Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Håndtering og vurdering af menneskers primære prostata Organoid kultur

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/59051
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Departments of Urology, Physiology, and Biophysics, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at lede menneskers primære prostata organoid håndtering så foreslår slutpunkter for at vurdere fænotype. Såning, kultur vedligeholdelse, recovery fra matrix gel, er morfologiske kvantificering, integrering og skæring, FFPE skæring, hele-mount farvning og anvendelse af kommercielle assays beskrevet.

Abstract

Dette papir beskriver en detaljeret protokol for tre-dimensionelle (3D) dyrkning, håndtering og vurdering af menneskers primære prostata organoids. Processen indebærer, såning af epitelceller tyndt i en 3D matrix gel på en 96-brønd mikrotiterplade med medieændringer at dyrke ekspansion i organoids. Morfologi vurderes derefter af hele-godt indfange af z-stak billeder. Komprimering af z-stakke skaber et enkelt i-fokus billede hvorfra organoids er målt til at kvantificere en række udgange, herunder cirkularitet, rundhed og område. DNA, RNA og protein kan indsamles fra organoids inddrives fra matrix gel. Cellepopulationer af interesse kan vurderes ved organoid dissociation og flow flowcytometri. Formalin-fiksering-paraffin-embedding (FFPE) efterfulgt af skæring bruges til histologisk vurdering og antistoffarvning. Hele-mount immunfluorescent farvning bevarer organoid morfologi og letter observation af protein lokalisering i organoids i stedet. Kommercielle assays, der traditionelt bruges til 2D éncellelag celler kan ændres for 3D organoids. Bruges sammen, giver teknikkerne i denne protokol en robust værktøjskasse for at kvantificere prostata organoid vækst, morfologiske kendetegn og udtryk for differentiering markører.

Introduction

Organoids er et værdifuldt redskab til at studere organogenesis og sygdom. De giver et billigere alternativ til dyre modeller, og patienten-afledte organoids udvikler sig som en strategi for personlig medicin1,2,3. Dette tre-dimensionelle (3D) kultur system indebærer såning stilk eller stamfader celler (høstet fra væv eller induceret pluripotente stamceller) i en gel af ekstracellulære matrix komponenter (matrix gel)4. Cellerne formere sig og differentiere, hvilket resulterer i organotypic strukturer, at sammenfatte de cellulære hierarki og morfologi af orgel af interesses funktionel enhed. Organoids er dyrket ved hjælp af celler med oprindelse fra en række forskellige organer, herunder spytkirtel, maven, tarmen, leveren, prostata, lunge og hjerne4. Selvom der er talrige protokoller der beskriver trin for at oprette prostata organoids5,6, er det udfordrende at finder tilstrækkeligt detaljerede metoder til at opnå kvantitative slutpunkter fra organoids. Dette papir opsummerer metoder udviklet for menneskers primære prostata celler og detaljer en række foreslåede slutpunkter til at vurdere organoid fænotyper. Disse teknikker var optimeret til prostata organoids og kan anvendes til andre 3D cellekulturer.

Prostata organoid kulturer har for nylig vist sig som en værdifuld in vitro- model, der mangler begrænsningerne af éncellelag kulturer ved hjælp af etableret udødeliggjort cellelinjer. Benign prostata epitel og prostatakræft er udfordrende at model i vitro bruger udødeliggjort cellelinjer. Antallet af godartede cellelinjer er begrænset, og alle har gennemgået forvandling med onkogener7. Primære prostata epitelceller i encellelag ikke differentiere i luminale celler og mangler androgen receptorer8. Fleste af prostata cancer cellelinjer har ikke funktionelle androgenreceptorer, en betydelig mægler tidlig sygdom, og mangel på vigtige genetiske ændringer, der er blevet fundet i patient tumorer9. Prostata organoid kulturer kan dyrkes nemt fra godartede epitel og er værdifulde i at studere egenskaber for stamceller, stamceller, differentiering og virkningerne af eksperimentelle ændringer i mikromiljø4,5. Prostata cancer organoids kan dyrkes som en del af et præcisionsindflyvning medicin til modellering patientens sygdom og svar på terapier10.

Denne protokol er blevet kompileret fra eksisterende protokoller, der bruger forskellige celletyper, men det her er optimeret til brug i menneskelige primære prostata celler. Det komplimenter protokoller skitseret af Sawyers, Clevers og Shen5,6 , der beskriver vækst, passaging, lysfelt imaging, kryopræservering, og RNA og DNA isolation af prostata mus og menneskelige organoids. Hele-mount-protokollen er ændret fra Mahé et al. 11, der brugte gastrointestinale epitelial organoids og beskriver live imaging og frosne og paraffin indlejring. Borten et al. 12 beskrevne analyse af bryst, kolon og kolorektal cancer organoid morfologi fra lysfelt billeddannelse. Derudover Richards mfl. 13 anvendes en metode til morfologiske vurdering af prostata organoids. Endelig, Hu et al. 14 beskrevet en metode af vedhængende prostata organoids til et kammer dias natten før immunfluorescent farvning for at observere enkelt celler og spredning af kugler til flow flowcytometri analyse.

Målet med denne protokol er at påvise tilstrækkelig detaljeret disse teknisk udfordrende metoder som én protokol, herunder celle såning; medier og matrix gel vedligeholdelse; samling af celler til flowcytometri; RNA, DNA og protein udvinding; morfologiske vurdering fra lysfelt z-stakken analyse; indlejring, forarbejdning og skæring for histologiske farvning; og hele-montering til immunofluorescens eller fluorescerende sonde assays. Biologisk relevans og fortolkning af disse forskellige slutpunkter varierer blandt eksperimentelle design og antistoffer bruges til analyseformål. Gennem udnyttelse af denne protokol, bør brugere føler sig parat til at oprette et eksperiment med en værktøjskasse af slutpunkter.

Menneskelige primære prostata (PrE) epitelceller blev etableret i laboratoriet af protokollen beskrevet af Peehl15,16 og vedligeholdes således, at et begrænset antal passager (op til fire) som tidligere beskrevet17, men de er også tilgængelig fra kommercielle leverandører. Hepatocyt serumfrit mediebaseret6, KSFM-baserede13og R-spondin 1-aircondition5 medier offentliggøres alle som har med succes produceret organoids. KSFM-baserede kræver færrest mulige tilsætningsstoffer, så det er beskrevet her.

