Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para orientar a manipulação de organoides humano de próstata primário, em seguida, sugerir pontos de extremidade para avaliar o fenótipo. Semeadura, manutenção de cultura, recuperação de gel da matriz, quantificação morfológica, incorporação e seccionamento, FFPE seccionamento, toda a montagem coloração e aplicação de ensaios comerciais são descritos.
Abstract
Este artigo descreve um protocolo detalhado para tridimensional (3D) de cultivo, manipulação e avaliação de organoids de próstata primário humano. O processo envolve a propagação de células epiteliais escassamente em um gel de matriz 3D em uma microplaca de 96 poços, com alterações de mídia para cultivar a expansão em organoids. Morfologia é então avaliada pelo bem de toda a captura de imagens de z-pilha. Compressão de z-pilhas cria uma única imagem em foco, dos quais organoids são medidos para quantificar uma variedade de saídas, incluindo circularidade, esfericidade e área. DNA, RNA e proteínas podem ser coletadas de organoids recuperadas o gel da matriz. Populações de células de interesse podem ser avaliadas por dissociação de organoides e citometria de fluxo. Formalina-fixação-parafina-incorporação (FFPE) seguido por corte é usado para a avaliação histológica e anticorpos. Toda a montagem de coloração imunofluorescente preserva a morfologia de organoides e facilita a observação da localização da proteína em organoids em situ. Ensaios comerciais que são tradicionalmente utilizados para células monocamadas 2D podem ser modificados para organoids 3D. Usados em conjunto, as técnicas neste protocolo fornecem uma caixa de ferramentas robusta para quantificar o crescimento da próstata organoides, características morfológicas e expressão de marcadores de diferenciação.
Introduction
Organoids são uma ferramenta valiosa para estudar a doença e organogênese. Eles fornecem uma alternativa mais barata para modelos animais, e organoids derivado de paciente estão evoluindo como estratégia de medicina personalizada1,2,3. Este sistema tridimensional (3D) cultura envolve a propagação de células estaminais ou progenitoras (colhido do tecido ou induzida por células estaminais pluripotentes) em um gel de componentes de matriz extracelular (gel de matriz)4. As células proliferam e se diferenciam, resultando em estruturas organotypic que recapitular a hierarquia de celular e a morfologia do órgão da unidade funcional do interesse. Organoids têm sido cultivadas usando células provenientes de uma variedade de órgãos, incluindo as glândulas salivares, estômago, intestino, fígado, próstata, pulmão e cérebro4. Embora existam inúmeros protocolos, descrevendo os passos para estabelecer a próstata organoids5,6, é difícil encontrar métodos suficientemente detalhados em como conseguir pontos de extremidade quantitativos de organoids. Este artigo resume os métodos desenvolvidos para células humanas de próstata primárias e detalha uma série de pontos de extremidade sugeridos para avaliar os fenótipos de organoides. Estas técnicas foram otimizadas para organoids da próstata e podem ser aplicáveis a outras culturas de célula 3D.
Próstata organoides culturas surgiram recentemente como um modelo valioso em vitro que não possui as limitações das culturas monocamada usando estabelecido linhas celulares imortalizado. Epitélio benigno de próstata e câncer de próstata é um desafio para o modelo em vitro usando linhas celulares imortalizado. O número de linhas celulares benignas é limitado, e todos sofreram transformação com oncogenes7. As células epiteliais da próstata primárias em monocamadas não diferenciar em células luminal e falta de receptores de andrógeno8. A maioria das linhas de células de câncer de próstata não tem receptores de andrógeno funcional, um mediador significativo de início estado de doença e falta chave as mudanças genéticas que foram encontradas em tumores paciente9. Culturas de organoides da próstata podem ser cultivadas facilmente do epitélio benigno e são valiosas no estudo de propriedades de célula-tronco, células progenitoras, diferenciação e efeitos das mudanças experimentais no microambiente4,5. Organoids de câncer de próstata pode ser cultivada como parte de uma abordagem de medicina de precisão para modelagem de doença do paciente e resposta a terapias10.
Este protocolo tem sido compilado a partir de protocolos existentes que usam vários tipos de células, mas isso foi aqui otimizado para uso em células humanas de próstata primários. Ele complementa protocolos delineados pela Sawyers, Clevers e Shen5,6 que descrevem o crescimento, passagem, imagem brilhante-campo, criopreservação e isolamento de RNA e DNA da próstata do rato e organoids humana. O protocolo de toda a montagem é modificado de Mahé et al 11, que usou organoids epiteliais gastrointestinais e descreve ao vivo de imagens e congelados e incorporação de parafina. Et al . Borten 12 descreveu a análise de mama, cólon e morfologia de organoides câncer colorretal do brilhante-campo de imagem. Além disso, Richards et al. 13 um método usado para a avaliação morfológica do organoids da próstata. Finalmente, Hu et al. 14 descreveu um método de próstata aderente organoids para um slide da câmara durante a noite antes da coloração imunofluorescente para observar células únicas e dispersão das esferas para análise de citometria de fluxo.
O objetivo do presente protocolo é demonstrar em detalhes suficientes esses métodos tecnicamente desafiadoras como um protocolo, incluindo a célula de semeadura; mídia e matriz de gel de manutenção; coleção de células por citometria de fluxo; RNA, DNA e extração da proteína; avaliação morfológica de análise brilhante-campo z-pilha; incorporação, transformação e seccionamento para coloração histológica; e toda a montagem por imunofluorescência ou ensaios de sonda fluorescente. A relevância biológica e interpretação destes vários pontos de extremidade irão variar entre os anticorpos utilizados para análise e delineamento experimental. Por meio da utilização do presente protocolo, os usuários devem sentir preparados para configurar uma experiência com um conjunto de ferramentas de pontos de extremidade.
