Summary
Her presenterer vi en protokoll for veiledning om menneskets primære prostata organoid håndtering så foreslår endepunktene for å vurdere fenotypen. Såing, kultur vedlikehold, utvinning fra matrix gel, er morfologiske kvantifisering innebygging og skjæring, FFPE skjæring, hele-mount flekker og anvendelse av kommersielle analyser beskrevet.
Abstract
Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for tredimensjonale (3D) dyrking, håndtering og evaluering av menneskelig primære prostata organoids. Prosessen omfatter såing av epitelceller tynt i en 3D matrix gel på en 96-brønnen microplate med media endringer å dyrke ekspansjon i organoids. Morfologi vurderes deretter av hele-og fangst av z-stakk bilder. Komprimering av z-stabler oppretter ett i fokus bilde som organoids måles for å kvantifisere ulike utganger, inkludert sirkularitet, rundhet og området. DNA, RNA og protein kan hentes fra organoids fra matrisen gel. Celle populasjoner av interesse kan bli vurdert av organoid dissosiasjon og flow cytometri. Formalin-fiksering--parafininnstøper (FFPE) etterfulgt av skjæring brukes til histologiske vurdering og antistoff flekker. Hele-mount immunofluorescent flekker bevarer organoid morfologi og forenkler observasjon av protein lokalisering i organoids i situ. Kommersielle analyser som tradisjonelt brukes for 2D monolayer celler kan endres for 3D organoids. Teknikkene i denne protokollen brukes sammen, og gir en robust verktøykasse for å kvantifisere prostata organoid vekst, morfologiske egenskaper og uttrykk for differensiering.
Introduction
Organoids er et verdifullt verktøy for å studere organogenesen og sykdom. De gir et billigere alternativ til dyremodeller og pasient-avledede organoids er utvikling som en strategi for personlige medisin1,2,3. Tredimensjonale (3D) kultur systemet innebærer seeding stammen eller progenitor celler (høstet fra vev eller indusert pluripotent stamceller) i en gel ekstracellulær matrix komponenter (matrise gel)4. Cellene spredning og differensiere, som resulterer i organotypic strukturer som recapitulate mobilnettet hierarkiet og morfologi av orgelet av interest funksjonell enhet. Organoids har vokst med celler fra forskjellige organer, inkludert salivary kjortelen, mage, tarm, lever, prostata, lunge og hjernen4. Men det er flere protokoller som beskriver fremgangsmåten for å opprette prostata organoids5,6, er det utfordrende å finne tilstrekkelig detaljert metoder på hvordan å oppnå kvantitative endepunkter fra organoids. Denne artikkelen oppsummerer metoder utviklet for menneskelig primære prostata celler og detaljer en rekke foreslåtte endepunktene å vurdere organoid fenotyper. Disse teknikkene var optimalisert for prostata organoids og kan anvendes på andre 3D cellekulturer.
Prostata organoid kulturer har nylig dukket opp som en verdifull i vitro modell som mangler begrensningene for monolayer kulturer bruker etablert udødeliggjort linjer. Godartet prostata epitel og prostatakreft er utfordrende modell i vitro bruker udødeliggjort linjer. Godartet cellelinjer er begrenset, og alle har gjennomgått en transformasjon med oncogenes7. Primære prostata epitelceller i monolayers ikke skille ut luminal celler og mangler androgen reseptorer8. Flertallet av prostatakreft cellelinjer har ikke funksjonelle androgen reseptorer, en betydelig megler til tidlig sykdom og manglende viktige genetiske endringer som har blitt funnet i pasienten svulster9. Prostata organoid kulturer kan dyrkes lett fra godartet epitel og er verdifulle i å studere stamcelleforskningen egenskaper, stamfar celler, differensiering og effekter av eksperimentell endringer i microenvironment4,5. Prostatakreft organoids kan dyrkes som del av en presisjon medisin tilnærming til modellering pasientens sykdom og respons på behandling10.
Denne protokollen er utarbeidet fra eksisterende protokoller som bruker ulike celletyper, men det er optimalisert her for bruk i menneskelig primære prostata celler. Den komplementerer protokoller skissert av Sawyers, Clevers og Shen5,6 som beskriver vekst, passaging, lyse-feltet bildebehandling, kryonisk bevaring og RNA og DNA isolering av prostata musen og menneskelige organoids. Hele-mount protokollen endres fra Mahé et al. 11, som brukte gastrointestinal epithelial organoids og beskriver live bildebehandling og frosne og parafinen innebygging. Borten et al. 12 beskrevet analyse av bryst, tykktarm og endetarmskreft organoid morfologi lyse-feltet bildebehandling. I tillegg Richards et al. 13 brukte en metode for morfologiske vurdering av prostata organoids. Til slutt, Hu et al. 14 beskrevet en metode for å overholde prostata organoids et kammer lysbilde over natten før den immunofluorescent flekker å observere enkeltceller og spredning av kuler for flyt cytometri analyse.
Målet med denne protokollen er å demonstrere i tilstrekkelig detalj metodene teknisk utfordrende som en protokoll, inkludert celle frø; Media og matrix gel vedlikehold; samlingen av celler for flowcytometri; RNA og DNA protein utvinning; morfologiske vurdering fra lyse-feltet z stabel analyse; embedding, behandling og snitting til histologiske farging; og hele-montering for immunofluorescence eller fluorescerende sonde analyser. Biologiske relevansen og tolkning av disse ulike endepunktene varierer blant eksperimentell design og antistoffer brukes til analyseformål. Gjennom utnyttelse av denne protokollen, bør brukere føler forberedt på å sette opp et eksperiment med et verktøysett for endepunkt.
Menneskets primære prostata (PrE) epitelceller ble etablert i laboratoriet av protokollen beskrevet av Peehl15,16 og vedlikeholdes til et begrenset antall ganger (opptil fire) som beskrevet tidligere17, men de er også tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Hepatocyte serum-free mediebasert6, KSFM-baserte13og R-spondin 1-conditioned5 medier publiseres alle som har produsert organoids. KSFM-baserte krever færrest tilsetningsstoffer, slik det er beskrevet her.
Protocol
Følgende protokollen var optimalisert med menneskelige primære prostata epitelceller høstet fra pasienten vev på University of Illinois i Chicago Hospital. Alle menneskelige vev brukes for disse eksperimentene ble ervervet via en institusjonell Review Board-godkjent protokollen og/eller unntaket på University of Illinois i Chicago. Mens kultur betingelsene varierer avhengig av hvilken celle interesse kan endepunktene brukes til organoids av andre vev.
1. såing av epitelceller Matrix Gel og endre medie
- Samle nødvendig materialer: menneskelig primære prostata epitelceller (PrE), matrix gel på is, 96-brønnen microplate, keratinocyte serum-frie medier (KSFM) på is, trekull strippet fosterets bovin serum (FBS) og dihydrotestosteron (DHT).
- Forberede KSFM-baserte organoid media ved å kombinere 47,5 mL KSFM med 2,5 mL av trekull strippet FBS og dihydrotestosteron (DHT) å en final konsentrasjon av 10 nM DHT, så reserve på is.
- Plate celler i en 3D matrix i celle kultur hette med steril teknikk.
- Forsiktig blanding kalde KSFM-baserte organoid media med iskald matrix gel å få en 50% matrise gel blanding av sakte pipettering opp og ned, unngå bobler.
Merk: Matrix gel bør tint natten på 4 ° C og holdt på is mulig. Det stivner raskt ved romtemperatur (RT). - Pre våt en pipette tips i kalde medier og overføringen 40-50 μL av 50% matrise gel på bunnen av hver brønn som skal brukes på en 96-brønns plate. Coat bunnen av brønnen til en base lag.
Merk: Ikke fullt dispensere til andre stopp på pipette, som dette kan skape bobler. - Plass platen 96-brønnen i 37 ° C inkubator i 30-45 minutter å størkne bakgrunnslaget.
Merk: Ikke plate epitelceller på bakgrunnslaget før det har styrket, eller celler kan falle gjennom matrisen på bunnen av platen og vokse som en monolayer. - Bland epitelceller suspendert i KSFM-baserte organoid media med matrix gel å oppnå en siste konsentrasjon av 100-1000 celler/100 μL og 33% matrix gel. Plate epitelceller på base lag med 100 μL av 33% matrix gel/mobiltelefon blanding per brønn.
Merk: Tidligere eksperimenter har vist at seeding epitelceller for tett i 3D vil begrense størrelsen på organoid vekst, mens seeding for tynt kan resultere i svært lav avkastning13. Det er viktig å optimalisere seeding betingelser for celle type rente, basert på pasient-spesifikke organoid formasjon effektiviteten.
- Forsiktig blanding kalde KSFM-baserte organoid media med iskald matrix gel å få en 50% matrise gel blanding av sakte pipettering opp og ned, unngå bobler.
- Plasser 96-brønns platen i en 37 ° C inkubator i 30-45 minutter å tillate matrix gel å stivne og forsiktig Tilsett 100 μL av KSFM-baserte organoid media øverst celler av pipettering sakte mot kanten av brønnen.
- Endre media hver 2-3 dager. Pipettering mot siden av brønnen med mellomrom mellom media og matrix gel, nøye fjerne 50 μL av media og erstatte med 50 μL av fersk media.
Merk: For en langsiktig kultur, matrix gel må endres hver 2-3 uker. Hvis matrise gel kulturen vises ustabile og viser gjennomsiktig rynker under mikroskopet, deretter matrix gel har brutt ned og må erstattes.
2. samling av Organoids fra Matrix Gel
Merk: Samling av organoids er nødvendig for matrise gel endringer, passaging eller endepunktene på RNA utvinning, DNA utvinning, protein utvinning og flowcytometri.
- Varm nøytral protease og Hanks' balansert salt løsning (HBSS) i et 37 ° C vannbad.
- Nøye Fjern medier fra brønner uten å forstyrre matrix gel.
- Tilsett ~ 200 μL i nøytral protease hver brønn på ~ 1:2 forholdet mellom matrix gel: nøytral protease og Inkuber etter 20 min på 37 ° C.
- Mekanisk distansere matrix gel: nøytral protease blandingen av pipettering opp og ned.
- Inkuber etter 20 min på 37 ° C.
- Overføre nøytral protease matrise gel-celle blandingen til et microcentrifuge rør eller konisk tube, avhengig av volumet. Sentrifuge på 300 x g for 3-5 min til pellets celler.
Merk: Hvis ingen celle pellet vises, matrix gel kan ikke bli helt atskilt og kan visualiseres som en gjennomsiktig fase nederst på røret forskjellig fra rosa nedbryting. Fjerne nedbryting og legge mer nøytral protease i 1:2 forholdet til matrise gel pellet, ruge for en annen 20-40 min ved 37 ° C og gjenta sentrifugering på 300 x g. - Når en organoid pellets anskaffes, fjerne nedbryting. Fortsette med passaging (se trinn 2.7.1), organoid lysis for RNA og DNA protein utvinning (se trinn 2.7.2), behandling single celler ved flowcytometri, og encellede sekvensering (se trinn 2.7.3).
- For langsiktige kultur, forsiktig resuspend intakt organoids i 33% frisk matrix gel og platen ved å følge fremgangsmåten i trinn 1.1-1.5. Å distansere organoids og replate som enkelt celler, resuspend pellet i 1 mL av varm celle-dissosiasjon enzymer og ruge på 37 ° C i 10-15 min, vask en gang med 5 mL av HBSS, og nytt plate i frisk matrix gel følge trinnene 1.1-1.5.
- Resuspend organoid pellets i en passende lyseringsbuffer RNA utvinning, DNA utvinning eller protein utvinning som er oppført i Tabellen for materiale og følger produsentens protokollen.
- Resuspend organoids i 1 mL av varm celle-dissosiasjon enzymer og ruge på 37 ° C i 10-15 minutter å dissociate organoids i enkeltceller. Vask en gang med 5 mL HBSS og fortsette med protokollen for flyt cytometri5 eller encellede sekvensering18.
Merk: Hvis du vil oppheve tilknytningen til enkeltceller i lave konsentrasjoner av matrix gel, den nøytrale protease kan ikke være nødvendig, og celle-dissosiasjon enzymer kan brukes direkte til brønnen etter trinn 2.2.
3. hele-vel bildeopptak og analyse av Organoid morfologi
- Få hele-og z-stakk bilder med overføres lett invertert mikroskop med motoriserte X / Y skanning scenen (arbeidsflyt illustrert i figur 1A).
- Fokal posisjonen justert til bunnen av brønnen, begynne å fokusere oppover til den første organoid er oppstått, som vil være i sentrum av brønnen på grunn av meniscus fra bakgrunnslaget. Angi bunnen z-flyet på denne plasseringen.
- Fortsette å fokusere oppover til den siste organoid er i fokus, som vil være i utkanten av brønnen. Angi øverst z-flyet på denne plasseringen.
Merk: Når toppen og bunnen av z-stakken, sikre at disse stillingene fange organoids innen alle gjenværende brønner og justere topp/bunn etter behov. Dette gir z-området som skal brukes for et enkelt søk som inneholder alle organoid i hver brønn. - Ta 15-35 z-fly per brønn, med et større antall for høyere oppløsning. Ta hele godt bildet, flette og samle kvadranter eller underdeler hvis nødvendig.
Merk: Det anbefales å ta flere z-fly i motsetning til en z-fly, som vist i figur 1B der organoids er ute av fokus når du tar bare en z-fly. - Lagre z-stakk bilder for nedstrøms.
- Analysere bilder ved hjelp av programvare med frihåndsform tegnefunksjonene.
- Åpne en enkelt z-plane bilde fra trinn 3.1.4.
- Hvis nødvendig, Still opp bilder tatt på hvert individuelle z-plan til en enkelt hele-godt bilde. Lagre det nye bildet som en separat fil. Gjenta denne prosessen for hver z-plane ervervet.
- Bruker programvare, åpne hele-vel bildet for hver z-fly fra en enkelt brønn og opprette en utvidet dybde på feltet (EDF) bilde fra av z-fly.
Merk: Denne typen bilde vil velge den beste fokus regionen hver z-fly å opprette ett i fokus bilde av brønnen. - Angi piksel omfanget av programvaren i skala-feltet for bildet som måles.
- Bruker Frihåndsform tegneverktøyet bildet programvaren, spor omkretsen av hver organoid i brønnen.
- Få måling beregningene for spores organoid perimeters bildet programvaren.
Merk: Anbefalt parametere er området og sirkularitet maksimum/minimum radius-forhold. Representant resultater illustrerer bruken av disse beregningene er vist i figur 1 c. Området beregnes fra polygonen definert av den organoid omkretsen. Sirkularitet er forholdet mellom organoid til arealet av en sirkel med en diameter lik organoid's maksimal oppspore, der 0 er mindre sirkulære og 1 er sirkulær området. Maksimum/minimum radius er forholdet mellom maksimal radius og minimum radius av spores organoid.
Sirkularitet =
RADIUS-forhold =
4. formalin fiksering og parafin innebygging av Organoids for histologiske endepunkter
- Forberede innebygging rekvisita: HBSS, 2% agar løsning, histologiske merking fargestoff, histology gel, Pipetter tips mold, tape, stempelet fra en 1 cc insulin syringe, is pack, kassetter, 10% nøytral bufrede formalin (NBF), blyant og 75% histologiske klasse etanol (EtOH).
- Forberede to microcentrifuge rør 2% agar løsning. Inkuber i et vannbad eller på varme blokk ved 100-110 ° C å opprettholde agar i flytende form. Legge til 1-2 dråper histologic merking fargestoff til en av de 2% agar løsningene, som vil angi øverst i agar plugg og bistår i å opprettholde retning under innebygging. Bland godt.
- Varme histology gel i en vann bad eller varme blokk på 55-65 ° C.
- Bruk et 1000 μL pipette tips opprette formene ved å kutte ut en liten del av pipette-tips for å gjøre en sylinder som inneholder ~ 50 μL. Opprette en andre, bredere mold som passer rundt første mold.
- Opprette en kald blokk ved å pakke en isen pack med tape (selvklebende siden opp) og følge formene på båndet.
- Opprette en stempelholderen ved å fjerne stempelet fra en 1 cc insulin syringe.
- Legge til organoids i en histology gel plugg for behandling, etter arbeidsflyten avbildet i figur 2A.
- Distansere matrix gel og pellets organoids ved å følge trinnene 2.1-2.7.
- Vask organoid pellets gang med 1 mL av HBSS og re pellets ved spinning i 3-5 min på 300 x g og fjerne nedbryting.
- Nytt avbryte organoid pellets 30-50 μL av flytende histology gel. Bland forsiktig ved pipettering opp og ned sakte. Overføre histology gel/organoid blandingen i en mold på kalde blokken og la prøven Avkjøl og stivne i en plugg.
- Bruk en plunger for å presse pluggen fra små mold og til større mold. Pipetter klart 2% agar omkring pluggen fylle større mold.
- Pipetter histologic dye-fargede 2% agar på pluggen til å angi øverst i utvalget.
- Når avkjølt, bruk en plunger overføre pluggen til kassetteninn histology. Etiketten kassetten med en blyant og sted kassett til 10% NBF for fiksering over natten.
- Overføre kassetten fra 10% NBF 70% histologiske klasse EtOH.
- Prosessen histology gel plugg bruker en pre-set biopsi protokoll på en prosessor, hvis tilgjengelig. Hvis forhåndsinnstilling ikke er tilgjengelig, angi følgende sekvens og lengder: 70% EtOH for 6 min, 70% EtOH for 10 min, 80% EtOH for 10 min, 95% EtOH 2 ganger i 10 min, 100% EtOH 3 ganger i 10 min, xylen 3 ganger i 15 min , og parafin 3 ganger i 15 min. avvikende fra de anbefalte behandlingsrekkefølge kan medføre brudd organoids (figur 3A).
- Legge histology gel pluggen med den fargede delen vender opp som dette vil tillate misfargede delen inneholder organoids til deles inn første.
- Seksjon FFPE histology gel blokker:
- Samle nødvendige forsyninger: FFPE histology gel blokker, histology penn, vev flyter vannbad, is bøtte med is, mikrotomen, mikrotomen kniver, innebygging arbeidsstasjon, positivt ladet objektglass og laboratoriet ovnen.
- Fyll vannbad til veldig full og satt til 40 ° C og pre varme laboratorium ovnen til 45 – 50 ° C.
- Forberede en isen bøtte, og fyll med is og legge vann for å lage en isen vann slurry. Chill blokkene på is inntil de er veldig kaldt.
Merk: Blokker kan angis på is for opp til 1 dag, men hvis venstre over natten, blokker vil bli hydrert og må behandles. - En blokk inn mikrotomen kassettklemmen, legge til bladet knivholderen og låse opp alle låser beskyttelsestiltak på maskinen.
- Begynner ved å skjære ansiktet av parafin blokken (vendt) på 10 µm tykkelse. Når en del fremstår som inneholder området plug, stoppe trimming, låse mikrotomen rotoren og overføre blokken tilbake på isen for å chill. Hvis flere blokker skal deles, blokkere face-off hver før du går til trinn 4.5.6.
- Flytte bladet i en ny, ubrukte delen og overføre blokken tilbake til klemmen. Lås opp maskinen og starte trimming på 5 μm per seksjon.
Merk: 5 μm anbefales for best resultat, men 3-10 μm er akseptabelt. - Ved hjelp av pinsett, overføre delen til 40 ° C vannbad og la delen å fordele. Overføre delen på et lysbilde ved å dyppe loddrett i vannet.
Merk: Dyppe i en vinkel kan overføre bobler fra bunnen av badekaret til delen og forårsake forvrengning av prøven. - Visualisere delen under mikroskopet (figur 2BC).
Merk: Hvis en organoid finnes, vises ligner på den røde pilen i figur 2B. Bobler (figur 2B, blå pil) kan ligne organoids og er lettere å skjelne en frisk-lysbildet som tørr organoids vises gjennomsiktig (figur 2C). Hvis ingen organoids er til stede, inndeling ytterligere i blokken.
- Når lysbilder som inneholder organoids har anskaffet, sirkel området rundt delen på baksiden av lysbildet med histology penn og stek over natten ved 45 – 50 ° C.
- Samle lysbilder og videre til H & E (se trinn 4.9.1), immunohistochemical (se trinn 4.9.2), eller immunofluorescent flekker (se trinn 5).
Merk: Representant resultater er vist i figur 3B.- For å utføre H & E flekker, få en kit fra listen materialer og følger produsentens spesifikasjoner.
- For å utføre immunohistochemical flekker, få en kit og primære antistoff fra listen materialer og følger produsentens spesifikasjoner.
5. immunofluorescent farging av FFPE og delt Organoids
- Samle forsyninger: bakt lysbilde i trinn 4, xylen, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, deionisert vann (DI H2O), coplin krukker, 1 x antigen henting løsning (natriumsitrat buffer eller EDTA-Tris buffer), fosfat-bufret saltvann (PBS), 5% normal hest serum ( NHS) med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS, 1% bovin serum albumin (BSA) med 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS, farging rack, flekker retten, decloaking kammer, hydrofobe barriere penn, fuktighet kammer, 1 ° og 2 ° antistoffer av interesse, og counterstains av interesse.
- Deparaffinize og rehydrate lysbildene ved dipping i coplins fylt med følgende løsninger: xylen (3 dips, 5 min), 100% EtOH (2 dips, 3 min hver), 95% EtOH (2 dips, 3 min hver), 70% EtOH (2 dips, 3 min hver) og DI H2O (2 dips 3 min).
- Fylle flekker retten med antigen henting løsning og pre varme decloaking kammer til 100 ° C.
- Utføre antigen henting ved immersing lysbilder i forvarmet flekker retten og Inkuber for 5-10 minutter ved 100 ° C. Når syklusen er fullført, kan decloaking kammeret til å sitte i 20 min før du åpner dekslet.
- Når lysbildet parabolen er avkjølt til RT, plassere flekker retten under rennende DI H2O skylle lysbilder for 5 min.
- Fjerne lysbildene fra flekker retten, tegne en sirkel rundt prøven med en hydrofobe barriere, og lå lysbildet på fuktighet kammeret.
- Blokkere alle ikke-spesifikke antistoffer flekker ved å bruke 5% NHS med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS hydrofobe sirkelen rundt prøven (ca 30 μL er nødvendig å dekke utvalget).
- Vask lysbilder i coplins fylt med PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Legge 1° antistoffer (Tabell for materiale) fortynnet i 1% BSA med 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS til hydrofobe sirkelen rundt prøven (ca 30 μL bør dekke delen), deretter ruge 1t på RT eller over natten på 4 ° C i luftfuktighet kammer.
- Vask lysbildene i coplins fylt med PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Legge til 2° antistoffer fortynnet i 1% BSA med 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS til hydrofobe sirkelen rundt prøven (ca 30 μL vil dekke området), deretter ruge 1t på RT i luftfuktighet kammer.
- Vask lysbildene i coplin fylt med PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Legg DAPI, utvannet produsentens spesifikasjoner, i 1% BSA med 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS til hydrofobe sirkelen rundt prøven, deretter ruge i 2-5 min på RT i mørket (30 μL).
- Vask lysbildene i coplins fylt med PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Montere lysbildene med antifade monterer medier og dekkglassvæske, og visualisere resultatene under et mikroskop.
6. hele-montering av Organoids til Immunofluorescent farging
- Samle forsyninger: kammer lysbilde eller AC confocal parabol, fosfat-bufret saltvann (PBS), etappe, den stabiliserende, 50 mM NH4Cl i PBS, 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS, 5% NHS med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS, 1% BSA med 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS, 1 ° og 2 ° antistoffer av interesse, og counterstains rundt.
- Nøye fjerne så mye media som mulig uten å forstyrre organoid kulturen av pipettering mot siden av Vel, forlate mellomrom mellom media og matrix gel.
- Bruker en trimmet, pre våt med media eller PBS, 1000 μL pipette tips, trekke opp en dråpe (25-50 μL) matrix gel som inneholder organoid(s) av interesse og støte på midten av et kammer lysbildet frisk eller AC confocal fat.
Merk: 33% matrix gel er ikke en solid. Det er en gelatinous væske som håndterer ligner en Jello som ikke fullt satt. Et trimmet pipette tips med en stor åpning vil forhindre at organoids brytes under overføring. - Hvis organoids fortsatt i overordnede kultur, erstatte media med varm KSFM-baserte medier.
- Sug opp overflødig media og matrix gel fra kammeret lysbildet med en fin-spissen pipette (10-200 μL) med det blotte øye eller dissecting omfang.
Merk: Det er valgfritt å pretreat kammeret lysbildet med en tilslutning reagens. - Plate en like volum av matrix gel i en tom brønn kammer lysbildet som en valgfri kontroll å observere autofluorescence av leftover matrise.
- Plass kammer lysbildet i en 37 ° C inkubator i 30-45 minutter å fremme organoid for å overholde glasset og hindre tap av prøver i vask trinnene.
- Pipettering sakte å hindre løsgjøring fra lysbildet, vask organoids med 200 μL av 1 x PBS i 5 min på RT mens forsiktig risting.
- Fjerne 1 x PBS og fikse med 200 μL av 4% paraformaldehyde i 30 min på RT mens forsiktig risting. Sikre at matrisen gel vises klart etter dette trinnet.
Merk: Metanol eller formell fiksering er også mulig. Fiksering metoden skal være optimalisert for spesifikke antistoffer som bestemte fiksering metoder kan krysskobling antigener rundt eller slukke fluorescerende-merking-proteiner av interesse. - Fjerne bindemiddel og vask to ganger med 200 μL av 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting.
Merk: Lengden på vaske trinnene bør optimeres avhengig av organoid størrelse. Fem minutter er tilstrekkelig utgangspunkt, men vask trinnet kan bli forlenget etter behov. - Slukke autofluorescence med 200 μL av 50 mM NH4Cl i 1 x PBS i 30 min på RT mens forsiktig risting.
Merk: Dette trinnet vil slukke autofluorescence fra rusk i lumen av organoid og fluorescerende protein uttrykk (for eksempel GFP) som kan presentere fra eksperimentell design. Det burde være inkludert hvis det er ønskelig å bruke en fluorophore i 488 kanalen, men kan hoppet hvis du ønsker å bevare GFP signal. - Fjerne NH4Cl og vask to ganger med 200 μL av 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting.
- Permeabilize organoids i 200 μL på 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel-100 i 1 x PBS i 30 min på RT mens forsiktig risting.
- Fjerne den 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel-100 1 x PBS og vask to ganger med 200 μL av 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting.
- Blokkere med 5% NHS med 200 μL av 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel X-100 i PBS og ruge for 60 min på RT mens forsiktig risting.
- Fjerne blokkering bufferen og vask to ganger med 200 μL av 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting.
- Fortynne 1° antistoffer i 1% BSA med 0,3% Triton X-100 i 1 x PBS og legge til 200 μL kammer lysbildet, så ruge i 1-3 dager på 4 ° C.
- Fjerne 1° antistoffer og vask to ganger med 200 μL av 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting.
- Fortynne 2° antistoffer i 1% BSA med 0,3% Triton X-100 i 1 x PBS og legge til 200 μL kammer lysbildet, så ruge i 1-3 dager på 4 ° C i mørket.
Merk: Lengden på inkubasjon ganger skal være optimalisert for organoid størrelse og antistoff. Noen krever mer tid til å trenge gjennom organoid. Antistoff konsentrasjon må også optimaliseres. Generelt, 2 x konsentrasjonen brukes for FFPE inndelinger er passende for 1° antistoffer og samme konsentrasjonen for FFPE inndelinger er passende for 2° antistoffer. - Fjerne 2° antistoffer og vask to ganger med 200 μL av 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting.
- Counterstain utgangen med phalloidin og kjernen med DAPI eller Hoescht, fortynnet i henhold til produsentens anbefalinger i 1% BSA med 0,3% Triton-X 1 x PBS. Tilsett 200 μL kammer lysbilde og ruge på RT for 40 min i mørket.
- Montere i 200 μL av fersk 1 x PBS eller monterer medier og image umiddelbart (fluorescens bør bevares for opp til 5 dager, om ikke lenger). Representant resultater er vist i Figur 3 c.
Merk: Natriumazid kan legges til å hindre forurensning hvis AC confocal imaging ikke er lett tilgjengelig. Legge til en lysning agent kan forbedre bildebehandling.
7. hele-montering av Organoids for analyser og fluorescerende sonder
Merk: Det er kommersielt tilgjengelige analyser og fluorescerende sonder/fargestoffer (eksempler er inkludert på listen over materialer) amendable for bruk på hele montert organoids å observere en rekke nyttige endepunktene19. Følgende protokollen er for fluorescently merket EdU spredning kit, men noen kit kan bli endret for bruk med en hele montert prøven.
- Nøye fjerne 50 μL av media og erstatte med 50 μL av 20 μM 2 x arbeider EdU løsning av pipettering mot siden av Vel, forlate mellomrom mellom media og matrix gel.
- Ruge på 4 ° C i 1-3 dager (ønsket tidsrom for EdU innlemmelse skal være optimalisert for celle type valg).
- Fremgangsmåten 6.2-6.8 overføre organoids rundt på et kammer lysbilde eller AC confocal parabolen.
- Fjern PBS og fikse med 200 μL av 3,7% paraformaldehyde i 30 min på RT mens forsiktig risting. Sikre at matrisen gel vises klart etter dette trinnet.
- Fjerne bindemiddel og vask to ganger med 200 μL av 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting. Fjern PBS og legge 200 μL av 0,5% ikke-ioniske vaskemiddel-100 i 1 x PBS i 30 min på RT mens forsiktig risting.
- Forberede en 1 x fluorescerende reaksjon cocktail i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Fjerne 0,5% ikke-ioniske vaskemiddel-100 og vask to ganger med 200 μL av 3% BSA på 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting.
- Legg reaksjon cocktail og ruge i 30 min på RT i mørket.
- Fjerne fluorescerende reaksjonen cocktail og vask en gang med 200 μL av 3% BSA på 1 x PBS i 5 min mens forsiktig risting. Counterstain og montere ved å følge trinn 6.21-6.22 (figur 3D).
Representative Results
Etter vellykket kultur for menneskelig primære prostata organoids, kan morfologi og differensiering vurderes lyse-feltet bildeanalyse og FFPE og hele-mount flekker teknikker.
Prosessen med lyse-feltet image fange er illustrert i figur 1A. Organoids er dyrket i en 3D matrise og spredt over ulike fokal plan. For å observere organoids i fokus over mange fly, er det foreslått for å bruke et EDF bilde (figur 1B, høyre) i stedet for et enkelt z-fly (figur 1B, venstre). I laboratoriet, kan organoids dyrket under forskjellige eksperimentelle forhold medføre endringer i morfologi. Bruker området, sirkularitet (definert av hvor like organoid er til en sirkel) og max/min radius (mål lengden) gir brukere en indikasjon på organoid størrelse og form og en kvantifiserbare avlesning av morfologi. Vil fremheve nytten av disse tiltakene, er representant bilder av organoids med tilsvarende område men ulike morfologi vist i figur 1 c, der en lang organoid vil være mindre sirkulære og har en større maksimum/minimum forhold enn en sfærisk organoid.
Bygge inn organoids for histology er et nyttig sluttpunkt å observere indre av prøver og sikre at nekrose ikke finnes i kjernen av en organoid. En arbeidsflyt for denne prosessen og representant resultatene av unstained kvinne, valgte prøvene under mikroskop lyse-feltet finnes i figur 2AB, C. Figur 3A viser en feilsendt organoid (til venstre) sammenlignet med riktig ga organoids i figur 3A (høyre) og figur 3B. For å fastslå den differensiering-staten prøven, er det anbefalt å betrakte basal celle markører (cytokeratin 5 og p63)8 med luminal celle markører (cytokeratin 8)8. Hvis det er ønskelig å flekk organoids i situ, hele-mount flekker er et praktisk alternativ, og disse representant resultatene finnes i Figur 3 cD.
Figur 1: morfologi vurdering av organoids i 3D kultur. (A) bildet samlingen og komprimering arbeidsflyt for menneskelig primære prostata organoids kjøpt av en lyset invertert mikroskop med motoriserte X / Y scenen og følgesvenn skanneprogramvare. (B) representant bilder av en enkelt z stabel (venstre) vs. en EDF bilde (høyre) i en hel-godt utvalg av menneskelig primære prostata organoids, viser at flere organoids er i fokus når flere z-stabler er kombinert i en enkelt bildet (skala bar = 1000 µm). (C) representant bilder for området, sirkularitet og max/min forholdet mellom morphologically ulike menneskelige primære prostata organoids som har samme område (skala bar = 200 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Organoid innebygging arbeidsflyt og representant snitting resultater. (A) menneskelige primære prostata organoid innebygging arbeidsflyt. (B) representativt bilde av en unstained kvinne, frisk lysbilde som inneholder menneskelige primære prostata organoids under lysende felt mikroskop som viser agar (grønn pil), histology gel (svart pil), boble (blå pil), organoids (røde piler) (skala bar = 1000 µ m). (C) unstained kvinne fersk kuttet lysbildet (venstre) vs. unstained kvinne tørr lysbildet (høyre), organoids (røde piler) vises gjennomsiktig når tørr (skala bar = 500 µm) og er vanskeligere å skjelne under mikroskop lyse-feltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: histologiske flekker på delt og hele montert organoids. (A) H & E farging av en ødelagt menneskelige primære prostata organoid fra mishandling (aggressiv pipettering, feil behandling protokollen, venstre) ved siden av en godt håndtert organoid (høyre) (skala bar = 100 µm). (B) menneskelige primære prostata organoid som har vært formalin-fast, parafin-innebygd, delt, og farget med basal cytokeratin 5 eller luminal cytokeratin 8 (øverst) eller basale p63 og luminal cytokeratin 8 (nederst) og fotografert med AC confocal mikroskop ( skala bar = 100 µm). (C) en hel montert menneskelige primære prostata organoid farget med basal cytokeratin 5 eller luminal cytokeratin 8 og counterstained med phalloidin og DAPI, fotografert med AC confocal mikroskop (skala bar = 100 µm). (D) en hel montert human primære prostata celle organoid farget med fluorescently merket EdU og counter farget med Hoescht, fotografert med AC confocal mikroskop (skala bar = 500 µm) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Organotypic kultur er en spennende ny metode for recapitulating vev av et i vitro miljø. Foreløpig vokse labs organoids fra mange typer vev for ulike endepunkter. Metodene som er beskrevet i denne artikkelen oppsummerer nyttig endepunktene og markere nye teknikker for å fullt karakterisere 3D primære prostata cellekulturer.
Det finnes en rekke medier oppskrifter dyrke human primære prostata celle organoids5,6,13. Mens alle oppnå levedyktig og sammenlignbare resultater, bruker KSFM-baserte medier13 minimal tilsetningsstoffer slik det er beskrevet her. I tillegg har artikler blitt publisert i flere konsentrasjoner matrix gel, fra 10% til 75% til kultur prostata organoids5,6,13. Fordi matrisen gel er en dyr reagens, og 33% matrix gel har vist seg å være tilstrekkelig til å dyrke langsiktige (2-3 uker), levedyktig, unclumped organoids13, dette er den anbefalte konsentrasjonen. Men kan matrix gel varierer i protein konsentrasjon mellom partinumre, så dette bør tas i betraktning når plating. Det anbefales også å kjøpe matrix gel i bulk for bruk over flere eksperimenter for å redusere inkonsekvens mellom. Andre labs har publisert forskjellige formater for plating matrix gel, som dråper i stedet for belegg en 96-brønns plate med5. Begge metodene danne levedyktige organoids, men formatet beskrevet her gir cellene til å være belagt mer tynt, som har vist seg å fremme ekspansjon av celler i større organoids13. Imidlertid bør plating tetthet optimeres basert på pasient-spesifikke formasjon effektivitet. Matrix gel er tilgjengelig i mange formater, inkludert vekst faktor-redusert, fenol red-fri, høy konsentrasjon, osv. Vekstfaktor-redusert anbefales for definert oppdrettsforholdene, og fenol red-fri anbefales når du arbeider med celler som uttrykker GFP eller eksperimenter som involverer z stabel bildeoppløsning. Det er viktig at alle matrise gel plating trinnene utføres med iskald reagenser, som matrise gel stivner raskt ved romtemperatur.
Organoids dyrket under annerledes eksperimentell behandlinger kan resultere i endringer for figuren så lyse-feltet imaging er mye brukt til å studere observert morfologiske fenotyper. Likevel, opptak og kvantifisere området eller figur er en utfordring for to grunner: 1) utvalget bias bildeoppløsning og 2) bruker en todimensjonal parameter som området et tredimensjonalt utvalg. En strategi for bildebehandling er å registrere et tilfeldig felt og måle et forhåndsbestemt antall organoids i dette feltet, men dette kan skape bias under valget, og alle organoids i det valgte feltet kan ikke være i fokus. Hel-og bildebehandling optimalisert for 96-brønnen microplate formatet eliminerer denne prøvetaking skjevhet ved å samle hele organoid befolkningen av interesse. Imidlertid avhengig av mikroskopet målene på hånden må flere felt samles inn og side ved side for å få en hel-og bilde. Noen labs har beskrevet måle området fra en enkelt z-plane12, men for å fange alle organoids i fokus, er det anbefalt å samle og stable flere fly i en enkelt EDF-image13. I noen tilfeller en menisk i matrix gel forårsake vignettering i bildet, og bakgrunnen korreksjonsmetoder må brukes ved hjelp av analyseprogramvare. Nøyaktig volum ligger passende målene for organoid størrelse; Dette er imidlertid vanskelig å nettopp ha, selv med flere z-stakk bilder. Andre nyttige morfologiske dimensjoner, for eksempel sirkularitet og maksimum/minimum forhold, kan lett bli beregnet fra alle organoids i en hel-og EDF bilde. Sammen disse metodene overvinne prøvetaking bias utfordringer og aktiverer måling av 2D parameterne fra 3D-objekter i et 3D-rom.
Formalin fiksering og parafin innebygging av organoids er en vanlig måte å få hematoxylin og eosin (H & E), immunohistochemical (IHC) og immunofluorescent (hvis) flekker for visualisering og analyseverktøy6,11, 20. men publikasjoner som har beskrevet denne teknikken mangler omfattende informasjon om innebygging prosessen. I tillegg kan finne organoids i parafin blokken være utfordrende. Noen labs pre flekken organoids med trypan blå før innebygging for å hjelpe sted under snitting11. Metoden beskrevet her omfatter bruk av en histologiske fargestoff for retningen av organoid/histology gelplug under innebygging for å fremme effektiv snitting. H & E lysbilder rette undersøkelse av nekrose, kjernefysiske tekstur og spredning, og dermed bør det være et obligatorisk endepunkt for organoid kultur slik at cellene er sunt i hele området. En styrke for organoid kultur er at prøver består av en heterogen blanding av celler som ligner bedre i vivo pasienten vev. I prostata, for eksempel finnes både basal og luminal celler i prostata organoids5, mens celler dyrket i 2D mangel luminal differensiering8. For å vurdere organoid differensiering, anbefales det at forskere vurdere basale markører som CK5 og p63 og luminal markører som androgen reseptorer og CK88. Noen andre eksperimentelle proteiner rundt kan også studeres disse flekker teknikkene.
FFPE deler tillater visualisering av cellene er bosatt i indre rommet via histologic metoder (H & E, hvis IHC), bilder er begrenset til tverrsnitt og organoid form kan endres av innebygging prosessen. Hele-mount flekker kan en organoid farget og observert i situ, bevare morfologiske fenotyper og tillater bilder av protein lokalisering. Hele-montering er et verktøy benyttet til stain hele-vev eller hele-dyr prøver, som sebrafisk eller mus fosteret, og er lett tilpasses for organoids. Teknikken er beskrevet her ble endret fra prosedyren av Mahéet al. 11, som viser den opprinnelige veksten og kultur av gastrointestinal organoids direkte i et kammer lysbilde til farging, og krever fiksering av hele overordnede kultur. Metoden skissert her innebærer overføring av en enkelt organoid (eller organoids) av interesse på et kammer lysbilde ved flekker. Dette gjør utvalget av individuelle organoids for hele-mount analyse i et pågående eksperiment uten fiksering av overordnede kultur. Når du utfører hele-mount flekker, er det nødvendig å optimalisere permeabilization og inkubasjon tiden for primær og sekundær antistoffer å sikre penetrasjon i prøven (hvor som helst fra én eller flere dager anbefales). Når fotografert via AC confocal mikroskopi, kan 3D-gjengivelser produseres for å aktivere visualisering og lokalisering av et bestemt protein og beregne antall positivt farget celler i et utvalg. Flowcytometri er et nyttig sluttpunkt å kvantifisere bestander av basale, luminal, eller stamceller5,14. Dette er celler utvinnes fra matrix gel og forsiktig avstand til farging. Brukere bør nøye velge riktig markører for å skille basert på gjeldende litteratur. Menneskets primære prostata epitelceller er CD26 og CD49f egnet luminal og basal markører, henholdsvis5,21.
I sammendraget detaljer denne protokollen menneskelige primære prostata organoid vekst, innsamling og eksperimentelle endepunktene. Av notatet, kan montering teknikken beskrevet brukes til en rekke andre analyser som brukes vanligvis for 2D celler, for eksempel fluorescerende probe-baserte eksperimenter ser på spredning19apoptose og subcellular organelle flekker. Innsamling og dissosiasjon metoden beskrevet her kan i tillegg benyttes i forberedelse til én celle RNA sekvensering18. Kollektivt, viser dette muligheten for en rekke roman, Hi-Fi-endepunkter som forskere kan optimalisere og utforske i fremtiden.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker UIC Biorespository medlemmer, Dr. Klara Valyi-Nagy og Alex Susma, samt urologer, Dr. Michael Abern, Daniel Moreira og Simone Crivallero, for tilrettelegging av vev kjøp for primært cellekulturer. Vi takker UIC urologi pasienter for donerer vev til forskning. Dette arbeidet ble finansiert, delvis av den avdeling av forsvarer prostata kreft forskning Program helse forskjeller ideen Award PC121923 (Nonn) og UIC Center for klinisk og oversettelse naturfag for kliniske og translasjonsforskning forskere (Pre-doctoral PECTS) Program (McCray og Richards) og National Institutes of Health's National Cancer Institute, Grant tall U54CA202995, U54CA202997 og U54CA203000, kjent som Chicago helse egenkapital samarbeidet (Nonn og Richards). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health eller forsvarsdepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
- Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
- Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
- Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
- Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
- Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