Protocol

Følgende protokol var optimeret ved hjælp af menneskelige primære prostata epitelceller høstet fra patient væv på University of Illinois at Chicago Hospital. Alle humane væv bruges til disse eksperimenter var erhvervet via en institutionel Review Board-godkendt protokollen og/eller fritagelse på University of Illinois i Chicago. Mens dyrkningsbetingelserne vil variere afhængigt af hvilken celle interesse, kan organoids af andre væv påføres slutpunkterne.

1. såning af epitelceller i Matrix Gel og medieskift

  1. Indsamler nødvendige materialer: menneskelige primære prostata epitelceller (PrE), matrix gel på is, 96-brønd mikrotiterplade, keratinocytter serum-gratis medier (KSFM) på is, trækul strippet føtal bovint serum (FBS) og dihydrotestosteron (DHT).
  2. Forberede KSFM-baseret organoid medier ved at kombinere 47,5 mL af KSFM med 2,5 mL af trækul strippet FBS og dihydrotestosteron (DHT) til en slutkoncentration på 10 nM DHT, så reserven på is.
  3. Plade celler ind i en 3D matrix i en celle kultur hætte med steril teknik.
    1. Forsigtigt mix kolde KSFM-baseret organoid medier med iskold matrix gel til at opnå en 50% matrix gel blanding af langsomt pipettering op og ned, at undgå boblerne.
      Bemærk: Matrix gel bør optøet natten over ved 4 ° C og opbevares på is, når det er muligt. Det størkner hurtigt ved stuetemperatur (RT).
    2. Pre våd en pipette tip i kolde medier og overførsel 40 – 50 μL af 50% matrix gel på bunden af hver brønd skal bruges på en 96-brønd plade. Frakke i bunden af brønden til at danne en base lag.
      Bemærk: Ikke fuldt give afkald til det andet stop på pipette, da dette kan skabe bobler.
    3. 96-brønd pladen anbringes i 37 ° C inkubator for 30-45 min til at størkne basislaget.
      Bemærk: Ikke plade epitelceller på basislaget, indtil det er størknet, eller celler kan falde igennem matrix på bunden af pladen og vokse som en éncellelag.
    4. Bland epitelceller suspenderet i KSFM-baseret organoid medier med matrix gel til at opnå en endelig koncentration på 100-1000 celler/100 μL og 33% matrix gel. Plade epitelceller på toppen af basen lag ved hjælp af 100 μL af 33% matrix gel/celle blanding pr. brønd.
      Bemærk: Tidligere forsøg har vist at såning epitelceller for tæt i 3D vil begrænse størrelsen af organoid vækst, mens såning for tyndt kan resultere i meget lavt udbytte13. Det er vigtigt at optimere seeding betingelser for celletype af interesse, baseret på patient-specifikke organoid dannelse effektivitet.
  4. 96-brønd pladen anbringes i et 37 ° C inkubator for 30-45 min til at tillade matrix gel til at størkne, derefter forsigtigt Tilsæt 100 μL af KSFM-baseret organoid medier oven på celler af pipettering langsomt mod kanten af brønden.
  5. Ændre medierne hver 2-3 dage. Pipettering mod siden af brønden med plads mellem medier og matrix gel, forsigtigt fjerne 50 μL af medier og erstatte med 50 μL af friske medier.
    Bemærk: For en langsigtet, matrix gel savn at blive forandrede hver 2-3 uger. Hvis matrix gel kultur vises ustabil og viser gennemskinnelige rynker under mikroskop, derefter matrix gel er gået i stykker og skal udskiftes.

2. samling af Organoids fra Matrix Gel

Bemærk: Samling af organoids er nødvendigt for matrix gel ændringer, passaging eller slutpunkter RNA udtræk, DNA-ekstraktion, protein udvinding og flowcytometri.

  1. Varm neutral protease og Hanks' afbalanceret saltopløsning (HBSS) i et 37 ° C vandbad.
  2. Forsigtigt fjerne medier fra brønde uden at forstyrre matrix gel.
  3. Tilsæt ~ 200 μl neutral protease til hver brønd med en ~ 1:2 forholdet mellem matrix gel: neutral protease og Inkuber i 20 min ved 37 ° C.
  4. Mekanisk adskille matrix gel: neutral protease blanding af pipettering op og ned.
  5. Inkuber i 20 min ved 37 ° C.
  6. Overføre neutral protease-matrix gel-celle blanding til en microcentrifuge tube eller koniske rør, afhængigt af mængden. Der centrifugeres ved 300 x g i 3-5 min at sammenpresse cellerne.
    Bemærk: Hvis ingen celle pellet vises, matrix gel kan ikke adskilles fuldstændigt og kan visualiseres som en gennemskinnelig fase i bunden af røret adskiller sig fra den lyserøde supernatanten. Fjern supernatanten og tilføje mere neutral protease i forholdet 1:2 til matrix gel pellet, inkuberes i en anden 20-40 minutter ved 37 ° C og Gentag centrifugering ved 300 x g.
  7. Når en organoid pellet er erhvervet, Fjern supernatanten. Fortsætte med passaging (Se trin 2.7.1), organoid lysis for RNA, DNA eller protein ekstraktion (Se trin 2.7.2), forarbejdning enkelt celler ved flowcytometri, og encellede sekventering (Se trin 2.7.3).
    1. Til langtidskulturer, forsigtigt resuspend intakt organoids i 33% frisk matrix gel og pladen ved at følge trin, der beskrives i trin 1.1-1.5. For at adskille organoids og replate som enkelt celler, resuspenderes i 1 mL varm celle-dissociation enzymer og inkuberes ved 37 ° C i 10-15 min., vask en gang med 5 mL af HBSS, og ny plade i den friske matrix gel efter trin 1.1-1.5.
    2. Resuspenderes organoid i en passende lysisbuffer for RNA udvinding, DNA-ekstraktion eller protein udvinding som anført i Tabel af materialer og følg producentens protokol.
    3. Resuspend organoids i 1 mL varm celle-dissociation enzymer og inkuberes ved 37 ° C i 10-15 min at adskille organoids i enkelte celler. Vask en gang med 5 mL af HBSS og fortsætte med protokollen for flow flowcytometri5 eller encellede sekventering18.
      Bemærk: For at tage afstand til enkelt celler ved lave koncentrationer af matrix gel, den neutrale protease kan ikke være nødvendig, og celle-dissociation enzymer kan anvendes direkte til brønden efter trin 2.2.