Humano primário da próstata (PrE) células epiteliais estabeleceram-se no laboratório pelo protocolo descrito por Peehl,15,16 e mantida a um número limitado de passagens (até quatro) como descrito anteriormente,17, mas eles também são disponível a partir de fornecedores comerciais. Hepatócito soro livre baseada em mídia6, baseada em KSFM13e R-spondin 1-condicionado5 mídia é publicadas como tendo produzido com êxito o organoids. Baseado em KSFM requer o menor número de aditivos, assim é descrito aqui.
Protocol
O protocolo seguinte foi otimizado usando humanas primária da próstata células epiteliais colhidas do paciente tecido da Universidade de Illinois, no Hospital de Chicago. Todos os tecidos humanos utilizados para estas experiências foram adquiridas através de um Conselho de revisão institucional aprovado protocolo e/ou isenção na Universidade de Illinois em Chicago. Enquanto as condições de cultura irão variar dependendo do tipo de célula de interesse, os pontos de extremidade podem ser aplicados a organoids de outros tecidos.
1. semeadura de células epiteliais em Gel Matrix e alteração de mídia
- Coletar os materiais necessários: humanas primário da próstata células epiteliais (pré), gel de matriz no gelo, microplacas de 96 poços, queratinócito media serum-free (KSFM) no gelo, carvão, despojado de soro fetal bovino (FBS) e dihidrotestosterona (DHT).
- Prepare a mídia baseada em KSFM organoides combinando 47,5 mL de KSFM com 2,5 mL de carvão FBS despojado e dihidrotestosterona (DHT) a uma concentração final de 10 nM DHT, então reserva no gelo.
- Células de placa em uma matriz 3D em uma capa de cultura de células utilizando uma técnica estéril.
- Delicadamente mistura fria mídia baseada em KSFM organoides com gel de matriz gelada para obter uma matriz de 50% do gel mistura por lentamente pipetagem para cima e para baixo, evitando bolhas.
Nota: Matrix gel deve ser descongelado durante a noite a 4 ° C e mantido no gelo, sempre que possível. Ela se solidifica rapidamente à temperatura ambiente (RT). - Pre-molhado uma ponta da pipeta no criogênicos e transferência 40 – 50 μL de matriz 50% gel na parte inferior de cada poço deve ser usado em uma placa de 96 poços. Cubra o fundo do poço para formar uma camada de base.
Nota: Não dispensa totalmente a segunda paragem na pipeta, como isso pode criar bolhas. - Coloque a placa de 96 poços em incubadora 37 ° C por 30-45 min solidificar a camada de base.
Nota: Não placa células epiteliais para a camada de base até que tem solidificado, ou células podem cair pela matrix na parte inferior da placa e crescer como uma monocamada. - Misture suspendidas na mídia baseada em KSFM organoides com 33% matriz gel e gel de matriz para obter uma concentração final de 100 – 1.000 células/100 μL de células epiteliais. Células epiteliais de placa em cima de camadas de base usando 100 μL de mistura de gel/célula matriz 33% por poço.
Nota: Experiências anteriores mostraram que a propagação de células epiteliais também densamente em 3D irá restringir o tamanho de crescimento de organoides, enquanto também escassamente semeadura pode resultar em muito baixo rendimento13. É importante otimizar as condições de propagação para o tipo de célula de interesse, com base na eficiência de formação paciente específico organoides.
- Delicadamente mistura fria mídia baseada em KSFM organoides com gel de matriz gelada para obter uma matriz de 50% do gel mistura por lentamente pipetagem para cima e para baixo, evitando bolhas.
- Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora de 37 ° C por 30-45 min permitir que o gel de matriz solidificar e, em seguida, delicadamente, adicionar 100 μL de mídia baseado em KSFM organoides em cima de células pipetando lentamente contra a borda do poço.
- Altere os meios de comunicação a cada 2-3 dias. Pipetagem contra o lado do bem com o espaço entre a mídia e matriz de gel, Retire cuidadosamente 50 μL de mídia e substituir com 50 μL de mídia fresca.
Nota: Para uma cultura de longo prazo, o gel da matriz precisa ser mudado a cada 2-3 semanas. Se a cultura de gel de matriz aparece instável e exibe rugas translúcidas sob o microscópio, o gel da matriz está quebrado para baixo e precisa ser substituído.
2. coleção de Organoids de Gel Matrix
Nota: A coleção de organoids é necessária para alterações de gel de matriz, passagem ou pontos de extremidade de extração de RNA, extração de DNA, extração de proteínas e citometria de fluxo.
- Protease neutro morna e Hanks equilibrada solução salina (HBSS) em banho maria a 37 ° C.
- Cuidadosamente remova a mídia de poços sem interromper o gel da matriz.
- Adicionar ~ 200 μL de protease neutro a cada poço em um ~ 1:2 rácio de protease de matriz gel: neutro e incube por 20 min a 37 ° C.
- Mecanicamente, dissocia a mistura de protease matriz gel: neutro pipetando para cima e para baixo.
- Incubar durante 20 min a 37 ° C.
- Transfira a mistura de gel de célula de protease neutro-matriz para um tubo de microcentrifugadora ou tubo cônico, dependendo do volume. Centrifugar a 300 x g durante 3 – 5 min para células de Pelotas.
Nota: Se não centrifugado aparece, o gel de matriz não pode ser completamente dissociado e pode ser visualizado como uma fase translúcida na parte inferior do tubo distinto do sobrenadante de cor de rosa. Remover o sobrenadante e adicionar protease mais neutro na proporção de 1:2 a matriz a pelota de gel, incubar por mais 20 a 40 minutos a 37 ° C e repetir a centrifugação a 300 x g. - Quando é adquirido um pellet de organoides, remova o sobrenadante. Prosseguir com a passagem (consulte a etapa 2.7.1), organoides Lise para extração de RNA, DNA ou proteína (consulte a etapa 2.7.2), único de processamento de células por citometria de fluxo e sequenciamento de célula única (ver passo 2.7.3).
- Para cultura a longo prazo, Ressuspender delicadamente organoids intacta em 33% matriz fresco gel e placa seguindo as etapas descritas em etapas 1.1 – 1.5. Para dissociar organoids e replate como células únicas, resuspenda o pellet em 1 mL de enzimas da célula quente-dissociação e incubar a 37 ° C, durante 10 a 15 min, lave uma vez com 5 mL de HBSS e re-placa no gel fresco matriz seguindo passos 1.1 – 1.5.
- Resuspenda o pellet de organoides em um tampão de Lise adequado para extração de RNA, extração de DNA ou extração da proteína, conforme listado na Tabela de materiais e seguir o protocolo do fabricante.
- Resuspenda organoids em 1 mL de enzimas da célula quente-dissociação e incubar a 37 ° C por 10 a 15 min dissociar o organoids em células únicas. Lave uma vez com 5 mL de HBSS e prosseguir com o protocolo para fluxo cytometry5 ou célula única sequenciamento18.
Nota: Para dissociar em células únicas em baixas concentrações de gel da matriz, a protease neutra pode não ser necessária, e enzimas da célula-dissociação podem ser aplicadas diretamente ao poço, depois passo 2.2.
3. todo-bem imagem aquisição e análise da morfologia de organoides
- Adquirir imagens de todo bem z-pilha usando um microscópio invertido luz transmitido com uma motorizada X / Y digitalização palco (fluxo de trabalho, ilustrado na figura 1A).
- Com a posição focal ajustada para o fundo do poço, começa com foco para cima até encontrar a primeira organoides, que será no centro do poço devido o menisco da camada de base. Defina o z-plano de fundo nessa posição.
- Continue concentrando-se para cima até que o último organoides em foco, que será na periferia do poço. Defina o z-plano superior nessa posição.
Nota: Depois de definir a parte superior e inferior da pilha-z, certifique-se que estas posições capturar o organoids dentro de todos os restantes poços e ajustar a cima/baixo, conforme necessário. Isso permite que o z-intervalo a ser usado para uma varredura única que inclua todos os organoides dentro de cada poço. - Capture a 15 – 35 z-aviões por bem, usando um número maior de maior resolução. Capturar a imagem bem inteira, mesclar e coletar quadrantes ou subseções se necessário.
Nota: É aconselhável levar vários z-aviões em vez de um único plano z, conforme ilustrado na figura 1B , em que organoids estão fora de foco quando capturar apenas um z-plano. - Salve imagens de z-pilha para análise a jusante.
- Analise imagens usando o software de imagem com recursos de desenho de forma livre.
- Abra uma única imagem de z-plano conjunto de passo 3.1.4.
- Se necessário, telha as imagens tomadas em cada plano z individual em uma imagem única de todo bem. Salve a nova imagem como um arquivo separado. Repita este processo para cada z-plano adquirido.
- Usando o software de imagem, abra a imagem de todo o bem para todos os z-plano de um único poço e criar uma estendido profundidade de campo (FED) imagem da pilha de z-aviões.
Nota: Este tipo de imagem irá selecionar a melhor região de foco de cada z-plano para criar uma única imagem em foco do poço. - Defina a escala de pixel do software à barra de escala da imagem que está sendo medida.
- Usando a ferramenta de desenho de forma livre o software de imagem, traçar o perímetro de cada organoides no poço.
- Obter as métricas de medição para perímetros de organoides rastreados a partir do software de imagem.
Nota: Parâmetros recomendados são área, circularidade e relação raio máximo/mínimo. Resultados representativos, ilustrando a aplicação dessas métricas são mostrados na Figura 1. Área é calculada a partir do polígono definido pelo perímetro dos organoides. Circularidade é a proporção da área dos organoides para a área de um círculo com furão máximo do diâmetro igual a organoides, onde 0 é menos circular e 1 é mais circular. Relação máxima/mínima raio é a razão entre o raio máximo e o raio mínimo dos organoides rastreados.
Circularidade =
Relação raio =
4. parafina e fixação de formalina incorporação de Organoids para pontos de extremidade histológicos
- Preparar suprimentos encastre: HBSS, 2% solução de ágar, marcação histológica tintura, gel de histologia, pipetar molde de ponta, fita, êmbolo de uma seringa de insulina 1 cc, bolsa de gelo, cassettes, 10% de formalina tamponada neutro (NBF), lápis e etanol de grau histológico de 75% (EtOH).
- Prepare dois tubos microcentrifuga de solução de ágar de 2%. Incube em banho-maria ou num bloco de calor 100 – 110 ° c para manter o agar em forma líquida. Adicione 1 a 2 gotas de histológica marcando tintura para uma das soluções de 2% de ágar, que irão designar o topo do ágar plug e auxiliar na manutenção da orientação durante a incorporação. Misture bem.
- Aquecer o gel de histologia em banho-maria ou calor num bloco de 55 e 65 ° c.
- Usando uma ponta de pipeta 1000 μL, crie moldes por cortar uma pequena parte da ponta da pipeta para fazer um cilindro que contém ~ 50 μL. Crie um molde de segundo, mais amplo que se encaixa em torno do primeiro molde.
- Crie um bloco frio pelo envolvimento de um bloco de gelo com fita (adesivo para cima) e aderindo moldes para a fita.
- Crie um êmbolo, removendo o êmbolo de uma seringa de insulina 1 cc.
- Incorpore o organoids em um plugue de gel de histologia para processamento, seguindo o fluxo de trabalho representado na Figura 2A.
- Pelota organoids seguindo passos 2.1 – 2.7 e dissociar o gel da matriz.
- Lave o sedimento de organoides uma vez com 1 mL de HBSS re-pelota e girando para 3-5 min a 300 x g e retirar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet de organoides em 30 – 50 μL de gel líquido histologia. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo lentamente. Transfira a mistura de gel/organoides de histologia em um molde do bloco frio e permitir que a amostra esfriar e solidificar em um plugue.
- Utilize um êmbolo para empurrar o plugue fora do molde pequeno e no molde maior. Pipeta clara 2% agar em torno a ficha para preencher o molde maior.
- Pipete 2% tingido de corante histológico agar em cima a ficha para denotar o topo da amostra.
- Uma vez arrefecido, use um desentupidor para transferir o plug dentro de um estojo de histologia. Rotular a fita usando um lápis e lugar gaveta em 10% NBF para fixação durante a noite.
- A fita de transferência de 10% NBF para 70% grau histológico EtOH.
- Processo do gel de histologia conecte usando um protocolo pré-estabelecido biópsia em um processador, se disponível. Se a predefinição não está disponível, entrada a seguinte sequência e comprimentos: 70% EtOH por 6 min, 70% EtOH por 10 min, 80% EtOH por 10 min, 95% EtOH 2 vezes por 10 min, 100% EtOH 3 vezes por 10 min, xileno por 15 min por 3 vezes , e parafina por 15 min. por 3 vezes o recomendado Deviating sequência de processamento pode resultar em ruptura organoids (Figura 3A).
- Inserir a ficha do gel de histologia com a parte colorida voltada para cima, que permitirá a parte descolorida contendo o organoids para ser seccionado em primeiro.
- Seção a histologia FFPE gel blocos:
- Coletar suprimentos necessários: histologia FFPE gel blocos, caneta de histologia, banho de água do tecido flutuador, balde de gelo com gelo, micrótomo, lâminas do micrótomo, incorporação de estação de trabalho, carregados positivamente corrediças do microscópio e forno de laboratório.
- Banho de água de preenchimento até muito completo e conjunto a 40 ° C e, em seguida, forno pré-quente laboratório de 45-50 ° C.
- Preparar um balde de gelo, em seguida, encher com gelo e adicione água para criar uma pasta de água gelada. Refrigere os blocos de gelo até eles são muito frios.
Nota: Blocos podem ser definidos no gelo por até 1 dia, mas se deixada durante a noite, os blocos irão tornar-se hidratado e precisarão ser reprocessada. - Inserir um bloco na braçadeira de fita do micrótomo, adicionar a lâmina para o porta-navalha e desbloquear qualquer medidas cautelares de bloqueio na máquina.
- Comece por aparar o rosto do bloco de parafina (para) com uma espessura de 10 µm. Uma vez que uma seção que contém a área de plug emerge, parar o aparamento, travar o rotor micrótomo e transferir o bloco de volta para o gelo para descontrair. Se vários blocos devem ser seccionados, face-off cada bloco antes de passar para a etapa 4.5.6.
- Mova a lâmina para uma porção de nova, não... e transferir o bloco de volta para o grampo. Desbloquear a máquina e começar a aparar a 5 μm por seção.
Nota: para obter melhores resultados, recomenda-se 5 μm, mas 3 – 10 μm também é aceitável. - Usando uma pinça, a seção de transferência para o banho de água de 40 ° C e permitir que a seção para se espalharem. Transferi a secção numa lâmina mergulhando verticalmente na água.
Nota: Mergulhando em um ângulo pode transferir as bolhas do fundo da banheira para a seção e causar distorção da amostra. - Visualize a seção sob o microscópio (Figura 2BC).
Nota: Se um organoides presentes, parecerá semelhante a seta vermelha na figura 2B. Bolhas (Fig. 2B, seta azul) podem aparecer semelhantes ao organoids e são mais fáceis de discernir em um slide-fresco como secos organoids aparecer translúcido (Figura 2). Se não organoids estão presentes, seção ainda mais no bloco.
- Quando slides contendo organoids tenham sido adquiridos, circule a área ao redor da seção na parte de trás do slide com uma caneta de histologia e coza durante a noite em 45-50 ° C.
- Coletar slides e siga a H & E (consulte a etapa 4.9.1), imuno-histoquímica (consulte a etapa 4.9.2), ou imunofluorescência de coloração (Veja passo 5).
Nota: Resultados representativos são mostrados na Figura 3B.- Para executar H & E mancha, obter um kit de lista de materiais e seguir as especificações do fabricante.
- Para executar a coloração imuno-histoquímica, obter um kit e o anticorpo primário da lista de materiais e seguir as especificações do fabricante.
5. imunofluorescência coloração da FFPE e seccionado Organoids
- Coletar suprimentos: slide cozido da etapa 4, xileno, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, água deionizada (DI H2O), coplin frascos, 1 x antígeno recuperação solução (tampão citrato de sódio ou tampão Tris-EDTA), tampão fosfato de soro fisiológico (PBS), 5% (de soro de cavalo normal NHS) com detergente não-iônico de 0,1% em PBS, 1% albumina de soro bovino (BSA) com detergente não-iônico de 0,3% em PBS, cremalheira de coloração, coloração de prato, bem à câmara, caneta de barreira hidrofóbica, câmara de umidade, 1 ° e 2 ° os anticorpos de interesse e counterstains de interesse.
- Deparaffinize e Re-hidratar os slides por mergulhando coplins preenchido com as seguintes soluções: xileno (3 mergulhos, 5 min cada), 100% EtOH (2 mergulhos, 3 min cada), 95% EtOH (2 mergulhos, 3 min cada), 70% EtOH (2 mergulhos, 3 min cada) e DI H2O (2 mergulhos 3 min cada).
- Encher o prato de coloração com a solução de recuperação de antígeno e pré-aqueça bem à câmara a 100 ° C.
- Executar a recuperação do antígeno imergindo slides no prato pré-aquecido coloração e incubar durante 5-10 min a 100 ° C. Uma vez que o ciclo está completo, permitir que a câmara decloaking descansar por 20 min antes de abrir a tampa.
- Uma vez que o prato de slide esfriou a RT, coloque o prato coloração sob corrente DI H2O para enxaguar os slides por 5 min.
- Remover as lâminas do prato coloração, desenhar um círculo ao redor da amostra com uma caneta de barreira hidrofóbica e colocar o slide na câmara de umidade.
- Bloquear qualquer anticorpo específico coloração aplicando 5% NHS com detergente não-iônico de 0,1% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra (cerca de 30 μL é necessária para cobrir a amostra).
- Slides de lavagem em coplins preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada.
- Adicionar os anticorpos de 1° (Tabela de materiais), diluídos em 1% BSA com detergente não-iônico 0,3% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra (cerca de 30 μL deve cobrir a seção), então incubar durante 1 h no RT ou durante a noite a 4 ° C, em câmara de umidade.
- Lave as lâminas em coplins preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada.
- Adicione o anticorpo de 2° diluído em 1% BSA com detergente não-iônico 0,3% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra (cerca de 30 μL cobrirá a área), então incubar durante 1 h a RT na câmara de umidade.
- Lave as lâminas em coplin preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada.
- Adicionar DAPI, diluída-se para as especificações do fabricante, em 1% de BSA com detergente não-iônico 0,3% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra, e incube por 2 – 5 min em RT no escuro (30 μL).
- Lave as lâminas em coplins preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada.
- Montar as lâminas com mídia de montagem antidesgaste e lamela e, em seguida, Visualizar os resultados sob um microscópio.
6. toda a montagem de Organoids para a coloração imunofluorescente
- Coletar suprimentos: slide de câmara ou prato confocal, tampão fosfato salino (PBS), fixador, 50mm NH4Cl em PBS, 0,1% de detergente não-iônico em PBS, NHS 5% com detergente não-iônico de 0,1% em PBS, 1% de BSA com detergente não-iônico de 0,3% em PBS, 1 ° e 2 ° anticorpos de interesse e counterstains de interesse.
- Remova cuidadosamente a mídia tanto quanto possível sem interromper a cultura de organoides pipetando contra o lado do bem, deixando espaço entre mídia e matriz de gel.
- Usando uma aparada, pre-molhado com mídia ou PBS, 1.000 ponta da pipeta μL, elaborar uma gota (25 – 50 μL) de gel de matriz que contém o organoid(s) de interesse e dispensar no meio de um prato de bem ou confocal de slide do câmara.
Nota: 33% gel de matriz não é um sólido. É um fluido gelatinoso que manipula semelhante a uma gelatina que não totalmente definido. Uma ponta de pipeta aparadas com uma grande abertura impedirá organoids quebra durante as transferências. - Se organoids permanecem na cultura pai, substitua a mídia com mídia baseada em KSFM quente.
- Com o olho nu ou escopo de dissecação, Aspire o excesso de gel matriz e mídia no slide de câmara com uma pipeta de ponta fina (10-200 μL) de.
Nota: É opcional para pretreat o slide de câmara com um reagente de aderência. - Um volume igual de gel de matriz em um poço vazio do slide câmara da placa como um controle opcional para observar autofluorescência de matriz de sobra.
- Coloque o slide de câmara em uma incubadora de 37 ° C por 30-45 min promover os organoides para aderir ao vidro e evitar a perda de amostras durante as etapas de lavagem.
- Pipetagem lentamente para evitar o desprendimento de slide, lavar organoids com 200 µ l de PBS 1x por 5 min em RT, agitando suavemente.
- Remova o 1X PBS e correção com 200 μL de paraformaldeído 4% durante 30 min à RT agitando suavemente. Certifique-se de que o gel da matriz aparece claro após esta etapa.
Nota: Fixação de metanol ou formalina também são possíveis. Método de fixação deve ser otimizado para anticorpos específicos, como certos métodos de fixação podem crosslink os antígenos de interesse ou saciar fluorescente-rotulagem-proteínas de interesse. - Retire o fixador e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.
Nota: O comprimento das etapas de lavagem deve ser otimizado dependendo do tamanho de organoides. Cinco minutos é um ponto de partida suficiente, mas a etapa de lavagem pode ser alongada, conforme necessário. - Saciar a autofluorescência com 200 μL de 50mm NH4Cl em 1X PBS durante 30 min à RT agitando suavemente.
Nota: Este passo saciarão autofluorescência de detritos no lúmen dos organoides e da expressão da proteína fluorescente (tais como GFP) que pode apresentar do delineamento experimental. Deve ser incluído se for desejado para usar um fluoróforo no canal 488, mas pode ser ignorada se desejar preservar o sinal GFP. - Remova NH4Cl e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.
- Permeabilize organoids em 200 µ l de detergente não-iônico 0,1%-100 em 1X PBS durante 30 min à RT agitando suavemente.
- Remova o detergente não-iônico-100 de 0,1% em 1X PBS e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.
- Bloco com 5% de NHS com 200 μL de detergente não-iônico 0,1% X-100 em PBS e incubar por 60 min em RT, agitando suavemente.
- Retire o tampão de bloqueio e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.
- Diluir o anticorpo 1° em 1% de BSA com 0,3% Triton X-100 em PBS 1x e adicionar a 200 μL do slide câmara e, em seguida, incubar 1 – 3 dias a 4 ° C.
- Remover o anticorpo de 1° e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.
- Diluir o anticorpo de 2° em 1% de BSA com 0,3% Triton X-100 em PBS 1x e adicionar a 200 μL do slide câmara e, em seguida, incubar 1 – 3 dias a 4 ° C, no escuro.
Nota: O comprimento dos tempos de incubação deve ser otimizado para anticorpo e tamanho de organoides. Alguns exigirá mais tempo para penetrar os organoides. Concentração de anticorpo também precisará ser otimizado. Em geral, 2x a concentração utilizada para as seções FFPE é apropriada para detecção de anticorpos de 1° e a mesma concentração para seções FFPE é apropriada para detecção de anticorpos de 2°. - Remover o anticorpo de 2° e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.
- Counterstain a actina com faloidina e o núcleo com DAPI ou Hoescht, diluída de acordo com as recomendações do fabricante em 1% de BSA com 0,3% Triton-X em 1X PBS. Adicionar 200 μL a câmara slide e, em seguida, incubar a RT por 40 min no escuro.
- Montar em 200 μL de frescos 1X PBS ou mídia de montagem e imagem imediatamente (fluorescência deve ser preservada por até 5 dias, se não mais). Resultados representativos são mostrados na Figura 3.
Nota: A azida de sódio pode ser adicionada para amostras para evitar a contaminação, se imagem latente confocal não está prontamente disponível. Adicionar um despachante pode melhorar a imagem.
7. toda a montagem de Organoids para ensaios e sondas fluorescentes
Nota: Existem ensaios disponíveis comercialmente e sondas/corantes fluorescentes (exemplos são incluídos na lista de materiais) alteráveis para uso na organoids todo montado para observar uma variedade de pontos de extremidade útil19. O seguinte protocolo é para o kit de proliferação EdU fluorescente etiquetado, no entanto, qualquer jogo pode ser modificado para uso com uma amostra de todo montado.
- Cuidadosamente retire 50 μL de mídia e substituir com 50 μL de 20 μM 2 x EdU solução de trabalho, pipetando contra o lado do bem, deixando espaço entre mídia e matriz de gel.
- Incube a 4 ° C por 1 – 3 dias (a duração desejada para a incorporação de EdU deve ser otimizada para o tipo de célula de escolha).
- Siga os passos 6.2 – 6,8 para transferir o organoids de interesse em um slide de câmara ou prato confocal.
- Remover o PBS e corrigir com 200 μL de paraformaldeído 3,7% durante 30 min à RT agitando suavemente. Certifique-se de que a matriz de gel aparecem claras após esta etapa.
- Retire o fixador e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Remova o PBS e adicione 200 μL de detergente não-iônico de 0,5%-100 em 1X PBS durante 30 min à RT agitando suavemente.
- Prepare um 1x fluorescente reação cocktail de acordo com as especificações do fabricante.
- Remover o detergente não-iônico de 0,5%-100 e lave duas vezes com 200 μL de BSA de 3% em PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.
- Adicione o cocktail de reação e incube por 30 min em RT no escuro.
- Remova a reação fluorescente cocktail e lave uma vez com 200 μL de 3% BSA em PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Corante de contraste e montagem, seguindo os passos de 6,21 – 6.22 (Figura 3D).
Representative Results
Cultura bem sucedida de organoids de próstata primário humana, morfologia e diferenciação podem ser avaliadas usando análise de imagem de campo brilhante e FFPE e técnicas de coloração de toda a montagem.
O processo de captura de imagem de campo claro é ilustrado na figura 1A. Organoids são crescidas em uma matriz 3D e dispersos em diferentes planos focais. Para observar organoids em foco através de muitos aviões, é aconselhável para usar uma imagem do FED (figura 1B, direita) em vez de um único plano z (figura 1B, à esquerda). No laboratório, organoids cultivadas sob diferentes condições experimentais podem resultar em alterações na morfologia. Usando a área, circularidade (definido por como semelhante a organoides é um círculo) e raio de min/max (medida de comprimento) dar aos usuários uma indicação da forma e tamanho de organoides e fornecem uma leitura quantificável da morfologia. Para enfatizar a utilidade destas medidas, imagens representativas de organoids com área semelhante mas morfologia diferente são mostradas na Figura 1, na qual uma longa organoides serão menos circular e têm uma relação de máximo/mínimo maior do que um esférico organoides.
Incorporação de organoids para a histologia é um ponto de extremidade útil para observar o interior das amostras e certifique-se de que necrose que não está presente dentro do núcleo de um organoides. Um fluxo de trabalho para este processo e resultados representativos das amostras sob um microscópio de campo claro imaculados, seccionados são fornecidos na Figura 2AB, C. A figura 3A mostra um organoides mal-cuidada (à esquerda) em comparação com devidamente entregue organoids na Figura 3A (à direita) e Figura 3B. Para determinar o estado de diferenciação da amostra, é recomendável olhar basocelular marcadores (citoqueratinas 5 e p63)8 juntamente com célula luminal marcadores (citoqueratina 8)8. Se se deseja manchar organoids em situ, manchando toda a montagem é uma alternativa conveniente, e esses resultados representativos são fornecidos na Figura 3D.
Figura 1: avaliação da morfologia de organoids na cultura 3D. (A) imagem coleção e compactação de fluxo de trabalho humano organoids de próstata primário adquirido por uma luz transmitida invertido microscópio com uma motorizada X / Y, palco e companheiro software de digitalização. (B) imagens representativas de um único z-pilha (esquerda) vs. uma imagem de FED (à direita) de uma amostra de todo o bem de organoids de próstata primário humano, mostrando que mais organoids estão no foco quando z-pilhas múltiplas são combinados em uma única imagem projetada (barra de escala = 1000 µm). (C) imagens representativas para a proporção de área, circularidade e min/max de morfologicamente diferentes humano primário organoids da próstata que tenham a mesma área (barra de escala = 200 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: organoides incorporação de fluxo de trabalho e representante resultados de corte. (A) humana organoides de próstata primário, incorporação de fluxo de trabalho. (B) imagem representativa de um slide imaculado, fresco, contendo organoids de próstata primário humano sob um microscópio de campo claro retratando o ágar (seta verde), gel de histologia (seta preta), bolha (seta azul), organoids (setas vermelhas) (barra de escala = 1000 µ m). (C) Unstained recém cortadas slide (à esquerda) vs. unstained slide seco (à direita), organoids (setas vermelhas) aparecer translúcidos quando seco (barra de escala = 500 µm) e são mais difíceis de discernir sob um microscópio de campo claro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: coloração histológica sobre organoids secionado e todo montado. (A) H & E mancha de um quebrado organoides humano primário da próstata de manuseio incorreto (pipetagem agressivo, protocolo de tratamento errado, esquerda) ao lado de um bem manuseada organoides (à direita) (barra de escala = 100 µm). (B) humana organoides próstata primário que foram fixada em formol, parafina, seccionado e corados com citoqueratinas basais 5 ou luminal citoqueratina 8 (em cima) ou basal p63 e luminal citoqueratina 8 (fundo) e fotografada com microscópio confocal ( barra de escala = 100 µm). (C) um conjunto montado humana primária da próstata organoides manchado com citoqueratinas basais 5 ou 8 a citoqueratina luminal e counterstained com faloidina e DAPI, fotografada com microscópio confocal (barra de escala = 100 µm). (D) um organoides montado todo humano primário da próstata de células coradas com fluorescente etiquetado EdU e contador manchado com Hoescht, fotografada com microscópio confocal (barra de escala = 500 µm) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Cultura de organotypic é um excitante novo método de recapitulando o tecido com a praticidade de um ambiente em vitro . Atualmente, os laboratórios crescem organoids de muitos tipos de tecidos para vários pontos de extremidade. Os métodos descritos neste artigo resumem úteis pontos de extremidade e destacam as novas técnicas para caracterizar totalmente culturas 3D primário de células da próstata.
Há uma variedade de receitas de meios de cultivo primário de células da próstata humana organoids5,6,13. Enquanto todos alcançar resultados comparáveis e viáveis, mídia baseada em KSFM13 usa aditivos mínimos então é descrito aqui. Além disso, os papéis foram publicados usando várias concentrações para o gel de matriz, de 10% a 75% para a cultura da próstata organoids5,6,13. Porque a matriz gel é um reagente caro, e 33% gel de matriz foi mostrado para ser suficiente para cultivar a longo prazo (2-3 semanas), viável, unclumped organoids13, esta é a concentração recomendada. No entanto, gel de matriz pode variar na concentração de proteínas entre números de lote, portanto isso deve ter em conta quando o chapeamento. Também é aconselhável comprar gel de matriz a granel para uso em vários experimentos para reduzir inconsistência entre lotes. Outros laboratórios publicaram diferentes formatos para chapeamento gel de matriz, tais como as gotas em vez de uma placa de 96 poços bem5de revestimento. Ambos os métodos formam organoids viável, mas o formato descrito aqui permite células a ser chapeado mais escassa, que foi mostrado para promover a expansão de células em maior organoids13. No entanto, chapeamento densidade deveria ser otimizado baseado fora de eficiência de formação específicos do paciente. Gel de matriz está disponível em vários formatos, incluindo o fator de crescimento reduzido, vermelho de fenol-livre, alta concentração, etc. Fator de crescimento reduzido é indicado para condições de cultura definidas e livre de vermelho de fenol é recomendado quando se trabalha com células que expressam o GFP ou em experimentos que envolvem a captura de imagem de z-pilha. É fundamental que as etapas de chapeamento de gel de matriz ser realizada com reagentes gelados, como gel de matriz rapidamente se solidifica à temperatura ambiente.
Organoids cultivado sob diferentes tratamentos experimentais podem resultar em alterações à forma, então brilhante-campo imagem é amplamente utilizada para o estudo de fenótipos morfológicos observados. Não obstante, gravação e quantificar a área ou a forma são um desafio por duas razões: viés de seleção 1) durante a captura de imagem e 2) aplicando um parâmetro bidimensional como área para uma amostra tridimensional. Uma estratégia de captura de imagem é gravar um campo aleatório e medir um número predeterminado de organoids nesse campo, mas isso pode criar preconceito durante a seleção, e todos os organoids no campo selecionado não pode estar em foco. Imagem de todo bem otimizada para o formato de microplacas de 96 poços elimina este viés de amostragem através da recolha de organoides toda população de interesse. No entanto, dependendo dos objectivos de microscópio na mão, vários campos podem precisar ser coletados e lado a lado a fim de obter uma imagem de todo o bem. Alguns laboratórios têm descrito a área de medição de um único plano z12, mas para capturar todos os organoids em foco, é aconselhável coletar e empilhe vários aviões em uma única imagem-FED13. Em alguns casos, um menisco no gel matriz pode causar vinhetas na imagem, e métodos de correção de fundo talvez precise ser aplicada usando software de análise de imagem. Volume exato idealmente é a medida mais adequada para o tamanho de organoides; no entanto, é difícil obter precisamente, mesmo com várias imagens de z-pilha. Outras dimensões morfológicas úteis, tais como a circularidade e rácio máximo/mínimo, podem ser facilmente calculados de todos os organoids em uma imagem do FED de todo bem. Juntos, esses métodos superar desafios viés de amostragem e permitem a medição de parâmetros 2D de objetos 3D em um espaço 3D.
Fixação de formalina e parafina incorporação de organoids é um método comum para obter hematoxilina e eosina (H & E), imuno-histoquímica (IHC) e imunofluorescência (IF) mancha para visualização e análise6,11, 20. no entanto, publicações que têm descrito esta técnica faltam detalhes abrangentes sobre o processo de incorporação. Além disso, localizar organoids dentro do bloco de parafina pode ser desafiador. Alguns laboratórios pre-mancham organoids com trypan azul antes da incorporação para auxiliar na localização durante o corte de11. O método descrito aqui incorpora o uso de um corante histológico para orientação do gelplug de organoides/histologia durante a incorporação para promover a eficiência de corte. Slides de H & E facilitam o exame de necrose e proliferação nuclear textura, e, portanto, deveria ser um ponto de extremidade obrigatório para cultura de organoides para garantir que as células são saudáveis em toda a esfera. A força da cultura de organoides é que as amostras são compostas de uma mistura heterogênea de células que se assemelham a melhor na vivo paciente tecido. Na próstata, por exemplo, células basais e luminal estão presentes na próstata organoids5, enquanto as células cultivadas em 2D falta diferenciação luminal8. Para avaliar a diferenciação de organoides, recomenda-se que os pesquisadores avaliem marcadores basais como CK5 e p63 e luminal marcadores como receptores de andrógeno e CK88. Qualquer outras proteínas experimentais de interesse também podem ser estudadas usando essas técnicas de coloração.
Apesar de seções FFPE permitem a visualização de células que residem no interior do compartimento através de histológica métodos (H & E, se, IHC), limitam-se imagens de secções transversais e organoides forma pode ser alterada pelo processo de incorporação. Toda a montagem de coloração permite um organoides ser manchado e observada em situ, preservando fenótipos morfológicos e permitindo imagens da localização da proteína. Toda a montagem é uma ferramenta utilizada para manchar todo-tecido ou todo-animal espécimes, tais como o embrião do zebrafish ou mouse e é facilmente adaptada para organoids. A técnica descrita aqui foi modificada do procedimento por Mahéet al 11, que detalha o crescimento inicial e cultura de organoids gastrointestinal diretamente em um slide de câmara para a coloração e requer a fixação da cultura inteira de pai. O método descrito aqui envolve a transferência de um único organoides (ou organoids) de interesse numa lâmina de câmara no momento da coloração. Isto permite a seleção de organoids individual para análise de toda a montagem em um experimento em andamento sem fixação da cultura do pai. Ao realizar a coloração de toda a montagem, é necessário otimizar a permeabilização e o tempo de incubação para anticorpos primários e secundários garantir a penetração em toda a amostra (em qualquer lugar de um ou mais dias é recomendado). Uma vez que a criação da imagem através de microscopia confocal, renderings 3D podem ser produzidos para permitir a visualização e localização de uma proteína específica e calcular o número de células coradas positivamente presentes em uma amostra. Citometria de fluxo é um ponto de extremidade úteis para quantificar as populações da basal, luminal, ou tronco células5,14. Para fazer isso, as células são recuperou o gel da matriz e dissociadas suavemente para a coloração. Os usuários devem cuidadosamente selecionar marcadores apropriados para a separação com base na literatura atual. Para humanas células epiteliais da próstata primárias, CD26 e CD49f são marcadores luminal e basais adequados, respectivamente,5,21.
Em resumo, este protocolo detalha crescimento humano primário da próstata organoides, coleção e pontos de extremidade experimentais. Digno de nota, a técnica de montagem descrita pode ser aplicada a uma variedade de outros ensaios que são normalmente empregados para pilhas 2D, tais como fluorescentes experiências baseadas em investigação olhando para manchas das organelas subcelulares, apoptose e proliferação19. Além disso, o método de coleta e dissociação descrito aqui poderia ser utilizado na preparação para uma única célula de sequenciamento de RNA18. Coletivamente, isso demonstra a possibilidade para uma variedade de romance, pontos de extremidade de alta-fidelidade que pesquisadores podem otimizar e explorar no futuro.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos os membros da UIC Biorespository, Dr. Klara Vinicius-Nagy e Alex Susma, bem como os urologistas, DRS Michael Abern, Daniel Moreira e Simone Crivallero, para facilitar a aquisição de tecido para as culturas de célula primária. Agradecemos os pacientes UIC Urologia para doar seus tecidos para pesquisa. Este trabalho foi financiado, em parte, pelo departamento de defesa próstata câncer pesquisa programa saúde disparidades ideia prêmio PC121923 (Nonn) e o centro de UIC para clínicos e tradução ciência Pre-doctoral educação para clínicos e cientistas translacional ( Programa bem) (McCray e Richards) e pelo Instituto Nacional do câncer o National Institutes of Health, Grant números U54CA202995, U54CA202997 e U54CA203000, conhecido como a saúde Chicago Equity colaborativo (Nonn e Richards). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos institutos nacionais de saúde ou do departamento de defesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
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