Summary
Qui, presentiamo un protocollo per guidare la gestione umana primaria della prostata organoid quindi suggerire gli endpoint per valutare il fenotipo. Semina, manutenzione di cultura, recupero da gel "matrix", quantificazione morfologica, l'incorporamento e sezionamento, FFPE sezionamento, intero-monta macchiatura e applicazione di test commerciali sono descritti.
Abstract
Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la coltura (3D) tridimensionale, il trattamento e la valutazione dei organoids della prostata primaria umana. Il processo prevede la semina delle cellule epiteliali scarsamente in un gel di matrix 3D su una micropiastra da 96 pozzetti con le modifiche di supporto a coltivare espansione in organoids. Morfologia è quindi valutato bene tutta la cattura di immagini dello stack z. Compressione di z-stack crea un'unica immagine di messa a fuoco da cui organoids sono misurati per quantificare una varietà di uscite, tra cui circolarità, rotondità e area. DNA, RNA e proteine possono essere raccolti da organoids recuperati dal gel matrix. Popolazioni di cellule di interesse possono essere valutate da dissociazione organoid e citometria a flusso. Formalina-fissazione--inclusione in paraffina (FFPE) seguita da sezionamento viene utilizzato per la valutazione istologica e la macchiatura dell'anticorpo. Intero-monta macchiatura immunofluorescente conserva morfologia organoid e facilita l'osservazione di localizzazione della proteina in organoids in situ. Test commerciali che sono tradizionalmente usate per le cellule dello strato monomolecolare 2D possono essere modificate per organoids 3D. Le tecniche in questo protocollo, utilizzati insieme, forniscono una robusta cassetta degli attrezzi per quantificare la crescita organoid della prostata, le caratteristiche morfologiche e l'espressione di marcatori di differenziazione.
Introduction
Organoids sono uno strumento prezioso per studiare l'organogenesi e malattia. Essi forniscono un'alternativa meno costosa ai modelli animali, e paziente-derivati organoids stanno evolvendo come una strategia per la medicina personalizzata1,2,3. Questo sistema tridimensionale (3D) cultura coinvolge la semina di cellule staminali o progenitrici (raccolte da tessuti o cellule staminali pluripotenti indotte) in un gel di componenti della matrice extracellulare (gel "matrix")4. Le cellule proliferano e si differenziano, conseguente organotipiche strutture che ricapitolano la gerarchia cellulare e la morfologia dell'organo dell'unità funzionale di interesse. Organoids sono state coltivate utilizzando cellule provenienti da una varietà di organi, tra cui delle ghiandole salivari, stomaco, intestino, fegato, prostata, polmone e cervello4. Anche se esistono numerosi protocolli che descrive i passaggi per stabilire della prostata organoids5,6, è difficile trovare metodi sufficientemente dettagliate su come raggiungere quantitativi endpoint da organoids. Questo documento riassume i metodi sviluppati per cellule umane della prostata primarie e dettagli di una serie di endpoint suggerite per valutare i fenotipi organoid. Queste tecniche sono state ottimizzate per organoids della prostata e possono essere applicabili alle altre colture cellulari 3D.
Culture della prostata organoid recentemente sono emerso come stabilito un modello prezioso in vitro che manca le limitazioni delle colture monostrato utilizzando linee cellulari immortalizzate. Epitelio benigno della prostata e carcinoma della prostata è impegnativo per il modello in vitro utilizzando linee cellulari immortalizzate. Il numero di linee cellulari benigne è limitato, e tutti sono stati sottoposti a trasformazione con oncogeni7. Cellule epiteliali della prostata primarie negli strati monomolecolari non differenziarsi in cellule luminal e mancanza dell'androgeno recettori8. La maggior parte delle linee cellulari del carcinoma della prostata non hanno recettori per gli androgeni funzionale, un importante mediatore di precoce stato di malattia e mancanza chiave modifiche genetiche che sono state trovate in pazienti tumori9. Della prostata organoid culture possono essere coltivate facilmente da epitelio benigno e sono utili nello studio delle proprietà delle cellule staminali, cellule progenitrici, differenziazione e gli effetti di modifiche sperimentali nel microambiente4,5. Organoids di carcinoma della prostata può essere coltivata come parte di un approccio di medicina di precisione alla modellazione malattia paziente e della risposta a terapie10.
Questo protocollo è stato compilato da protocolli esistenti che utilizzano vari tipi di cellule, ma è stato qui ottimizzato per l'uso in cellule umane di carcinoma della prostata primarie. Complimenti protocolli delineati da Sawyers, Clevers e Shen5,6 che descrivono la crescita, passaggio, campo chiaro imaging, crioconservazione e isolamento di RNA e DNA del mouse della prostata e organoids umano. Il protocollo di intero-monta viene modificato da Mahé et al. 11, che ha usato organoids epiteliali gastrointestinali e descrive live imaging e congelati e l'incorporamento di paraffina. Borten et al. 12 descritto l'analisi del seno, del colon e cancro colorettale organoid morfologia da campo chiaro imaging. Inoltre, Richards et al. 13 utilizzato un metodo per la valutazione morfologica dei organoids della prostata. Infine, Hu et al. 14 descritto un metodo della prostata aderente organoids a una diapositiva di camera pernottamento prima la macchiatura immunofluorescente per osservare cellule singole e dispersione delle sfere per analisi di citometria a flusso.
L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare in modo sufficientemente dettagliato questi metodi tecnicamente impegnativi come un protocollo, tra cui semina delle cellule; media e matrice gel manutenzione; insieme di celle per citometria a flusso; RNA, DNA ed estrazione di proteine; valutazione morfologica da analisi dello stack z campo chiaro; l'incorporamento, lavorazione e sezionamento per la macchiatura istologici; e tutto-montaggio per immunofluorescenza o sonda fluorescente saggi. La rilevanza biologica e l'interpretazione di questi vari endpoint varierà tra disegno sperimentale e gli anticorpi usati per l'analisi. Attraverso l'utilizzo di questo protocollo, gli utenti dovrebbero sentirsi pronti a impostare un esperimento con un toolkit di endpoint.
Cellule di (PrE) epiteliali prostatiche primarie umane sono state stabilite in laboratorio dal protocollo descritto da15,16 e mantenuto a un numero limitato di passaggi (fino a quattro) come descritto in precedenza17, ma sono anche disponibili da fornitori commerciali. Dell'epatocita privo di siero basato su media6, basati su KSFM13e R-spondin 1-condizionati5 media è tutti pubblicati come avendo prodotto con successo organoids. Basato su KSFM richiede il minor numero di additivi, quindi viene descritto qui.
Protocol
Il seguente protocollo è stato ottimizzato utilizzando cellule epiteliali prostatiche primarie umane raccolte dal tessuto del paziente presso la University of Illinois at Chicago Hospital. Tutti i tessuti umani utilizzati per questi esperimenti sono stati acquisiti tramite un Institutional Review Board-approvato protocollo e/o esenzione presso la University of Illinois a Chicago. Mentre le condizioni della coltura varia secondo il tipo di cella di interesse, gli endpoint possono essere applicati a organoids di altri tessuti.
1. semina delle cellule epiteliali in gel "Matrix" e la sostituzione del supporto
- Raccogliere i materiali necessari: primarie cellule epiteliali prostatiche umane (PrE), gel "matrix" su ghiaccio, micropiastra a 96 pozzetti, dei cheratinociti privo di siero media (KSFM) sul ghiaccio, carboncino spogliato siero bovino fetale (FBS) e il diidrotestosterone (DHT).
- Preparare supporti basati su KSFM organoid combinando 47,5 mL di KSFM con 2,5 mL di carbone FBS spogliato e diidrotestosterone (DHT) a una concentrazione finale di 10 nM DHT, quindi riserva sul ghiaccio.
- Celle di piastra in una matrice 3D in una cappa di cultura cellulare utilizzando una tecnica sterile.
- Delicatamente freddo mix media basati su KSFM organoid con gel di matrice ghiacciata per ottenere una matrice di 50% gel miscela di lentamente su e giù il pipettaggio, evitando bolle.
Nota: Matrix gel dovrebbe essere scongelati durante la notte a 4 ° C e tenuta su ghiaccio quando possibile. Si solidifica rapidamente a temperatura ambiente (TA). - Pre-bagnato un puntale in media freddo e trasferimento 40 – 50 μL di 50% matrice del gel sul fondo di ciascun pozzetto per essere utilizzato su una piastra a 96 pozzetti. Ricoprire il fondo del pozzo per formare uno strato di base.
Nota: Non versare completamente alla seconda fermata sulla pipetta, come questo può creare bolle. - Inserire la piastra a 96 pozzetti in incubatore a 37 ° C per 30 – 45 min a solidificare lo strato di base.
Nota: Non piastra cellule epiteliali sul livello base fino a quando non è solidificato, o cellule possono cadere attraverso la matrice sul fondo del piatto e crescere come uno strato monomolecolare. - Mescolare cellule epiteliali sospese nei mezzi di comunicazione basati su KSFM organoid con gel di matrice per ottenere una concentrazione finale di 100 – 1.000 cellule/100 μL e 33% gel "matrix". Cellule epiteliali piastra sopra strati di base utilizzando 100 μL di miscela di 33% matrice gel/cellule per pozzetto.
Nota: Gli esperimenti precedenti hanno dimostrato che semina di cellule epiteliali troppo densamente in 3D limiterà la dimensione di crescita organoid, mentre semina troppo scarsamente può provocare la bassissima resa13. È importante ottimizzare le condizioni di semina per il tipo di cella di interesse, basata sull'efficienza di formazione di paziente-specific organoid.
- Delicatamente freddo mix media basati su KSFM organoid con gel di matrice ghiacciata per ottenere una matrice di 50% gel miscela di lentamente su e giù il pipettaggio, evitando bolle.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore a 37 ° C per 30 – 45 min consentire il gel "matrix" a solidificare, poi delicatamente aggiungere 100 μL di media basato su KSFM organoid sopra cellule pipettando lentamente contro il bordo del pozzo.
- Modificare i media ogni 2 – 3 giorni. Pipettaggio contro il lato del pozzo con spazio tra il gel di media e matrice, rimuovere delicatamente 50 μL di media e sostituire con 50 μL di mezzi freschi.
Nota: Per una cultura a lungo termine, il gel di matrice deve essere cambiato ogni 2 – 3 settimane. Se la cultura di matrice gel vengono visualizzate traslucide rughe sotto il microscopio e instabile, il gel "matrix" ha abbattuto e deve essere sostituito.
2. raccolta dei Organoids da gel "Matrix"
Nota: Insieme di organoids è necessaria per le modifiche di matrice gel, passaggio o endpoint di estrazione del RNA, DNA estrazione, estrazione di proteine e citometria a flusso.
- Proteasi neutre calde e Hanks' equilibrata soluzione salina (HBSS) in bagnomaria a 37 ° C.
- Rimuovere con cautela la media da pozzi senza interrompere il gel "matrix".
- Aggiungere ~ 200 μL di proteasi neutre a ciascun pozzetto in un ~ 1:2 rapporto della proteasi di matrice gel: neutro e incubare per 20 min a 37 ° C.
- Meccanicamente è possibile dissociare la miscela di proteasi di matrice gel: neutro pipettando su e giù.
- Incubare per 20 min a 37 ° C.
- Trasferire il composto di cellula del gel neutro proteasi-matrice in un tubo del microcentrifuge o tubo conico, a seconda del volume. Centrifugare a 300 x g per 3 – 5 min agglomerare le cellule.
Nota: Se viene visualizzata la finestra di nessun pellet cellulare, il gel di matrice non può essere dissociato completamente e può essere visualizzato come una fase trasparente nella parte inferiore del tubo distinto dal surnatante rosa. Eliminare il surnatante e aggiungere più neutrale della proteasi con un rapporto di 1:2 a matrice il pellet di gel, incubare per un altro 20 – 40 min a 37 ° C e ripetere la centrifugazione a 300 x g. - Quando viene acquisito un pellet organoid, eliminare il surnatante. Procedere con il passaggio (Vedi punto 2.7.1), organoid Lisi per l'estrazione di RNA, DNA o proteine (Vedi punto 2.7.2), cellule di elaborazione singola da citometria a flusso e l'ordinamento di singola cellula (Vedi punto 2.7.3).
- Per coltura a lungo termine, Risospendere delicatamente organoids intatto in 33% matrice fresco gel e piastra seguendo la procedura descritta nei passaggi 1.1 – 1.5. Per dissociare organoids e replate come celluli, risospendere il pellet in 1 mL di enzimi calda cella-dissociazione e incubare a 37 ° C per 10 – 15 min, lavare una volta con 5 mL di HBSS e ri-lastra nel gel fresco matrice seguendo passaggi 1.1 – 1.5.
- Risospendere il pellet di organoid in un buffer di lisi appropriato per l'estrazione del RNA, estrazione del DNA o estrazione della proteina, come elencato nella Tabella materiali e seguire il protocollo del produttore.
- Risospendere organoids in 1 mL di enzimi calda cella-dissociazione e incubare a 37 ° C per 10 – 15 min dissociare il organoids in singole celle. Lavare una volta con 5 mL di HBSS e procedere con il protocollo per flusso cytometry5 o cella singola sequenza18.
Nota: Per annullare l'associazione in singole celle a basse concentrazioni di gel "matrix", la proteasi neutra non possono essere necessari, e gli enzimi cellulari-dissociazione possono essere applicati direttamente al pozzo dopo passo 2.2.
3. tutto-pozzo immagine acquisizione e l'analisi della morfologia Organoid
- Acquisire immagini tutto-ben z-stack utilizzando un microscopio invertito luce trasmesso con un motorizzato X / Y scansione fase (flusso di lavoro illustrato in Figura 1A).
- Con la posizione focale regolata sul fondo del pozzo, iniziare a concentrarsi verso l'alto finché non viene rilevato il primo organoid, che sarà al centro del pozzo a causa del menisco dal livello di base. Impostare il piano z inferiore in questa posizione.
- Continua messa a fuoco verso l'alto fino a quando l'ultimo organoid è a fuoco, che sarà nella periferia del pozzo. Impostare il z-piano superiore in questa posizione.
Nota: Dopo aver impostato la parte superiore e inferiore dello z-stack, assicurarsi che queste posizioni catturano il organoids all'interno di tutti i restanti pozzetti e regolare il superiore/inferiore, se necessario. Questo permette la gamma z da utilizzare per una singola scansione che include ogni organoid all'interno di ciascun pozzetto. - Acquisire 15 – 35 z-aerei per pozzetto, utilizzando un numero maggiore per una maggiore risoluzione. Catturare l'intera immagine bene, unire e raccogliere quadranti o sottosezioni se necessario.
Nota: Si consiglia di prendere z-piani multipli al contrario di un singolo piano z, come illustrato in Figura 1B in cui organoids sono fuori fuoco durante l'acquisizione di un solo piano z. - Salvare le immagini di z-stack per analisi a valle.
- Analizzare le immagini utilizzando il software di immagine con capacità di disegno a mano libera.
- Aprire una singola immagine di piano z impostare dal punto 3.1.4.
- Se necessario, affiancare le immagini scattate a ogni singolo piano z in un'immagine singola, tutto-bene. Salvare la nuova immagine come un file separato. Ripetere questo processo per ogni z-plane acquisito.
- Utilizzando il software di immagine, aprire l'immagine intera-pozzo per ogni z-plane da un singolo pozzo e creare un'estensione della profondità di campo (EDF) immagine dallo stack di z-aerei.
Nota: Questo tipo di immagine selezionerà la migliore regione di messa a fuoco di ogni z-plane per creare una singola immagine di messa a fuoco del pozzo. - Impostare la scala di pixel del software per la barra della scala dell'immagine che si sta misurando.
- Utilizzando lo strumento di disegno a mano libera del software image, tracciare il perimetro di ogni organoid nel pozzo.
- Ottenere le metriche di misurazione per perimetri organoid tracciata dal software immagine.
Nota: I parametri raccomandati sono area, circolarità e rapporto massimo/minimo raggio. Risultati rappresentativi che illustra l'applicazione di queste metriche sono mostrati in Figura 1. Area è calcolata dal poligono definito dal perimetro di organoid. La circolarità è il rapporto tra l'area di organoid per l'area di un cerchio con furetto massimo di diametro uguale il organoid, dove 0 è meno circolare e 1 è più circolare. Raggio di massimo/minimo rapporto è il rapporto tra il raggio massimo e minimo raggio del tracciato organoid.
Circolarità =
Rapporto raggio =
4. paraffina e fissazione in formalina incorporamento dei Organoids per gli endpoint istologici
- Preparare l'incorporamento forniture: HBSS, soluzione al 2% agar, istologico marcatura tinture, gel di istologia, pipettare punta muffa, nastro, stantuffo da una siringa da insulina 1 cc, impacco di ghiaccio, cassette, Formalina 10% neutra tamponata (NBF), matita ed etanolo (EtOH) di grado istologico di 75%.
- Preparare due provette per microcentrifuga di soluzione al 2% agar. Incubare in un bagno d'acqua o su un blocco di calore a 100 – 110 ° C per mantenere agar in forma liquida. Aggiungere 1-2 gocce di istologico marcatura colorante per una delle soluzioni 2% agar, che si denotano la parte superiore dell'agar spina e al mantenimento di orientamento durante l'incorporamento. Mescolare bene.
- Caldo il gel di istologia in un blocco di calore o vasca di acqua a 55 – 65 ° C.
- Utilizzando un puntale di 1000 μL, creare stampi tagliando fuori una piccola sezione della punta della pipetta per rendere un cilindro che contiene ~ 50 μL. Creare un secondo, più ampio di stampo che si adatta intorno allo stampo primo.
- Creare un blocco freddo eseguendo il wrapping di un impacco di ghiaccio con nastro (lato adesivo verso l'alto) e aderendo stampi al nastro.
- Creare uno stantuffo rimuovendo lo stantuffo da una siringa da insulina 1 cc.
- Incorporare il organoids in una spina di gel di istologia per l'elaborazione, seguendo il flusso di lavoro raffigurato in Figura 2A.
- Dissociare il gel "matrix" e pellet organoids seguendo passaggi 2.1 – 2,7.
- Lavare la pallina organoid una volta con 1 mL di HBSS e ri-pellet spinning per 3 – 5 minuti a 300 x g e rimuovendo il supernatante.
- Risospendere il pellet di organoid in 30 – 50 μL di gel liquido istologia. Mescolare delicatamente pipettando su e giù lentamente. Trasferire la miscela di gel/organoid istologia in uno stampo sul blocco freddo e consentire l'esemplare raffreddare e solidificare in una spina.
- Utilizzare uno stantuffo per spingere la spina dalla piccola muffa e nello stampo più grande. Pipettare chiaro 2% agar intorno alla candela per riempire lo stampo più grande.
- Pipettare istologico agar 2% colorato di tintura in cima la spina per denotare la parte superiore del campione.
- Una volta raffreddato, è possibile utilizzare un pistone per trasferire la spina in una cassetta di istologia. Etichettare la cassetta utilizzando una cassetta matita e posto in 10% NBF per fissazione durante la notte.
- Trasferire la cassetta da 10% NBF al grado istologico 70% EtOH.
- Processo il gel di istologia spina utilizzando un protocollo di biopsia pre-impostati su un processore, se disponibile. Se predefinito non è disponibile, inserire la seguente sequenza e lunghezze: 70% EtOH per 6 min, 70% EtOH per 10 min, 80% EtOH per 10 min, 95% EtOH 2 volte per 10 min, 100% EtOH 3 volte per 10 min, xilene 3 volte per 15 min , e paraffina 3 volte per 15 min. deviando da quella raccomandata sequenza di elaborazione può provocare la rottura organoids (Figura 3A).
- Incorporare la spina del gel di istologia con la parte colorata rivolta verso l'alto, in modo che la parte scolorita contenente il organoids per essere sezionato in prima.
- Sezione l'istologia FFPE blocchi del gel:
- Raccogliere le forniture necessarie: l'istologia FFPE gel penna di istologia, bagnomaria tessuto galleggiante, blocchi, secchiello con ghiaccio, microtomo, microtomo lame, l'incorporamento di workstation, vetrini da microscopio e laboratorio forno caricato positivamente.
- Riempimento a bagnomaria fino a quando è molto pieno e insieme a 40 ° C, poi il forno di preriscaldamento laboratorio a 45 – 50 ° C.
- Preparare un secchio di ghiaccio, poi riempire con ghiaccio e aggiungere acqua per creare un impasto di acqua e ghiaccio. Chill, i blocchi di ghiaccio fino a quando sono molto fredde.
Nota: Blocchi possono essere impostati sul ghiaccio per fino a 1 giorno, ma se lasciato durante la notte, i blocchi saranno diventati idratati e avrà bisogno di essere rielaborato. - Inserire un blocco nel morsetto di microtomo, aggiungere la lama del portalama e sbloccare eventuali misure protettive di bloccaggio sulla macchina.
- Iniziare tagliando la faccia del blocco paraffina (fronte al largo) con uno spessore di 10 µm. Una volta che una sezione emerge che contiene l'area di spina, interrompere l'operazione di taglio, bloccare il rotore del microtomo e trasferire il blocco indietro sul ghiaccio per raffreddare. Se diversi isolati devono essere sezionato, face-off ogni blocco prima di passare al passo 4.5.6.
- Spostare la lama in una nuova parte inutilizzata e trasferire il blocco indietro al morsetto. Sbloccare la macchina e iniziare rifilatura a 5 μm per ogni sezione.
Nota: 5 μm è consigliato per ottenere i migliori risultati, ma 3 – 10 μm è anche accettabile. - Con una pinzetta, trasferire la sezione a bagno d'acqua di 40 ° C e consentire la sezione stendere. Trasferire la sezione su un vetrino immergendo verticalmente in acqua.
Nota: Immersione in un angolo può trasferire le bolle dal fondo della vasca alla sezione e causare la distorsione del campione. - Visualizzare la sezione al microscopio (Figura 2BC).
Nota: Se un organoid presente, apparirà simile alla freccia rossa in figura 2B. Bolle (Figura 2B, freccia blu) possono apparire simile a organoids e sono più facili da discernere in una diapositiva di fresco asciutto organoids appaiono traslucide (Figura 2). Se nessun organoids sono presenti, sezione ulteriormente nel blocco.
- Quando sono state acquisite diapositive contenenti organoids, cerchio della zona intorno alla sezione sul retro della diapositiva con una penna di istologia e cuocere durante la notte a 45 – 50 ° C.
- Raccogliere le diapositive e procedere alla H & E (Vedi punto 4.9.1), immunohistochemical (vedere il passaggio 4.9.2), o immunofluorescenza colorazione (vedi passo 5).
Nota: I risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3B.- Per eseguire H & E che macchia, ottenere un kit dalla lista materiali e seguire le specifiche del produttore.
- Per eseguire la macchiatura di immunohistochemical, ottenere un kit e l'anticorpo primario dall'elenco materiali e seguire le specifiche del produttore.
5. immunofluorescenza colorazione di FFPE e sezionato Organoids
- Raccogliere le forniture: scivolo al forno dal passaggio 4, xilene, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, acqua deionizzata (DI H2O), coplin vasetti, 1x salino di antigene recupero soluzione tampone citrato di sodio, o tampone Tris-EDTA, tampone fosfato (PBS), 5% cavallo normale del siero ( NHS) con un detergente non ionico 0.1% in PBS, 1% di albumina di siero bovino (BSA) con un detergente non ionico 0,3% in PBS, rack di colorazione, colorazione, decloaking camera, barriera idrofoba penna, camera umida, 1 ° e gli anticorpi di 2 ° di interesse e citoplasmiche di interesse.
- Deparaffinizzare e reidratare le diapositive immergendo in coplins riempito con le seguenti soluzioni: xilene (3 salse, 5 minuti ciascuno), 100% EtOH (2 tuffi, 3 min ciascuna), 95% EtOH (2 tuffi, 3 min ciascuna), 70% EtOH (2 tuffi, 3 min ciascuna) e DI H2O (2 DIP 3 min. ciascuno).
- Riempire il piatto di colorazione con soluzione di smascheramento dell'antigene e cipollotto camera di preriscaldamento a 100 ° C.
- Eseguire il ricupero dell'antigene immergendo diapositive nel piatto colorazione pre-riscaldato e incubare per 5 – 10 min a 100 ° C. Una volta che il ciclo è completo, fare la camera cipollotto riposare per 20 min prima di aprire il coperchio.
- Una volta che il piatto di diapositiva si è raffreddata a RT, mettere il piatto colorazione sotto corrente DI H2O per sciacquare i vetrini per 5 min.
- Rimuovere le diapositive dal piatto colorazione, disegnare un cerchio intorno al campione con una penna di barriera idrofoba e posare la diapositiva sulla camera di umidità.
- Bloccare qualsiasi anticorpo specifico non colorazione applicando NHS 5% con un detergente non ionico 0.1% in PBS al cerchio idrofobo intorno al campione (circa 30 μL è necessario per coprire il campione).
- Lavare in coplins riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere gli anticorpi 1° (Tabella materiali) diluiti in 1% BSA con un detergente non ionico 0,3% in PBS per idrofobo cerchio intorno al campione (circa 30 μL dovrebbe coprire la sezione), quindi incubare per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C in camera umida.
- Lavare i vetrini in coplins riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere l'anticorpo 2° diluito in 1% BSA con un detergente non ionico 0,3% in PBS per idrofobo cerchio intorno al campione (circa 30 μL coprirà l'area), quindi incubare per 1h a RT in camera umida.
- Lavare i vetrini coplin riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere DAPI, diluito alle specifiche del produttore, in BSA 1% con un detergente non ionico 0,3% in PBS per idrofobo cerchio intorno al campione, quindi incubare per 2 – 5 min a temperatura ambiente al buio (30 μL).
- Lavare i vetrini in coplins riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Montare i vetrini con mezzi di montaggio antifade e vetrino coprioggetto, quindi visualizzare i risultati sotto un microscopio.
6. tutto-montaggio dei Organoids per la macchiatura immunofluorescente
- Raccogliere le forniture: camera diapositiva o piatto confocale, tampone fosfato salino (PBS), fissativo, 50mm NH4Cl in PBS, il detergente non ionico 0.1% in PBS, NHS 5% con un detergente non ionico 0.1% in PBS, BSA 1% con un detergente non ionico 0,3% in PBS, 1 ° e 2 ° anticorpi di interesse e citoplasmiche di interesse.
- Rimuovere con attenzione tanto mezzi possibili senza interrompere la cultura organoid pipettando contro il lato del pozzo, lasciando spazio tra media e matrice di gel.
- Utilizzando un profilato, pre-bagnato con supporti o PBS, punta della pipetta 1.000 μL, redigere una goccia (25 – 50 µ l) di gel "matrix" che contiene il organoid(s) di interesse ed erogare in mezzo di un piatto ben o confocale camera di diapositiva.
Nota: il 33% matrice gel non è un solido. È un liquido gelatinoso che gestisce simile a una gelatina che completamente non è impostata. Un puntale di profilati con una grande apertura impedirà organoids rottura durante i trasferimenti. - Se organoids rimangono nella cultura genitore, sostituire il supporto con supporti basati su KSFM caldi.
- Con l'occhio nudo o ambito di dissezione, aspirare il gel in eccesso di media e matrice dalla diapositiva camera con una pipetta di multa-punta (10 – 200 μL).
Nota: È facoltativo pretrattare la diapositiva di camera con un reagente di aderenza. - Piastra di un volume uguale di gel "matrix" in un pozzo vuoto della diapositiva camera come un controllo facoltativo osservare autofluorescenza della matrice avanzi.
- Porre il vetrino di alloggiamento in un incubatore a 37 ° C per 30 – 45 min promuovere il organoid per aderire al vetro e prevenire la perdita dei campioni durante le fasi di lavaggio.
- Pipettare lentamente per evitare il distacco dalla diapositiva, lavare organoids con 200 µ l di PBS 1X per 5 min a RT agitando delicatamente.
- Rimuovere il 1X PBS e correzione con 200 μL di paraformaldeide al 4% per 30 min a RT agitando delicatamente. Assicurarsi che il gel "matrix" appare chiaro dopo questo passaggio.
Nota: Sono possibili anche metanolo o formalina fissazione. Metodo di fissazione deve essere ottimizzato per gli anticorpi specifici come certi metodi di fissazione possono crosslink gli antigeni di interesse o placare fluorescenti-etichettatura-proteine di interesse. - Rimuovere il fissativo e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.
Nota: La lunghezza delle fasi di lavaggio deve essere ottimizzata in base alla taglia organoid. Cinque minuti è un punto di partenza sufficiente, ma la fase di lavaggio può essere allungata come necessario. - Placare la autofluorescenza con 200 μL di 50mm NH4Cl in 1X PBS per 30 min a RT agitando delicatamente.
Nota: Questo passaggio sarà placare autofluorescence da detriti nel lume della organoid e dall'espressione della proteina fluorescente (ad esempio di GFP) che può presentare da disegno sperimentale. Dovrebbe essere inclusa se desidera utilizzare un fluoroforo nel canale 488 ma possono essere ignorato se si desidera conservare segnale GFP. - NH4Cl di rimuovere e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.
- Permeabilize organoids in 200 μL di 0,1% detergente non ionico-100 in PBS 1X per 30 min a RT agitando delicatamente.
- Rimuovere il detersivo-100 non ionici 0.1% in 1X PBS e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.
- Bloccare con 5% NHS con 200 μL di 0,1% detergente non ionico X-100 in PBS e incubare per 60 min a RT agitando delicatamente.
- Rimuovere il tampone bloccante e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.
- Diluire l'anticorpo 1° in 1% BSA con 0.3% Triton X-100 in PBS 1X e aggiungere 200 μL della diapositiva camera, quindi incubare per 1-3 giorni a 4 ° C.
- Rimuovere l'anticorpo di 1° e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.
- Diluire l'anticorpo 2° in 1% BSA con 0.3% Triton X-100 in PBS 1X e aggiungere 200 μL della diapositiva camera, quindi incubare per 1-3 giorni a 4 ° C al buio.
Nota: La lunghezza dei tempi di incubazione dovrebbe essere ottimizzata per l'anticorpo e dimensione organoid. Alcuni richiederanno più tempo per penetrare attraverso la organoid. Concentrazione di anticorpi dovrà anche essere ottimizzato. In generale, 2 x la concentrazione usata per le sezioni FFPE è appropriata per gli anticorpi 1° e la stessa concentrazione per sezioni FFPE è appropriata per gli anticorpi di 2°. - Rimuovere l'anticorpo di 2° e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.
- Colorante di contrasto l'actina con falloidina ed il nucleo con DAPI o Hoescht, diluito secondo le raccomandazioni del produttore in 1% BSA con 0.3% Triton-X in PBS 1X. Aggiungere 200 μL a camera diapositiva, quindi incubare a + RT 40 min al buio.
- Montare in 200 μL di fresco 1X PBS o mezzi di montaggio ed immagine immediatamente (fluorescenza deve essere conservato per fino a 5 giorni, se non di più). Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3.
Nota: Sodio azide può essere aggiunto ai campioni per prevenire la contaminazione se imaging confocale non è prontamente disponibile. Aggiunta di un agente di compensazione può migliorare la formazione immagine.
7. intero-montaggio dei Organoids per saggi e sonde fluorescenti
Nota: Ci sono commercialmente disponibili saggi e sonde fluorescenti (esempi sono inclusi nell'elenco materiali) modificabili per l'utilizzo su organoids montato insieme ad osservare una varietà di utili endpoint19. Il seguente protocollo è per il kit di proliferazione di EdU fluorescente etichettati, tuttavia qualsiasi kit può essere modificato per l'utilizzo con un campione di tutto-montato.
- 50 μL di media di rimuovere con cautela e sostituire con 50 μL di 20 μM 2 x EdU soluzione di lavoro pipettando contro il lato del pozzo, lasciando spazio tra media e matrice di gel.
- Incubare a 4 ° C per 1-3 giorni (il periodo desiderato per l'incorporazione di EdU dovrebbe essere ottimizzato per tipo di cella di scelta).
- Seguire i passaggi 6.2 – 6,8 per trasferire il organoids di interesse su una diapositiva di camera o piatto confocale.
- Rimuovere PBS e difficoltà con 200 μL di 3,7% paraformaldeide per 30 min a RT agitando delicatamente. Assicurarsi che la matrice gel appaiono chiare dopo questo passaggio.
- Rimuovere il fissativo e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Rimuovere PBS e aggiungere 200 μL di 0,5% detergente non ionico-100 in PBS 1X per 30 min a RT agitando delicatamente.
- Preparare un 1x fluorescente reazione cocktail secondo le specifiche del produttore.
- 0,5% detergente non ionico-100 di rimuovere e lavare due volte con 200 μL di 3% BSA in PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.
- Aggiungere cocktail di reazione ed incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.
- Rimuovere la reazione fluorescente cocktail e lavare una volta con 200 μL di 3% BSA in PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Colorante di contrasto e Monte seguendo i passaggi 6.21 – 6,22 (Figura 3D).
Representative Results
Su coltura riuscita dei organoids della prostata primaria umana, morfologia e differenziazione può essere valutate utilizzando analisi delle immagini in campo chiaro e FFPE e tecniche di colorazione del intero-monta.
Il processo di acquisizione di immagini di campo chiaro è illustrato in Figura 1A. Organoids sono cresciuta in una matrice 3D e disperse attraverso diversi piani focali. Per osservare organoids a fuoco attraverso molti aerei, si consiglia di utilizzare un'immagine EDF (Figura 1B, destra) anziché un singolo piano z (Figura 1B, sinistra). In laboratorio, organoids coltivate in condizioni sperimentali diverse può provocare cambiamenti nella morfologia. Utilizzando area, circolarità (definito da come il organoid è simile a un cerchio) e raggio di max/min (misura di lunghezza) dare agli utenti un'indicazione di forma e dimensioni organoid e fornire una lettura quantificabile della morfologia. Per sottolineare l'utilità di queste misure, immagini rappresentative dei organoids con area simile ma differente morfologia sono mostrati in Figura 1, in cui una lunga organoid sarà meno circolare e hanno un più grande rapporto di massimo/minimo rispetto uno sferico organoid.
L'incorporamento di organoids per l'istologia è un endpoint utile per osservare l'interno di campioni e garantire che la necrosi non è presente all'interno del nucleo di un organoid. Un flusso di lavoro per questo processo e risultati rappresentativi dei campioni non macchiati, sezionati con un microscopio a campo chiaro sono forniti in Figura 2AB, C. Figura 3A Mostra un organoid maltrattato (a sinistra) rispetto al correttamente consegnato organoids in Figura 3A (a destra) e Figura 3B. Per determinare lo stato di differenziazione del campione, si consiglia di guardare delle cellule basali marcatori (citocheratina 5 e p63)8 insieme a luminal delle cellule marcatori (citocheratina 8)8. Se si desidera macchia organoids in situ, intero-monta la macchiatura è una conveniente alternativa, e questi risultati rappresentativi sono forniti in Figura 3D.
Figura 1: valutazione della morfologia dei organoids nella cultura 3D. (A) immagine raccolta e la compressione del flusso di lavoro per umano primario della prostata organoids acquisita da una luce trasmessa invertito microscopio con un motorizzato X / Y stage e compagno software di scansione. (B) immagini rappresentative di un singolo z-stack (sinistra) vs. un'immagine EDF (a destra) di un campione di tutto-bene di umano primario organoids della prostata, mostrando che altre organoids sono a fuoco quando più z-stack sono combinati in una singola immagine proiettata (scala bar = 1000 µm). (C) immagini rappresentative per zona, circolarità e max/min rapporto di morfologicamente dissimili umano organoids primario della prostata che hanno la stessa area (barra della scala = 200 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Organoid incorporamento di flusso di lavoro e rappresentante risultati di sezionamento. (A) umano primario della prostata organoid incorporamento del flusso di lavoro. (B) immagine rappresentativa di una diapositiva non colorata, fresca contenenti umano primario della prostata organoids sotto un microscopio a campo chiaro raffigurante agar (freccia verde), gel di istologia (freccia nera), bolla (freccia blu), organoids (frecce rosse) (scala bar = 1000 µ m). (C) senza macchia appena tagliata diapositiva (a sinistra) vs. non macchia scorrevole asciutto (a destra), organoids (frecce rosse) appaiono traslucido quando asciutto (barra della scala = 500 µm) e sono più difficili da discernere sotto un microscopio a campo chiaro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: macchiatura istologici su organoids sezionato e montato tutto. (A) H & E colorazione di un rotto umano organoid primario della prostata dal maltrattamento (pipettaggio aggressivo, protocollo di trattamento sbagliato, a sinistra) accanto a un ben gestito organoid (a destra) (barra della scala = 100 µm). (B) umano primario organoid della prostata che è stato fissato in formalina, paraffina, sezionati e colorato con basale cytokeratin 5 o luminal cytokeratin 8 (in alto) o basale p63 e luminal cytokeratin 8 (in basso) e ripreso con microscopio confocale ( barra della scala = 100 µm). (C) un intero-montato umano primario della prostata organoid macchiato con il cytokeratin basale 5 o luminal cytokeratin 8 e controcolorati con falloidina e DAPI, imaged con microscopio confocale (barra della scala = 100 µm). (D) un intero-montato umano primario delle cellule della prostata organoid macchiato con fluorescente etichettati EdU e contatore macchiato con Hoescht, imaged con microscopio confocale (barra della scala = 500 µm) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Coltura organotypic è un eccitante nuovo metodo per ricapitolare il tessuto con la comodità di un ambiente in vitro . Attualmente, laboratori crescono organoids da molti tipi di tessuti per vari endpoint. I metodi descritti in questa carta riassumono gli endpoint utili ed evidenziare nuove tecniche per caratterizzare completamente culture 3D primario delle cellule della prostata.
Ci sono una varietà di ricette di media per la coltivazione delle cellule della prostata primaria umana organoids5,6,13. Mentre tutti ottenere risultati comparabili e praticabile, supporti basati su KSFM13 utilizza additivi minimi così è descritto qui. Inoltre, i lavori sono stati pubblicati utilizzando concentrazioni multiple per gel "matrix", dal 10% al 75% al cultura della prostata organoids5,6,13. Perché il gel "matrix" è un reagente costoso, e 33% gel "matrix" ha dimostrato di essere sufficiente per coltivare a lungo termine (2-3 settimane), organoids valida, unclumped13, questa è la concentrazione consigliata. Tuttavia, il gel "matrix" può variare in concentrazione proteica tra numeri di lotto, quindi questo dovrebbe essere preso in considerazione quando placcatura. Si consiglia inoltre di acquistare gel "matrix" in massa per l'utilizzo attraverso esperimenti multipli per ridurre l'incoerenza tra i lotti. Altri laboratori hanno pubblicato diversi formati per la placcatura di gel "matrix", come le goccioline invece di rivestimento una piastra a 96 pozzetti ben5. Entrambi i metodi formano organoids praticabile, ma il formato descritto qui permette affinchè le cellule piastrate più scarsamente, che ha dimostrato di promuovere l'espansione delle cellule in più grandi organoids13. Tuttavia, placcatura densità deve essere ottimizzato in base al largo efficienza di formazione di paziente-specifici. Matrice gel è disponibile in molti formati tra cui il fattore di crescita-ridotto, privo di rosso fenolo, ad alta concentrazione, ecc. Fattore di crescita-ridotto è raccomandato per definite condizioni di coltura e privo di rosso fenolo è consigliato quando si lavora con le cellule che esprimono GFP o in esperimenti che comportano l'acquisizione di immagini di z-stack. È fondamentale che qualsiasi procedura di placcatura gel matrice essere eseguita con reagenti ghiacciati, come gel "matrix" si solidifica rapidamente a temperatura ambiente.
Organoids coltivate in diversi trattamenti sperimentali possono provocare i cambiamenti alla forma, così luminoso-campo imaging è ampiamente utilizzato per studiare i fenotipi morfologici osservati. Tuttavia, la registrazione e quantificare la zona o la forma è una sfida per due motivi: bias di selezione 1) durante l'acquisizione di immagini e 2) applicando un parametro bidimensionale come zona ad un campione tridimensionale. Una strategia di acquisizione di immagini consiste nel registrare un campo casuale e misurare un numero predeterminato di organoids in quel campo, ma questo può creare bias durante la selezione, e tutte le organoids nel campo selezionato potrebbe non essere a fuoco. Formazione immagine di intero-ben ottimizzata per il formato micropiastra a 96 pozzetti Elimina questo bias di campionamento raccogliendo la popolazione intera organoid di interesse. Tuttavia, a seconda degli obiettivi del microscopio su mano, più campi potrebbero essere necessario essere raccolti e piastrellati al fine di ottenere un'immagine di intero-pozzo. Alcuni laboratori sono descritti da un singolo piano z12dell'area di misura, ma per catturare tutte le organoids a fuoco, si consiglia di raccogliere e impilare piani multipli in un singolo EDF-immagine13. In alcuni casi, un menisco nel gel matrice potrebbe causare vignettatura dell'immagine, e metodi di correzione del fondo potrebbero essere necessario essere applicato utilizzando software di analisi di immagine. Volume esatto è idealmente la misura più appropriata per dimensione organoid; Tuttavia, questo è difficile da ottenere con precisione, anche con immagini multiple di z-stack. Altre dimensioni morfologiche utili, come circolarità e rapporto di massima/minima, possono essere facilmente calcolati da tutti i organoids in un'immagine EDF di tutto-bene. Insieme, questi metodi superare sfide bias di campionamento e consentono una misurazione dei parametri 2D da oggetti 3D in uno spazio 3D.
Fissazione in formalina e inclusione in paraffina dei organoids è un metodo comune per ottenere ematossilina ed eosina (H & E), immunoistochimica (IHC) e macchiatura immunofluorescente (IF) per la visualizzazione e l'analisi6,11, 20. Tuttavia, le pubblicazioni che hanno descritto questa tecnica mancano completi dettagli sul processo di incorporamento. Inoltre, l'individuazione di organoids all'interno del blocco di paraffina può essere impegnativo. Alcuni laboratori pre-macchiano organoids con trypan blu prima di incorporare agli aiuti in posizione durante il sezionamento11. Il metodo qui descritto incorpora l'uso di un colorante istologico per orientamento del gelplug organoid/istologia durante l'incorporamento per promuovere l'efficienza di taglio. Diapositive di H & E facilitano l'esame di necrosi, la struttura nucleare e proliferazione, e deve quindi essere un endpoint obbligatorio per organoid cultura per garantire che le cellule sono sane per la sfera. Un punto di forza della cultura organoid è che i campioni sono costituiti da una miscela eterogenea di cellule che assomigliano meglio nel vivo tessuto del paziente. Nella prostata, ad esempio, sia cellule basali di Luminale sono presenti in organoids della prostata5, mentre le cellule coltivate in 2D mancanza luminal differenziazione8. Per valutare la differenziazione organoid, è consigliabile che i ricercatori valutano basali marcatori quali CK5 e p63 e luminal come recettori per gli androgeni e CK88. Eventuali altre proteine sperimentale di interesse possono essere studiate anche utilizzando queste tecniche di colorazione.
Sebbene FFPE sezioni consentono la visualizzazione delle cellule residenti nel compartimento interno via istologica metodi (H & E, se, IHC), immagini sono limitati a sezioni trasversali e organoid forma può essere modificato tramite il processo di incorporamento. Intero-monta la macchiatura consente un organoid essere macchiato e osservato in situ, preservando fenotipi morfologici e permettendo immagini di localizzazione della proteina. Intero-montaggio è uno strumento utilizzato per colorare campioni del intero-tessuto o intero-animale, come l'embrione di pesce zebra o il mouse e si adatta facilmente per organoids. La tecnica qui descritta è stata modificata dalla procedura da Mahéet al. 11, che dettagli la crescita iniziale e la cultura dei organoids gastrointestinale direttamente in una diapositiva di alloggiamento per la colorazione e richiede la fissazione della cultura intera genitore. Il metodo descritto qui comporta il trasferimento di un singolo organoid (o organoids) di interesse in una diapositiva di camera al momento della colorazione. Questo consente la selezione di singoli organoids per analisi di intero-monta in un esperimento in corso senza fissazione della cultura padre. Quando si esegue intero-monta colorazione, è necessario ottimizzare la permeabilizzazione e il tempo di incubazione per anticorpi primari e secondari garantire la penetrazione in tutto il campione (ovunque da uno o più giorni è consigliato). Una volta ripreso tramite microscopia confocale, rendering 3D può essere prodotto per attivare la visualizzazione e la localizzazione di una proteina specifica e calcolare il numero di cellule positivamente marcate presenti in un campione. Citometria a flusso è un endpoint utile quantificare popolazioni di basale, luminal, o cellule staminali5,14. Per effettuare questa operazione, le cellule sono recuperate dal gel matrix e delicatamente dissociate per la colorazione. Gli utenti devono selezionare attentamente gli indicatori appropriati per separazione sulla base della letteratura attuale. Per cellule epiteliali prostatiche primarie umane, CD26 e CD49f sono marcatori adatti luminal e basali, rispettivamente5,21.
In sintesi, questo protocollo dettagli sperimentali endpoint, raccolta e crescita umano primario della prostata organoid. Da notare, la tecnica di montaggio descritta può applicarsi ad una varietà di altri saggi che sono normalmente impiegate per celle 2D, ad esempio fluorescente esperimenti basati su sonda guardando19di proliferazione, apoptosi e macchie organello subcellulare. Inoltre, il metodo di raccolta e dissociazione qui descritto potrebbe essere utilizzato in preparazione per cella singola sequenziamento del RNA,18. Collettivamente, questo dimostra la possibilità per una varietà di romanzo, gli endpoint di alta fedeltà che i ricercatori in grado di ottimizzare ed esplorare in futuro.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri UIC Biorespository, Dr. Klara Vályi-Nagy e Alex Susma, come pure gli urologi, DRS. Michael Abern, Daniel Moreira e Simone Crivallero, per la facilitazione dell'acquisizione di tessuto per le colture cellulari primarie. Ringraziamo i pazienti UIC urologia per donare loro tessuto alla ricerca. Questo lavoro è stato finanziato, in parte, il dipartimento della difesa prostata cancro ricerca programma salute disparità Idea Award PC121923 (Nonn) e il centro di UIC per la clinica e scienze della traduzione corso formazione per scienziati traslazionale e clinica ( Gli aspetti) programma (McCray e Richards) e il National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant numeri U54CA202995, U54CA202997 e U54CA203000, conosciuto come il Chicago Health Equity collaborativo (Nonn e Richards). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health o il dipartimento della difesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
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