3. hele-godt billede erhvervelse og analyse af Organoid morfologi

  1. Erhverve hele-godt z-stak billeder ved hjælp af en overførte inverteret lysmikroskop med en motoriseret X / Y scanning fase (workflow illustreret i figur 1A).
    1. Med fokale position justeres til bunden af brønden, begynde at fokusere opad indtil den første organoid, som vil være i centrum for godt på grund af menisk fra basislaget. Sæt bunden z-plan på denne holdning.
    2. Fortsat fokusere opad indtil den sidste organoid er i fokus, som vil være i periferien af brønden. Sæt de øverste z-plan på denne holdning.
      Bemærk: Efter indstilling af toppen og bunden af z-stack, sikre, at disse holdninger fange organoids inden for alle resterende brønde og justere top/bund efter behov. Dette giver mulighed for i z-området skal anvendes til en enkelt scanning, der omfatter alle organoid inden for hver brønd.
    3. Fange 15 – 35 z-fly pr. brønd, ved hjælp af et større antal for højere opløsning. Fange det hele godt billede, flette og indsamle kvadranter eller underafdeling, hvis det er nødvendigt.
      Bemærk: Det anbefales at tage flere z-fly i stedet for en enkelt z-fly, som illustreret i figur 1B , hvor organoids er ude af fokus, når du optager kun en z-plan.
    4. Gemme z-stak billeder for downstream analyse.
  2. Analysere billeder ved hjælp af billede software med freeform Tegnefunktioner.
    1. Åbn en enkelt z-plane billede fra trin 3.1.4.
    2. Hvis det er nødvendigt, flise billeder taget på hver enkelt z-fly i en enkelt, hele-godt billede. Gem den nye image som en separat fil. Gentag denne proces for hver z-flyet erhvervet.
    3. Brug image software, åbne det hele-godt billede for hver z-flyet fra en enkelt brønd og skabe en udvidet dybde af felt (EUF) billede fra stakken af z-fly.
      Bemærk: Denne type billede vil vælge den bedste fokus område, hver z-plan at oprette et enkelt i-fokus billede af brønden.
    4. Angive pixel omfanget af softwaren til det billede, der måles skalalinjen.
    5. Værktøjet Kombinationstegning tegning af image software, trace omkredsen af hver organoid i brønden.
    6. Få måling målinger for røbestof organoid bander fra image software.
      Bemærk: Anbefalede parametre er område, cirkularitet og maksimum/minimum radius ratio. Repræsentative resultater illustrerer anvendelsen af disse målinger er vist i figur 1 c. Området er beregnet ud fra polygonen defineret af organoid's perimeter. Cirkularitet er forholdet område af organoid at arealet af en cirkel med en diameter svarende til organoid maksimale ilder, hvor 0 er mindre cirkulære og 1 er mere cirkulære. Maksimum/minimum radius ratio er forholdet mellem den maksimale radius og minimum radius af den vektoriserede organoid.
      Cirkularitet =Equation 1
      Radius ratio =Equation 2

4. formalin fiksering og Paraffin integrering af Organoids for histologiske slutpunkter

  1. Forberede indlejring forsyninger: HBSS, 2% agar løsning, histologiske mærkning farvestof, histologi gel, afpipetteres tip skimmel, tape, stemplet fra en 1 cc insulin sprøjte, ispose, kassetter, 10% neutrale bufferet formalin (NBF), blyant, og 75% histologiske grade ethanol (EtOH).
    1. Forbered to microcentrifuge rør af 2% agar løsning. Der inkuberes i vandbad eller på en varme blok på 100-110 ° C at opretholde agar i flydende form. Tilføje 1-2 dråber af histologiske mærkning farvestof til en af de 2% agar løsninger, som vil betegne toppen af agaren stik og bistå med at opretholde orientering under indlejring. Bland godt.
    2. Varm histologi gelen i et vand bad eller varme blok på 55-65 ° C.
    3. Brug en 1000 μL pipette tip, oprette forme ved at skære en lille del af pipette tip til at gøre en cylinder, der holder ~ 50 μL. Oprette en anden, bredere mug, der passer omkring den første skimmel.
    4. Oprette en kold blok af indpakning en ispose med tape (klæbende side opad) og vedhængende forme på båndet.
    5. Oprette en stemplet ved at fjerne stemplet fra en 1 cc insulin sprøjte.
  2. Integrere organoids i en histologi gel plug til forarbejdning, efter arbejdsprocessen afbildet i figur 2A.
    1. Adskille matrix gel og pellet organoids ved at følge trin 2.1-2.7.
    2. Vask organoid pellet engang med 1 mL af HBSS og re pellet ved centrifugering i 3-5 min. på 300 x g og fjerne supernatanten.
    3. Genopslæmmes organoid pellet i 30 – 50 μL af flydende histologi gel. Bland forsigtigt af pipettering langsomt op og ned. Overføre histologi gel/organoid blandingen ind i en støbeform på den kolde blok og tillade modellen til at køle og størkne i et stik.
    4. Bruge en stemplet til at skubbe stikket ud af den lille skimmel og i de større skimmel. Pipette klare 2% agar omkring plug til at fylde den større skimmel.
    5. Der afpipetteres histologiske dye-tonet 2% agar oven på plug til at betegne toppen af prøven.
    6. Når afkølet, skal du bruge en stemplet til at overføre stikket i en histologi kassette. Label kassetten ved hjælp af en blyant og sted kassette i 10% NBF til fiksation natten over.
    7. Overføre kassetten fra 10% NBF til 70% histologiske grade EtOH.
  3. Processen histologi gel sæt ved hjælp af en forudindstillet biopsi protokol på en processor, hvis den er tilgængelig. Hvis preset ikke er tilgængelig, skal du indtaste følgende sekvens og længder: 70% EtOH til 6 min, 70% EtOH for 10 min, 80% EtOH i 10 min, 95% EtOH 2 gange i 10 min, 100% EtOH 3 gange i 10 min, xylen 3 gange for 15 min , og paraffin 3 gange i 15 min. afviger fra den anbefalede behandling sekvens kan resultere i bristede organoids (figur 3A).
  4. Integrere histologi gel stikket med den farvede del opad, da dette vil give de misfarvede del som indeholder organoids til at være opdelt i første.
  5. Afsnit FFPE histologi gel blokke:
    1. Indsamle nødvendige forsyninger: FFPE histologi gel blokke, histologi pen, væv float vandbad, isspand med is, mikrotomen og mikrotomen blade, embedding arbejdsstation, positivt ladede objektglas, og laboratorium ovn.
    2. Udfylde vandbad indtil meget fuld og sæt til 40 ° C, så pre varm laboratorium ovn til 45-50 ° C.
    3. Forberede en isspand, derefter udfylde med is og tilsæt vand for at oprette en is-vand gylle. Chill blokke på is, indtil de er meget koldt.
      Bemærk: Blokke kan indstilles på is i op til 1 dag, men hvis venstre natten, blokke vil blive hydreret og skal oparbejdes.
    4. Indsætter en blok i mikrotomen kassetteklemmen, tilføje bladet til knivholderen og låse enhver låsning beskyttelsesforanstaltninger på maskinen.
    5. Begynder ved at trimme ansigt af paraffin blok (vender) på 10 µm tykkelse. Når en sektion fremgår der indeholder området plug, stoppe trimning, låse mikrotomen rotoren og overføre blok tilbage på is til nedkøling. Hvis flere blokke skal være delt, blokere face-off hver før flytning til trin 4.5.6.
    6. Flytte klingen til en ny, ubrugt del og overføre blokken tilbage til klemme. Låse maskinen og begynde trimning på 5 μm pr. sektion.
      Bemærk: 5 μm anbefales for de bedste resultater, men 3-10 μm er også acceptabel.
    7. Bruge pincet, overføre afsnittet til 40 ° C vandbad og tillade afsnittet for at sprede. Overføre afsnit på et dias ved at dyppe lodret i vandet.
      Bemærk: Dypning i en vinkel kan overføre bobler fra bunden af badet til afsnittet og forårsage forvrængning af prøven.
    8. Visualisere afsnittet under mikroskop (figur 2BC).
      Bemærk: Hvis en organoid øjeblikket, vil det vises svarende til den røde pil i figur 2B. Bobler (figur 2B, blå pil) kan ligne hinanden til organoids og er lettere at få øje på en frisk-dias, som tørt organoids vises gennemskinnelige (figur 2 c). Hvis ingen organoids er til stede, afsnittet yderligere i blokken.
  6. Når dias, der indeholder organoids har anskaffet, cirkel området omkring sektionen på bagsiden af dias med en histologi pen og bages overnatning på 45-50 ° C.
  7. Indsamle dias og videre til H & E (Se trin 4.9.1), immunhistokemisk (Se trin 4.9.2), eller immunfluorescent farvning (Se trin 5).
    Bemærk: Repræsentative resultater er vist i figur 3B.
    1. For at udføre H & E farvning, få et kit fra listen materialer og Følg fabrikantens specifikationer.
    2. Til at udføre immunhistokemiske farvning, få et kit og primære antistof fra listen materialer og Følg fabrikantens specifikationer.

5. immunfluorescent farvning af FFPE og sektioneret Organoids

  1. Indsamle forsyninger: bagt dias fra trin 4, xylen, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, deioniseret vand (DI H2O), coplin krukker, 1 x antigen hentning opløsning (natrium citratbuffer eller EDTA-Tris buffer), fosfatbufferet saltopløsning (PBS), 5% normal hest serum ( NHS) med 0,1% nonionisk detergent i PBS, 1% bovint serumalbumin (BSA) med 0,3% nonionisk detergent i PBS, farvning rack, farvning parabol, decloaking kammer, hydrofobe barriere pen, fugtigt kammer, 1 ° og 2 ° antistoffer af interesse, og counterstains af interesse.
  2. Deparaffinize og Rehydrér dias ved dypning i coplins fyldt med følgende løsninger: xylen (3 dips, 5 min), 100% EtOH (2 dips, 3 min. hver), 95% EtOH (2 dips, 3 min. hver), 70% EtOH (2 dips, 3 min. hver) og DI H2O (2 dips 3 min).
  3. Fyld farvning fadet med antigen hentning løsning og pre heat decloaking kammer til 100 ° C.
  4. Udføre antigen hentning ved at nedsænke dias i forvarmet farvning skålen og Inkuber i 5-10 min. ved 100 ° C. Når den er færdigafkølet, tillade decloaking salen til at sidde i 20 min. før åbning af låget.
  5. Når slide parabol er afkølet til RT, placere farvning fadet under rindende DI H2O at skylle dias i 5 min.
  6. Fjern dias fra farvning fadet, tegne en cirkel omkring prøven med en hydrofobe barriere pen og lægge dias på fugtigt kammer.
  7. Blokere enhver ikke-specifikke antistof farvning ved at anvende 5% NHS med 0,1% nonionisk detergent i PBS den hydrofobe cirkel omkring prøven (ca. 30 μL er nødvendig for at dække prøven).
  8. Vask dias i coplins fyldt med PBS 3 gange i 5 min.
  9. Tilføj 1° antistoffer (Table of Materials) opløst i 1% BSA med 0,3% nonionisk detergent i PBS til at de hydrofobe cirkel omkring prøven (ca. 30 μL bør dække sektionen), derefter inkuberes i 1 h i RT eller natten over ved 4 ° C i fugtigt kammer.
  10. Vask dias i coplins fyldt med PBS 3 gange i 5 min.
  11. Tilføj 2° antistof fortyndet i 1% BSA med 0,3% nonionisk detergent i PBS til at de hydrofobe cirkel omkring prøven (ca. 30 μL vil dække området), derefter inkuberes i 1 h i RT i fugtigt kammer.
  12. Vask dias i coplin fyldt med PBS 3 gange i 5 min.
  13. Tilføje DAPI, fortyndet til fabrikantens specifikationer, i 1% BSA med 0,3% nonionisk detergent i PBS til den hydrofobe cirkel omkring prøven, derefter inkuberes i 2 – 5 min. ved RT i mørke (30 μL).
  14. Vask dias i coplins fyldt med PBS 3 gange i 5 min.
  15. Montere dias med antifade montering medier og coverslip, og derefter visualisere resultater under et mikroskop.

6. hele-montering af Organoids til immunfluorescent farvning

  1. Indsamle forsyninger: kammer dias eller Konfokal parabol, phosphat bufferet saltvand (PBS), Fikseringsvæske, 50 mM NH4Cl i PBS, 0,1% nonionisk detergent i PBS, 5% NHS med 0,1% nonionisk detergent i PBS, 1% BSA med 0,3% nonionisk detergent i PBS, 1 ° og 2 ° antistoffer af interesse, og counterstains af interesse.
  2. Fjern forsigtigt så mange medier som muligt uden at forstyrre organoid kulturen af pipettering mod siden af godt, forlader plads mellem medier og matrix gel.
  3. Bruger en trimmet, pre våd med medier eller PBS, 1000 μL pipette tip, udarbejde en dråbe (25 – 50 μL) matrix gel, der indeholder organoid(s) af interesse og give afkald på midten af et kammer slide godt eller Konfokal parabol.
    Bemærk: 33% matrix gel er ikke en solid. Det er et gelatinøse væske, der håndterer svarende til en Jello, der ikke fuldt ud indstillet. En trimmet pipette spids med en stor åbning vil forhindre organoids fra at bryde under overførsler.
  4. Hvis organoids stadig i den overordnede kultur, erstatte medier med varm KSFM-baserede medier.
  5. Med det blotte øje eller dissekere anvendelsesområde, Opsug den overskydende medier og matrix gel fra salen dias med en fin-tip pipette (10-200 μl).
    Bemærk: Det er valgfrit at forbehandle kammer dias med en overholdelse af reagens.
  6. Plade et lige saa stort volumen af matrix gel i en tom brønd af kammeret dias som en valgfri kontrol at observere autofluorescence af sidesten matrix.
  7. Placer kammer diasset i et 37 ° C inkubator for 30-45 min til at fremme organoid for at overholde glasset og forhindre tab af prøver under vask trin.
  8. Pipettering langsomt at forhindre løsrivelse fra dias, vaske organoids med 200 μl 1 x PBS for 5 min på RT mens forsigtigt ryste.
  9. Fjerne 1 x PBS og fix med 200 μl af 4% PARAFORMALDEHYD for 30 min på RT mens forsigtigt ryste. Sikre, at matrix gel vises klart efter dette trin.
    Bemærk: Methanol eller formalin fiksering er også muligt. Fiksering metode bør optimeret til specifikke antistoffer, som visse fiksering metoder kan bitmapgenkendelse antigener af interesse eller slukke fluorescerende-mærkning-proteiner af interesse.
  10. Fjerne fiksativ og vaskes to gange med 200 μl 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste.
    Bemærk: Længden af vaske trin bør være optimeret afhængig af organoid størrelse. Fem minutter er en tilstrækkelig udgangspunkt, men vask trin kan forlænges efter behov.
  11. Slukke autofluorescence med 200 μl af 50 mM NH4Cl i 1 x PBS for 30 min på RT mens forsigtigt ryste.
    Bemærk: Dette trin vil slukke autofluorescence fra vragrester i lumen af organoid og fluorescerende proteiner udtryk (f.eks. normal god landbrugspraksis), der kan præsentere fra eksperimentelle design. Det skal også indtastes, hvis det ønskes at bruge en fluorophore i 488 kanal men kan springes over, hvis det ønskes at bevare normal god landbrugspraksis signal.
  12. Fjerne NH4Cl og vaskes to gange med 200 μl 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste.
  13. Permeabilize organoids i 200 μl af 0,1% nonionisk detergent-100 i 1 x PBS for 30 min på RT mens forsigtigt ryste.
  14. Fjerne 0,1% nonionisk detergent-100 i 1 x PBS og vaskes to gange med 200 μl 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste.
  15. Blokere med 5% NHS med 200 μl af 0,1% nonionisk detergent X-100 i PBS og inkuberes i 60 min på RT mens forsigtigt ryste.
  16. Fjerne den blokerende buffer og vaskes to gange med 200 μl 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste.
  17. Fortyndes 1° antistof i 1% BSA med 0,3% Triton X-100 i 1 x PBS og føje til 200 μl af kammeret diaset og derefter inkuberes i 1-3 dage ved 4 ° C.
  18. Fjerne 1° antistof og vaskes to gange med 200 μl 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste.
  19. Fortyndes 2° antistof i 1% BSA med 0,3% Triton X-100 i 1 x PBS og føje til 200 μl af kammeret diaset og derefter inkuberes i 1-3 dage ved 4 ° C i mørke.
    Bemærk: Længden af inkuberingstider skal optimeres for organoid størrelse og antistof. Nogle vil kræve mere tid til at trænge ind gennem organoid. Antistof koncentration skal også være optimeret. Generelt, 2 x koncentrationen anvendes til FFPE sektioner er velegnet til 1° antistoffer og den samme koncentration af FFPE sektioner er egnet til 2° antistoffer.
  20. Fjerne 2° antistof og vaskes to gange med 200 μl 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste.
  21. Kontrastfarve actin med phalloidin og kerne med DAPI eller Hoescht, fortyndes efter producentens anbefalinger i 1% BSA med 0,3% Triton-X i 1 x PBS. Tilføje 200 μl til kammeret dias og derefter inkuberes ved RT i 40 min. i mørke.
  22. Mount i 200 μl af frisk 1 x PBS eller montering medier og billede umiddelbart (Fluorescens bør bevares, for op til 5 dage, hvis ikke længere). Repræsentative resultater er vist i figur 3 c.
    Bemærk: Natriumazid kan føjes til prøver at forhindre forurening, hvis Konfokal billedbehandling ikke er let tilgængelige. Tilføje en clearing agent kan forbedre billeddannelse.

7. hele-montering af Organoids til Assays og fluorescerende sonder

Bemærk: Der er kommercielt tilgængelige assays og fluorescerende sonder/farvestoffer (eksempler er inkluderet på listen over materialer) ændres til brug på hele monterede organoids at observere en række nyttige slutpunkterne19. Følgende protokol er for fluorescently mærket EdU spredning kit, men enhver kit kan ændres til brug med en helhed-monteret prøve.

  1. Forsigtigt fjerne 50 μL af medier og erstatte med 50 μL 20 μm 2 x arbejder EdU løsning af pipettering mod siden af godt, forlader plads mellem medier og matrix gel.
  2. Der inkuberes ved 4 ° C i 1 – 3 dage (den ønskede længde af tid til EdU indbygning skal optimeres for celletype af valg).
  3. Følg trin 6.2-6.8 til at overføre organoids af interesse på en kammer dias eller Konfokal parabol.
  4. Fjerne PBS og fix med 200 μl af 3,7% PARAFORMALDEHYD for 30 min på RT mens forsigtigt ryste. Sikre, at matrixen gel vises klart efter dette trin.
  5. Fjerne fiksativ og vaskes to gange med 200 μl 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste. Fjern PBS og tilsæt 200 μl af 0,5% nonionisk detergent-100 i 1 x PBS for 30 min på RT mens forsigtigt ryste.
  6. Forberede en 1 x fluorescerende reaktion cocktail ifølge producentens specifikationer.
  7. Fjerne 0,5% nonionisk detergent-100 og vaskes to gange med 200 μl af 3% BSA i 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste.
  8. Tilføje reaktion cocktail og Inkuber i 30 min. ved RT i mørke.
  9. Fjerne den fluorescerende reaktion cocktail og vask en gang med 200 μl af 3% BSA i 1 x PBS for 5 min mens forsigtigt ryste. Kontrastfarve og mount ved at følge trin 6.21 – 6,22 (figur 3D).

Representative Results

Efter vellykket kultur af human primære prostata organoids, kan morfologi og differentiering vurderes ved hjælp af lysfelt billedanalyse og FFPE og hele-mount farvning teknikker.

Lysfelt billedoptagelse proces er illustreret i figur 1A. Organoids er vokset i en 3D matrix og spredt på tværs af forskellige fokale planer. For at overholde organoids i fokus på tværs af mange fly, er det foreslået for at bruge en EUF billede (figur 1B, højre) i stedet for et enkelt z-fly (figur 1B, venstre). I laboratoriet, kan organoids dyrkes under forskellige forsøgsbetingelser medføre ændringer i morfologi. Ved hjælp af området, cirkularitet (defineret af hvor ens organoid er en cirkel) og max/min radius (måling af længde) give brugere en indikation af organoid størrelse og form og give en kvantificerbar udlæsning af morfologi. For at understrege nytten af disse foranstaltninger, er repræsentative billeder af organoids med lignende område, men forskellig morfologi vist i figur 1 c, hvor en lang organoid vil være mindre cirkulær og har en større maksimum/minimum ratio end en sfærisk organoid.

Indlejring organoids for histologi er en nyttig slutpunkt til at iagttage indre af prøver og sikre at nekrose ikke findes inden for kernen i en organoid. En arbejdsgang til denne proces og repræsentative resultater af unstained, sektioneret prøverne under et mikroskop for lysfelt leveres i figur 2AB, C. Figur 3A viser en mishandled organoid (venstre) sammenlignet med korrekt rakte organoids i figur 3A (højre) og figur 3B. For at bestemme differentiering-tilstand af prøven, anbefales det at kigge på basalcelle markører (cytokeratin 5 og p63)8 sammen med luminale celle markører (cytokeratin 8)8. Hvis det ønskes at pletten organoids i situ, hele-mount farvning er et bekvemt alternativ, og disse repræsentative resultater er angivet i figur 3 cD.

Figure 1
Figur 1: morfologi vurdering af organoids i 3D kultur. (A) billede indsamling og komprimering arbejdsgang for menneskers primære prostata organoids erhvervet ved en gennemlysning inverteret mikroskop med en motoriseret X / Y scanning fase og følgesvend software. (B) repræsentative billeder af en enkelt z-stak (venstre) vs. en EUF billede (højre) af en helhed-godt prøve af menneskelige primære prostata organoids, viser, at flere organoids er i fokus, når flere z-stakke er kombineret i en enkelt projicerede billede (skalalinjen = 1000 µm). (C) repræsentative billeder til området, cirkularitet og max/min forholdet mellem morfologisk ulige menneskelige primære prostata organoids, som har samme område (skalalinjen = 200 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Organoid indlejring arbejdsproces og repræsentant skæring resultater. (A) menneskelige primære prostata organoid indlejring arbejdsproces. (B) repræsentativt billede af en unstained, frisk dias, der indeholder menneskelige primære prostata organoids under en lysfelt mikroskop skildrer agar (grøn pil), histologi gel (sort pil), bubble (blå pil), organoids (røde pile) (skalalinjen = 1000 µ m). (C) Unstained frisk skåret dias (venstre) vs. unstained tør dias (til højre), organoids (røde pile) vises gennemsigtigt, når tør (skalalinjen = 500 µm) og er sværere at skelne under et mikroskop for lyse-felt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: histologisk farvning på sektioneret og hele monterede organoids. (A) H & E farvning af en brudte menneskers primære prostata organoid fra mishandling (aggressiv pipettering, forkert behandling protokol, venstre) ved siden af et godt håndteret organoid (højre) (skalalinjen = 100 µm). (B) menneskelige primære prostata organoid, der har været formalin-fast, paraffin-embedded, snit, og farves med basal cytokeratin 5 eller luminale cytokeratin 8 (øverst) eller basal p63 og luminale cytokeratin 8 (nederst) og afbildet med Konfokal mikroskop ( skalalinjen = 100 µm). (C) en hele monterede menneskelige primære prostata organoid farves med basal cytokeratin 5 eller luminale cytokeratin 8 og counterstained med phalloidin og DAPI, afbildet med Konfokal mikroskop (skalalinjen = 100 µm). (D) en hele monterede menneskelige primære prostata celle organoid farves med fluorescently mærket EdU og counter farves med Hoescht, afbildet med Konfokal mikroskop (skalalinjen = 500 µm) venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Organotypic kultur er en spændende ny metode til recapitulating væv med bekvemmeligheden af en in vitro- miljø. I øjeblikket vokse labs organoids fra mange typer af væv til forskellige slutpunkter. Metoderne beskrevet i denne hvidbog opsummere nyttige slutpunkter og fremhæve nye teknikker for at fuldt ud at beskrive 3D primære prostata cellekulturer.

Der er en bred vifte af medier opskrifter til at dyrke menneskelige primære prostata celle organoids5,6,13. Mens alle nå levedygtige og sammenlignelige resultater, bruger KSFM-baserede medier13 minimal tilsætningsstoffer så det er beskrevet her. Derudover er blevet offentliggjort papirer, ved hjælp af flere koncentrationer for matrix gel, fra 10% til 75% til kultur prostata organoids5,6,13. Fordi matrix gel er en bekostelig reagens, og 33% matrix gel har vist sig at være tilstrækkeligt til at dyrke langsigtede (2-3 uger), levedygtig, unclumped organoids13, dette er den anbefalede koncentration. Men matrix gel kan variere i proteinkoncentration mellem lotnumre, så dette bør tages i betragtning, når plating. Det anbefales også at købe matrix gel i bulk til brug på tværs af flere eksperimenter for at reducere uoverensstemmelse mellem masser. Andre labs har udgivet forskellige formater til plating matrix gel, som dråber i stedet for belægning en 96-brønd plade godt5. Begge metoder danne levedygtige organoids, men formatet beskrevet her mulighed for celler til at være forgyldt mere sparsomt, som har vist sig at fremme udvidelse af celler ind i større organoids13. Dog bør plating tæthed optimeres baseret off patient-specifikke dannelse effektivitet. Matrix gel er tilgængelig i mange formater herunder vækstfaktor-reduceret, phenol rød-fri, høj koncentration, osv. Vækstfaktor-reduceret anbefales for defineret dyrkningsbetingelser, og phenol rød-fri anbefales, når du arbejder med celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis eller i eksperimenter, der involverer z-stakken billedoptagelse. Det er afgørende, at enhver matrix gel plating trin udføres med iskold reagenser, som matrix gel størkner hurtigt ved stuetemperatur.

Organoids dyrkes under forskellige eksperimentelle behandlinger kan medføre ændringer i form, så lysfelt imaging er meget udbredt at studere observerede morfologiske fænotyper. Optagelse og kvantificere område eller form er dog en udfordring af to årsager: 1) udvalg bias under billedoptagelse og 2) anvender en to-dimensionel parameter såsom område til en tre-dimensionel stikprøve. Én strategi billedoptagelse er at optage et tilfældigt felt og måle et forudbestemt antal organoids på dette område, men dette kan skabe bias i udvalg, og alle organoids i det valgte felt muligvis ikke være i fokus. Hele-godt imaging optimeret til formatet 96-brønd mikrotiterplade eliminerer denne prøveudtagning bias ved at samle hele organoid befolkning af interesse. Dog afhængig af mikroskop mål på hånd, flere felter muligvis være indsamlet og flise for at opnå en helhed-godt billede. Nogle laboratorier har beskrevet målefeltet fra en enkelt z-fly12, men for at fange alle organoids i fokus, anbefales det at indsamle og stable flere fly i en enkelt EUF-billede13. I nogle tilfælde, en menisk i matrix gel kan forårsage vignettering i billedet, og baggrunden korrektion metoder kan være nødvendigt at være anvendt ved hjælp af billede analyse software. Nøjagtige volumen er ideelt den mest passende måling for organoid størrelse; Det er imidlertid vanskeligt at netop få, selv med flere z-stak billeder. Andre nyttige morfologiske dimensioner, såsom cirkularitet og maksimum/minimum forholdet, kan let beregnes fra alle organoids i en helhed-godt EUF billede. Sammen, disse metoder overvinde prøveudtagning bias udfordringer og aktiverer måling af 2D parametre fra 3D-objekter i et 3D-rum.

Formalin fiksering og paraffin indlejring af organoids er en fælles metode til at opnå hæmatoxylin og eosin (H & E), immunhistokemisk (IHC) og immunfluorescent (IF) farvning for visualisering og analyse6,11, 20. imidlertid publikationer, der har beskrevet denne teknik mangler omfattende detaljer om indlejring processen. Derudover kan at lokalisere organoids inden for paraffin blok være udfordrende. Nogle laboratorier pre pletten organoids med trypan blå forud for indlejring støtte i placering ved skæring11. Metoden beskrevet her omfatter anvendelse af en histologisk farvestof til orientering af organoid/histologi gelplug under indlejring for at fremme effektiviteten af skæring. H & E dias lette undersøgelsen af nekrose, nukleare tekstur og spredning, og det bør således være en obligatorisk slutpunktet for organoid kultur til at sikre, at cellerne er sund i hele området. En styrke af organoid kultur er, at prøverne består af en heterogen blanding af celler, der bedre ligner i vivo patient væv. I prostata, eksempelvis er både basal og luminale celler til stede i prostata organoids5, mens celler dyrkes i 2D manglende luminale differentiering8. For at vurdere organoid differentiering, anbefales det, at forskere vurderer basal markører som CK5 og p63 og luminale markører som androgenreceptorer og CK88. Eventuelle andre eksperimentelle proteiner af interesse kan også studeres ved hjælp af disse farvning teknikker.

Selvom FFPE sektioner giver mulighed for visualisering af celler bosat i de indvendige rum via histologiske metoder (H & E, hvis, IHC), billeder er begrænset til cross sektioner, og organoid form kan ændres ved indlejring processen. Hele-mount farvning gør det muligt for en organoid at være plettet og observeret i situ, bevare morfologiske fænotyper og tillader billeder af protein lokalisering. Hele-montering er et værktøj, der er udnyttet til at pletten hele-væv eller hele-dyr prøver, såsom zebrafisk eller mus fosteret, og er let tilpasses til organoids. Den teknik beskrevet her blev ændret fra proceduren ved Mahéet al. 11, som indeholder oplysninger om den indledende vækst og kultur af gastrointestinal organoids direkte på et kammer dias til farvning, og som kræver fiksering af hele overordnet kultur. Metoden her skitserede indebærer overførsel af en enkelt organoid (eller organoids) af interesse på en kammer dias på tidspunktet for farvning. Dette giver mulighed for valg af individuelle organoids for hele-mount analyse i en igangværende eksperiment uden fiksation af den overordnede kultur. Når du udfører hele-mount farvning, det er nødvendigt at optimere permeabilization og inkubationstiden for primær og sekundær antistoffer til at sikre udbredelse i hele modellen (hvor som helst fra en eller flere dage anbefales). Når afbildet via Konfokal mikroskopi, kan 3D puds produceres for at aktivere visualisering og lokalisering af et specifikt protein og beregne antallet af positivt farvede celler findes i en prøve. Flowcytometri er en nyttig slutpunkt til at kvantificere populationer af basal, luminale, eller stilk celler5,14. For at gøre dette, er celler inddrives fra matrix gel og forsigtigt dissocieres til farvning. Brugere bør omhyggeligt vælge passende markører for adskillelse baseret på den aktuelle litteratur. For menneskers primære prostata epitelceller er CD26 og CD49f egnede luminale og basal markører, henholdsvis5,21.

I Resumé detaljer denne protokol menneskelige primære prostata organoid vækst, samling og eksperimenterende slutpunkter. Af note, kan montering teknik beskrevet anvendes til en lang række andre assays, der normalt er beskæftiget i 2D celler, såsom fluorescerende sonde-baserede eksperimenter ser på spredning19, apoptose og subcellulært organelle pletter. Derudover kunne samling og dissociation metoden beskrevet her udnyttes som forberedelse til én celle RNA sekventering18. Kollektivt, viser det muligheden for en bred vifte af roman, high-fidelity slutpunkter, at forskere kan optimere og udforske i fremtiden.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker UIC Biorespository medlemmer, Dr. Klara Valyi-Nagy, og Alex Susma, samt Urologer, Drs. Michael Abern, Daniel Moreira og Simone Crivallero, til lettelse af væv anskaffelsessum for de primære cellekulturer. Vi takker UIC Urologisk patienter for at donere deres væv til forskning. Dette arbejde blev finansieret, delvis af den afdeling af Defense prostata kræft forskning Program sundhed forskelle idé Award PC121923 (Nonn) og UIC Center for kliniske og oversættelse naturfagsundervisning Pre-doctoral for klinisk og translationel forskere ( PARTNERE) Program (McCray og Richards) og National Institutes of Health's National Cancer Institute, Grant numre U54CA202995, U54CA202997 og U54CA203000, kendt som den Chicago sundhed Equity Collaborative (Nonn og Richards). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health eller Department of Defense.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells of interest
Keratinocyte-SFM (KSFM) ThermoFisher Scientific 17005042
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) ThermoFisher Scientific 12676029
5α-Dihydrotestosterone (DHT) Sigma-Aldrich D-073-1ML
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Matrigel (matrix gel) Corning Various Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application
Ice Bucket
Cell Culture Hood
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical ThermoFisher Scientific 05-408-130, 339650
Centrifuge
Dispase (neutral protease) STEMCELL Technologies 7923 neutral protease
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025076
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018 suggested RNA extraction solution
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900 suggested protein extraction solution
DNAzol ThermoFisher Scientific 10503027 suggested DNA extraction solution
Organoids
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Brightfield microscope with camera capabilities ex. ‎EVOS FL Auto Imaging System
Photo analysis software ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler
Graphing software ex. Graphpad, Excel, etc
Organoids
Ice pack
Masking tape
Pipette tips (1000 μL)
Razor blade
Dispase STEMCELL Technologies 7923
Agarose Sigma-Aldrich A9045
HistoGel (histology-gel) ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Pencil
"Plunger" from 1 cc insulin syringe
Tissue Casette Thomas Scientific 1202D72
Container to hold fixative
10% neutral buffered formalin (NBF) Sigma-Aldrich HT501128
Histology pen, xylene and EtOH-resistant Sigma-Aldrich Z648191-12EA STATMARK pen
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 For fixation and graded dilutions during processing
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water
Paraffin Leica various
Tissue processor
Embedding workstation
Economy Tissue Float Bath Daigger EF4575E XH-1001
Microtome
Microtome blades Ted Pella 27243
Positively charged microscope slides Thomas Scientific 1158B91
Laboratory Oven ThermoFisher Scientific PR305225G
Hematoxylin and Eosin Stain Kit Vector Laboratories H-3502 Suggested H&E staining kit
ABC Peroxidase Standard Staining Kit ThermoFisher Scientific 32020 Suggested immunohistochemistry staining kit
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) Cell Signaling Technology 5153S Suggested primary antibody for IHC
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 dilutions should be performed using deinoized water
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water (DI H2O)
Antigen retrieval solution Sigma-Aldrich, Abcam C9999, ab93684
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Coplin Fisher Scientific 19-4
Staining rack IHC World M905-12DGY
Staining dish IHC World M900-12B
Decloaking chamber Biocare Medical DC2012
Humidity chamber Thomas Scientific 1219D68
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Microscope cover glass Globe Scientific 1414-10
Anti-fade mounting media ThermoFisher Scientific S36972
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240 optional adherent reagent
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
4% paraformaldehye (PFA) Biotium 22023 other fixatives such as methanol or formalin can be used
50mM NH4Cl sigma-Aldrich 254134
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum (NHS) thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin (BSA) sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Counterstain (phalloidin) thermoFisher Scientific A22287
Sodium azide sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Visikol HISTO-M Visikol various optional clearing agent
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Cell assay of interest Various Various Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)
Organoids
Ice bucket
Cell culture hood
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical
Microcentrifuge
Dispase STEMCELL Technologies 7923
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175079
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap Fisher Scientific 08-771-23
Cytokeratin 5 Antibody - FITC Millipore Sigma FCMAB291F Suggested flow antibody
Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 Abcam ab210139 Suggested flow antibody
CD49f - Alexafluor 647 BioLegend 313609 Suggested flow antibody
CD26 - PE BioLegend 320576 Suggested flow antibody
Flow cytometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  2. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  3. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
  4. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  7. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
  8. Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
  9. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
  10. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
  11. Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
  12. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
  13. Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
  14. Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
  15. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
  16. Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
  17. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
  18. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  19. Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 143 Organoid slutpunkt 3D quanification billedanalyse FFPE hele-mount morfologi prostata menneskelige immunofluorescens
Håndtering og vurdering af menneskers primære prostata Organoid kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCray, T., Richards, Z., Marsili,… More

McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. J. Vis. Exp. (143), e59051, doi:10.3791/59051 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter