלה על הקרנת בצובר הפנימו מהירה, על פני השטח קולטן צפיפויות תוך מזעור חומר מדגם. עם זאת, השיטה שלנו יש מגבלות קבלת רזולוציה תא בודד או תא חי דימות ניצוח. לבסוף, פרוטוקול זה עשוי להיות נוטה רצפטורים אחרים, לסוגי תאים שונים, הניתנים התאמות נאות ואופטימיזציה.
גודל ואת הדינמיקה הטמפורלי של דעתנית העצבית היא תלויה במידה רבה על זמינות, הרכב האוכלוסיות קולטן משטח מגלי אותות אלקטרוכימי. ואילו הסינתזה של קולטנים חדשים (או קולטן subunits) הוא בדרך כלל תהליך אנרגטית יקר וממושך יחסית, שורה של מכונות הסלולר מוקדש אנדו – ואת אקסוציטוזה של רצפטורים הקיימים מספקים אמצעי להכנסה מהירה שלהם והסרה של קרום1ואליה. לכן, בנוסף גנים ברמת השעתוק והתרגום ויסות רצפטורים, קולטן posttranslational סחר הוא אפנן חשוב של דעתנית עצביים.
פלסטיות סינפטית, או שינוי עוצמת קשרים בין נוירונים עם ניסיון, הוא חשב יוצרות את הבסיס של לימוד, זיכרון2,3. חיזוק והתערערות של הסינפסות לאורך זמן, כינה הויסעגט (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ), בהתאמה, יכול להיות מאופנן דרך הסחר של רצפטורים חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא) 4 , 5. אמפא רצפטורים הן heterotetramers המורכב מארבע subunits (GluA1-4), לתווך הרוב המכריע של סינאפסות מהר הסינאפסית ב המוח6. לכן, נוירון דעתנית הוא במידה רבה פונקציה של הכמות של אמפא רצפטורים על פני postsynaptic זמין תופעל על-ידי גלוטמט. בע מ מזוהה בדרך כלל עם עלייה אמפא קולטן אנדוציטוזה, ואילו LTP מזוהה בעיקר עם עלייה אמפא קולטן אקסוציטוזה. ביטוי משטח postsynaptic של אמפא רצפטורים דורש endosomal משלוח חלבונים exocytotic, איפה פיוז’ן עם קרום פלזמה אז מתרחשת באופן תלוי סידן-7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. קיימים גם שורה של מנגנונים המסדירים את פעילות תלויי אמפא קולטן אנדוציטוזה. דוגמא אחת היא דרך הגן מוקדם מיידי Arc/Arg3.1 (Arc). בין פונקציות אחרות15, Arc ידוע לתווך גלוטמט מטבוטרופי (mGluR)-תלוי בע מ באמצעות קידום אמפא אנדוציטוזה קולטן דרך שותפיה איגוד, אשר כוללים את החלבונים endocytic AP-2, endophilin-3 dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19-מצופים clathrin בורות20,21. למביטה אמפא רצפטורים יכולים להיות ממוחזרים בחזרה אל קרום פלזמה או לייעד את השטח השפלה22,23.
חשוב לציין, ההרכב יחידת משנה של אמפא רצפטורים תורמת שלהם דינמיקה סחר24. מידת הרלוונטיות העיקריים הוא תאיים C-מסוף תחום של subunits, שבו רוב השינויים posttranslational אינטראקציות חלבון סחר הקשורות להתרחש. GluA1, GluA4 המכילים יחידת משנה אמפא רצפטורים נוטים במיוחד להיות הנסחר השטח תא במהלך LTP, בין השאר בשל נוכחותם של ליגנדים PDZ שלהם, רצפים של חומצות אמיניות ~ 90 המקדמים ממברנה עיגון באמצעות אינטראקציות עם PDZ שונים תחום המכיל חלבונים25,26. מצד שני, אמפא רצפטורים המכיל GluA2, GluA1 או GluA4 נוטים להיות הנסחר צורונים אבל להצטבר intracellularly עם פעילות סינפטית27. GluA2 subunits עוברים RNA עריכה אשר, בנוסף קידום השמירה רשתית תוך-פלזמית28, רינדור הנקבובית ערוץ אטום סידן29, בהמשך שמערבות יחידת משנה ספציפי סחר כמתווך מפתח של עצביים הומאוסטזיס, פלסטיות. מעניין, שיבוש אוביקוויטין תלוית Arc השפלה הוכח להגביר אנדוציטוזה GluA1 ולהגביר את הביטוי משטח של אמפא רצפטורים של יחידת משנה המכילות GluA2 לאחר אינדוקציה של mGluR-בע מ עם סלקטיבי לקבץ אני אגוניסט mGluR (S) – 3.5 – Dihydroxyphenylglycine (DHPG), המציין כי הרבה נשאר מה ללמוד לגבי מנגנוני ו תפקיד של יחידת משנה ספציפי אמפא קולטן סחר30.
שיטות התבוננות שינויים בביטוי משטח של קולטני לעיתים מסורבל, זמן רב, או להציג מיותרים מבלבל. מבחני מבוסס-ביוטין הן בגישה נרחבת, זמינים מסחרית. זיקה טיהור של קולטני משטח biotinylated מייצג דוגמה אחת כזו, אולם נחיצות ביצוע אלקטרופורזה דורש כמות גדולה של חומר מדגם לרנדר ההקרנה של ריבוי טיפולים ארוך מדי תהליך31. הרחבות של זה וזמינותו, איפה נקודות זמן מרובות של תיוג, immunoprecipitations מתבצעים לכמת את הידרדרות הדרגתית של אות הראשונית, בדומה להזניח את התוספת של חדש — או ממוחזרים – רצפטורים לתא השטח ורק להחריף הזמן ואת דרישות החומרים.
גישות אחרות לעשות שימוש בונה chimeric או התוספת של תגיות פלואורסצנט לצפות קולטן סחר32, לעתים תוך שימוש חי תא33,הדמיה34. בזמן פוטנציאל רב-עוצמה, עיצובים אלו יכולים להשפיע על הדפוסים לסחר בבני אדם נורמלי של קולטני עקב מוטציות או שינויים דרמטיים משקל מולקולרי הציג חלבונים אלה. השימוש של צבעי כי תאים subcellular תווית על ידי מיקוד pH נמוך34,35 הם בלתי ספציפיים ולעשות הבחנה בין תאים תאיים שונים חשוב קולטן סחר בבני אדם (למשל. lysosomes ו proteasomes) קשה. לבסוף, השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית להמחיש את colocalization של קולטני עם סמנים המשויך סחר והשפלה, כגון חלבונים endosomal או clathrin, תוך מתן שעשוי להיות שימושי תובנה לוקליזציה ספציפי עם רזולוציה subcellular, האם הזמן עתירי עבודה, יקר בשל הצורך ניתוח בנפרד בכל תא לבין הדרישה קונאפוקלית או מיקרוסקופ ברזולוציה-העל.
. הנה, נדגים assay סחר קולטן גבוהה-תוכן התואם ראשי תרבות עצביים ההכנות30. שיטה זו תוויות בנפרד בבריכות קולטן משטח, תאיים של הנוירונים קבוע, המאפשר הצגת נתונים כיחס של משטח מנורמל או צפיפות קולטן למביטה לצפיפות הכוללת עבור כי קולטן. הטבע גבוהה-תוכן של שיטה זו הוא אידיאלי עבור הקרנת מספר טיפולים ו/או אחרים בתוך מסגרת זמן קצר, ודורש תא רגיל רק culturing נוגדן הדגירה ומומחיות.
בקצרה, נוירונים העיקרי גדל סטנדרטי microplates 96-ובכן, ואז שטופלו כפי שמכתיבה תכנון ניסויים, מודגרות עם נוגדנים הראשי, שטופים קבוע. תאים מודגרת אז עם נוגדן משני לתייג רצפטורים משטח, ואחריו שלב קיבוע נוסף. מתרחשת permeabilization ואז ומשמש נוגדן המשני השני לתייג בריכות קולטן פנימי. לבסוף, התאים הם צילמו באמצעות סורק microplate פלורסנט אינפרא-אדום כדי לכמת את הצפיפות משולבת של כל האוכלוסייה קולטן. איור 1 מסכמת שלנו וזמינותו גבוהים-תוכן לעומת assay biotinylation המסורתי.
בעוד הפרוטוקול הציע הנה ממוטבת וספציפי על קולטן אמפא סחר בתרבויות העיקרי נוירון בהיפוקמפוס, הליך זה, תיאורטית, להיות מורחב, מותאם קולטנים שונים במגוון סוגי תאים.
אמפא רצפטורים הן סוג של קולטן גלוטמט ionotropic זה הוא חלק בלתי נפרד עבור פונקציות עצביים הכוללים סינפסה היווצרות סינפסה ויציבות פלסטיות סינפטית. אמפא קולטן הפרעה מקושר הפרעות נוירולוגיות מספר24 , והם נחשבים אטרקטיביים סמים מטרות40. לדוגמה, מחקרים הראו כי אחד הסימנים המוקדמים של מחלת אלצהיימר (AD) אובדן סינפסה, מופחתת סינפטית אמפא קולטן רמות41,42. מסקרן, תוספת של עמילואיד-ß oligomers פוגע ביטוי הקולטן אמפא המכילות GluA1 משטח הסינפסות43. יתר על כן, סטטוס אפילפטיקוס למטה-מסדיר GluA2 mRNA וחלבון בנוירונים בהיפוקמפוס שלפני המוות שלהם44. נוירודגנרטיביות (ALS), TAR DNA כריכת חלבון (TDP-43) פתולוגיה, חריגות מולקולרי ספציפי ALS, יש כבר אתר GluA2 Q/R מקושר לא יעיל-RNA עריכת45.
אמפא גבוהה-תוכן קולטן וזמינותו סחר מספק אמצעי יעיל למדידת שינויים בכמות גדולה בפרופילי סחר קולטן בתוך רשת עצביים בתגובה לגורמים שונים, לצרוך הרבה פחות זמן וחומרים מאשר שיטות אלטרנטיביות. Microplate 96-ובכן יחיד מספק בארות רבות כדי להפעיל טכנית מרובים משכפל ופקדים עבור תנאים שונים ניסיוני באותה הצלחת. צפיפות נמוכה ציפוי של 2 x 104 תאים/טוב יחסית צפיפות התאים/טוב 5 x 105 מפחית באופן משמעותי את מספר חיות וחומרים הדרושים עבור ניסוי (איור 1). דאגה אפשר תמונה עד שישה 96-ובכן microplates בכל פעם. גם יכול להיות שונה וזמינותו 384-ובכן microplate46, אשר הופך להיות יקר במיוחד אם וזמינותו מופעל על דגימות היקרה, קשה להשיג או יקרים לתרבות (למשל אדם ודוגמאות גזע pluripotent המושרה). וזמינותו כולו יכול להיות הושלמה וניתח באותו יום, אשר חוסך זמן יקר (איור 1).
עבור סיום מוצלח ויעיל וזמינותו, כמה נקודות צריך להיחשב. ראשית, חשוב להכין את הפתרון DHPG באותו יום של נוירון טיפול. אין לעשות שימוש חוזר או להקפיא DHPG מניות. סוכרוז paraformaldehyde/4% 4% ב- PBS פתרון צריך להתבצע גם טריים באותו יום של הניסוי. שנית, שליטה בארות שטופלו TTX בלבד או הרכב נדרשים כדי להבטיח כי ההשפעות נצפתה ספציפי לטיפול. חשוב גם כדי לכלול בארות שטופלו רק נוגדנים משניים כדי לשלוט על רקע זריחה המיוצר על-ידי איגוד שאינם ספציפיים. שימו לב כי הצעד השני קיבעון (הבאים כשלון של נוגדנים משניים) מפתח כדי להפחית את תופעות רקע נוגדנים משניים ולהשיג labelling יעיל של הקולטן subunits.
פשרות ומגבלות, כמו עם כל שיטה, קיים. Assay הזה אינו מספק רזולוציה תא בודד (או subcellular), אינו מאפשר מעקב בזמן אמת של קולטן סחר כמו שאר שיטות32,33,35. בנוסף, טיפול נאות יש לנקוט במהלך השלב permeabilization של הנוירונים, כמו בשיטה זו יהיה רגיש הדליפות מרכיבים תאיים במקרה של permeabilization יתר.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים זכריה אלן לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי קרן וייטהול (גרנט 2017-05-35), קליאון ג ארינגטון חניכה גרנט תכנית המחקר (מעטה-93) A.M.M. M.A.G., D.W.Y. היו שניהם נתמך על ידי מלגת 2CI Neurogenomics אוניברסיטת מדינת ג’ורג’יה.
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
(RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
B-27 Supplement (50 X), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | Cat#15710064 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |