Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

معالجة وتقييم الثقافة البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/59051
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Departments of Urology, Physiology, and Biophysics, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لدليل المناولة البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية ثم تشير إلى نقاط النهاية لتقييم النمط الظاهري. البذر، ثقافة الصيانة والانتعاش من جل مصفوفة، يرد وصف الكمي مورفولوجك والتضمين وتمزيقها وتمزيقها فب، الجامعة-جبل تلطيخ وتطبيق الاختبارات التجارية.

Abstract

وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصل لثلاثي الأبعاد (3D) استزراع والمناولة، وتقييم البشرية الأساسي أورجانويدس البروستاتا. وتنطوي العملية على زرع الخلايا الظهارية قليلة في جل مصفوفة ثلاثية الأبعاد على ميكروسكوبية 96-جيدا مع التغييرات الوسائط لزراعة التوسع في أورجانويدس. ثم يتم تقييم مورفولوجيا بالجامعة، حسنا التقاط الصور z-المكدس. ضغط z-مكدسات يخلق صورة واحدة في التركيز من خلالها يتم قياس أورجانويدس التحديد الكمي لمجموعة متنوعة من النواتج، بما في ذلك تدوير والدائرية، والمنطقة. ويمكن جمع الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين من أورجانويدس استردادها من جل المصفوفة. يمكن تقييم بالانفصال أورجانويد السكان خلية للفائدة والتدفق الخلوي. الفورمالين-التثبيت-البارافين-التضمين (FFPE) متبوعاً بتقطيع يستخدم لتقييم غذائها وتلطيخ جسم. تلطيخ الجامع-جبل إيمونوفلوريسسينت يحافظ على مورفولوجيا أورجانويد ويسهل المراقبة للتعريب البروتين في أورجانويدس في الموقع. يمكن تعديل فحوصات التجارية التي تستخدم عادة لخلايا أحادي الطبقة 2D أورجانويدس ثلاثي الأبعاد. تستخدم معا، توفر التقنيات في هذا البروتوكول مجموعة أدوات قوية لقياس نمو البروستاتا أورجانويد وخصائص السمات، والتعبير عن علامات التمايز.

Introduction

أورجانويدس أداة قيمة لدراسة أورجانوجينيسيس والمرض. أنها توفر بديلاً أقل تكلفة للنماذج الحيوانية، وتتطور أورجانويدس المستمدة من المريض كاستراتيجية للطب شخصية1،،من23. ينطوي هذا النظام ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة زرع الخلايا الجذعية أو السلف (تحصد من الأنسجة أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent) في جل مكونات المصفوفة خارج الخلية (مصفوفة جل)4. تتكاثر الخلايا والتفريق، أسفر عن هياكل أورجانوتيبيك أن الخص في التسلسل الهرمي للهاتف الخلوي ومورفولوجيا الجهاز لوحدة وظيفية للفائدة. وقد نمت أورجانويدس استخدام الخلايا التي تنشأ من مجموعة متنوعة من الأجهزة، بما في ذلك الغدة اللعابية، المعدة، الأمعاء، الكبد والبروستاتا، والرئة، والمخ4. على الرغم من أن هناك بروتوكولات عديدة تصف الخطوات إنشاء5،أورجانويدس البروستاتا6، أنها تمثل تحديا لإيجاد طرق مفصلة بما فيه الكفاية حول كيفية تحقيق النهاية الكمية من أورجانويدس. هذه الورقة يلخص الأساليب المتقدمة لخلايا البروستاتا الأساسي الإنسان وتفاصيل سلسلة من نقاط النهاية المقترحة لتقييم تعمل أورجانويد. هذه التقنيات كانت الأمثل للبروستاتا أورجانويدس ويمكن أن تنطبق على سائر الثقافات الخلية 3D.

الثقافات أورجانويد البروستاتا ظهرت مؤخرا كما أنشأت نموذجا قيماً في المختبر الذي يفتقر إلى القيود المفروضة على ثقافات أحادي الطبقة باستخدام خطوط الخلايا مخلدة. ظهارة البروستاتا الحميد وسرطان البروستاتا التحدي لنموذج في المختبر باستخدام خطوط الخلايا مخلدة. العدد خطوط الخلايا حميدة محدودة، والجميع قد شهدت تحولاً مع المسرطنة7. لا تفرق في الخلايا لومينال الخلايا الظهارية البروستاتا الأولية في مونولاييرس ونقص الاندروجين مستقبلات8. لا تملك غالبية خطوط خلايا سرطان البروستاتا مستقبلات الاندروجين الوظيفية، ووسيط هام المبكر مرض الدولة، والافتقار إلى التغيرات الوراثية الرئيسية التي وجدت في أورام المرضى9. الثقافات أورجانويد البروستاتا يمكن زراعتها بسهولة من ظهارة حميدة، وهي ذات قيمة في دراسة خصائص الخلايا الجذعية وخلايا السلف، والتمايز، وآثار التغييرات التجريبية في4،المكروية5. أورجانويدس سرطان البروستاتا يمكن زراعتها كجزء من نهج الطب الدقة لنمذجة مرض المريض واستجابة للعلاجات10.

هذا البروتوكول قد جمعت من البروتوكولات القائمة التي تستخدم مختلف أنواع الخلايا، ولكن قد تم تحسين هنا للاستخدام في خلايا البروستاتا البشرية الأولية. أنها تكمل البروتوكولات التي حددها ساورز، كليفيرس، وشين5،6 التي تصف النمو، باساجينج، تصوير مشرق الميدان، نعد، وعزل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي أورجانويدس البشرية والماوس البروستاتا. يتم تعديل البروتوكول كل جبل من ماهي et al. 11، الذي يستخدم أورجانويدس الظهارية المعوية، ويصف العيش التصوير والمجمدة والبارافين التضمين. بورتن et al. 12 وصف التحليل للثدي والقولون وسرطان القولون والمستقيم أورجانويد مورفولوجيا من تصوير مشرق الميدان. بالإضافة إلى ذلك، ريتشاردز وآخرون. 13 يستخدم أسلوب لتقييم مورفولوجك أورجانويدس البروستاتا. وأخيراً، هو جين تاو et al. 14 وصف أسلوب المنضمة البروستاتا أورجانويدس لشريحة دائرة بين ليلة وضحاها قبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت لمراقبة الخلايا المفردة وتشتت من المجالات من أجل تحليل التدفق الخلوي.

والهدف من هذا البروتوكول إثبات بتفصيل كاف هذه الأساليب تحديا تقنيا كبروتوكول واحد، بما في ذلك الخلية البذر؛ وسائل الإعلام ومصفوفة جل الصيانة؛ مجموعة من الخلايا للتدفق الخلوي؛ الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، واستخراج البروتين؛ تقييم السمات من تحليل مشرق حقل z-المكدس؛ التضمين، تجهيز وتقطيع لتلطيخ نسيجية؛ وتركيب كل لفحوصات مسبار الفلورة أو الفلورسنت. سوف تختلف أهميتها البيولوجية وتفسير هذه النهاية مختلفة بين التصميم التجريبي والأجسام المضادة المستخدمة للتحليل. من خلال الاستفادة من هذا البروتوكول، ينبغي أن يشعر المستخدمين استعداد لإعداد تجربة مع مجموعة من أدوات لنقاط النهاية.

وأنشئت البشرية الأولية البروستاتا (ما قبل) الخلايا الظهارية في المختبر ببروتوكول وصف بيهل15،16 ، والإبقاء على عدد محدود من المقاطع (ما يصل إلى أربعة) كما هو موضح سابقا17، ولكنها أيضا المتاحة من الموردين التجاريين. يتم نشر جميع تتمثل خالية من المصل المستندة إلى وسائل الإعلام6، على أساس كسفم13، و R-سبوندين 1-مكيفة5 وسائط الإعلام بإنتاجها بنجاح أورجانويدس. على أساس كسفم يتطلب أقل عدد من المواد المضافة، حيث يتم وصفها هنا.

Protocol

وكان الأمثل البروتوكول التالية استخدام الأولية البروستاتا طلائي الخلايا البشرية تحصد من أنسجة المريض في جامعة إلينوي في شيكاغو مستشفى. وكانت جميع الأنسجة البشرية المستخدمة لهذه التجارب المكتسبة عن طريق مؤسسي الاستعراض-وافق المجلس البروتوكول و/أو الإعفاء في جامعة إلينوي في شيكاغو. بينما شروط الثقافة سوف تختلف تبعاً لنوع الخلية للفائدة، يمكن تطبيقها في النهاية إلى أورجانويدس أنسجة الأخرى.

1-بذر الخلايا الظهارية في جل مصفوفة وتغيير الوسائط

  1. جمع المواد اللازمة: الفحم البشرية الأولية البروستاتا الخلايا الظهارية (ما قبل)، جل مصفوفة على الجليد، الميكروسكوبية 96، حسنا، keratinocyte خالية من المصل الوسائط (كسفم) على الجليد، جردت الأبقار الجنين المصل (FBS)، وديهدروتستوسترون (دهت).
  2. تحضير الوسائط المستندة إلى كسفم أورجانويد بالجمع بين 47.5 مل كسفم 2.5 مل من الفحم جردت FBS وديهدروتستوسترون (دهت) بتركيز نهائي 10 نانومتر دهت، ثم الاحتياطي على الجليد.
  3. لوحة خلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد في غطاء ثقافة خلية باستخدام تقنية معقمة.
    1. بلطف الباردة مزيج الوسائط المستندة إلى كسفم أورجانويد مع هلام مصفوفة المثلج للحصول على مصفوفة 50% هلام الخليط ببطء بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتجنب الفقاعات.
      ملاحظة: ينبغي إذابة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية جل مصفوفة وأبقى على الجليد كلما كان ذلك ممكناً. فإنه يتصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. قبل الرطب تلميح ماصة في وسائل الإعلام الباردة ونقل 40-50 ميكروليتر مصفوفة 50% هلام على الجزء السفلي من كل بئر لاستخدامها على لوحة 96-جيدا. معطف أسفل البئر لتشكل طبقة أساس.
      ملاحظة: ليس تماما الاستغناء عن إلى المحطة الثانية على ماصة، كما يمكن أن يخلق فقاعات.
    3. ضع لوحة 96-جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 – 45 دقيقة ترسيخ الطبقة الأساس.
      ملاحظة: لا لوحة الخلايا الظهارية على الطبقة الأساس حتى قد وطدت، أو قد تقع من خلال المصفوفة على الجزء السفلي من اللوحة الخلايا وتنمو كأحادي الطبقة.
    4. مزيج من الخلايا الظهارية التي علقت في وسائل الإعلام على أساس كسفم أورجانويد مع هلام مصفوفة لتحقيق تركيز نهائي من 100 – 1,000 الخلايا/100 ميكروليتر وجل مصفوفة 33%. لوحة الخلايا الظهارية على رأس طبقات قاعدة استخدام 100 ميكروليتر مزيج هلام/خلية المصفوفة 33% لكل بئر.
      ملاحظة: أظهرت التجارب السابقة أن بذر الخلايا الظهارية كثيفة جداً في 3D سوف تقييد حجم النمو أورجانويد، بينما البذور قليلة جداً يمكن أن ينتج عائد منخفض جداً13. من المهم تحسين ظروف البذر لنوع الخلية ذات الاهتمام، على أساس الكفاءة تشكيل أورجانويد الخاصة بالمريض.
  4. ضع لوحة 96-جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 – 45 دقيقة السماح هلام مصفوفة على ترسيخ، ثم بلطف إضافة 100 ميكروليتر من وسائل الإعلام على أساس كسفم أورجانويد أعلى الخلايا عن طريق بيبيتينج ببطء على حافة البئر.
  5. تغيير وسائل الإعلام كل 2 – 3 أيام. بيبيتينج ضد الجانب من البئر مع المسافة بين جل وسائل الإعلام والمصفوفة، بعناية إزالة 50 ميكروليتر من وسائل الإعلام واستبدالها مع 50 ميكروليتر من وسائط جديدة.
    ملاحظة: لثقافة طويلة الأجل، وهلام مصفوفة يحتاج إلى تغيير كل 2 – 3 أسابيع. إذا كانت ثقافة جل مصفوفة يبدو غير مستقر ويعرض التجاعيد شفافة تحت المجهر، ثم جل مصفوفة قد انهارت ويحتاج إلى استبداله.

2-جمع أورجانويدس من جل مصفوفة

ملاحظة: مجموعة من أورجانويدس ضروري لمصفوفة جل التغييرات أو باساجينج أو نقاط النهاية لاستخراج الحمض النووي الريبي واستخراج الحمض النووي، واستخراج البروتين والتدفق الخلوي.

  1. مبطلات محايدة دافئة وهانكس متوازنة الحل الملح (حبس) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. بعناية قم بإزالة الوسائط من الآبار دون تعطيل جل المصفوفة.
  3. إضافة ~ 200 ميكروليتر من مبطلات محايدة لكل بئر في ~ 1:2 نسبة مصفوفة محايدة لجل: مبطلات واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. ميكانيكيا ننأى بالخليط حوزتي جل: المحايدة مصفوفة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  5. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. نقل الخليط جل خلايا مصفوفة حوزتي محايدة لأنبوب ميكروسينتريفوجي أو أنبوب مخروطي، تبعاً للحجم. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 3 – 5 دقيقة بيليه الخلايا.
    ملاحظة: إذا ظهر لا خلية بيليه، هلام المصفوفة لا يمكن فصلها تماما ويمكن تصور كمرحلة شفافة في الجزء السفلي من الأنبوب متميزة من المادة طافية الوردي. إزالة المادة طافية وإضافة حوزتي أكثر حيادية بنسبة 1:2 لمصفوفة بيليه جل واحتضانها لآخر 20 – 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية وتكرار استخدام الطرد المركزي في 300 x ز.
  7. عندما يتم الحصول بيليه أورجانويد، قم بإزالة المادة طافية. المضي قدما في باساجينج (راجع الخطوة 2.7.1)، تحلل أورجانويد لاستخراج الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين (راجع الخطوة 2.7.2)، خلايا مفردة معالجة التدفق الخلوي، وتسلسل خلية واحدة (راجع الخطوة 2.7.3).
    1. لثقافة طويلة الأجل، ريسوسبيند بلطف أورجانويدس سليمة في 33% هلام مصفوفة جديدة ولوحة عن طريق اتباع الخطوات الموضحة في الخطوات 1.1-1.5. لننأى أورجانويدس وريبلاتي كواحدة من الخلايا وريسوسبيند بيليه في 1 مل إنزيمات تفكك الخلايا الحارة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 10 – 15 دقيقة، يغسل مرة واحدة مع 5 مل هبس وإعادة لوحة في جل مصفوفة جديدة بعد الخطوات 1.1-1.5.
    2. ريسوسبيند بيليه أورجانويد في مخزن مؤقت لتحلل ملائمة لاستخراج الحمض النووي الريبي، واستخراج الحمض النووي، أو استخراج البروتين كما هو موضح في الجدول للمواد ومتابعة البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    3. ريسوسبيند أورجانويدس في 1 مل إنزيمات تفكك الخلايا الحارة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 – 15 دقيقة ننأى أورجانويدس إلى الخلايا المفردة. أغسل مرة واحدة مع 5 مل حبس والمضي قدما في البروتوكول المتعلق بالتدفق الخلوي5 أو خلية واحدة تسلسل18.
      ملاحظة: أن تنأى في الخلايا المفردة في تركيزات منخفضة من جل المصفوفة، حوزتي محايدة قد لا تكون هناك حاجة، والأنزيمات تفكك خلية يمكن تطبيقها مباشرة على البئر بعد الخطوة 2، 2.

3-الحصول على الصور الجامعة جيدا وتحليل مورفولوجية أورجانويد

  1. الحصول على الصور جيدا كل z-المكدس باستخدام مجهر مقلوب خفيفة منقولة مع المحركات X/Y مسح المرحلة (سير العمل الموضحة في الشكل 1A).
    1. مع موقف تنسيق ضبط إلى أسفل البئر، يبدأ التركيز إلى الأعلى حتى مصادفة أورجانويد الأول، الذي سيكون في وسط البئر بسبب غضروف من الطبقة الأساس. تعيين أسفل z-الطائرة في هذا الموضع.
    2. مواصلة التركيز إلى الأعلى حتى أورجانويد آخر في التركيز، والتي سوف تكون في محيط البئر. تعيين أعلى z-الطائرة في هذا الموضع.
      ملاحظة: بعد تعيين أعلى وأسفل z-المكدس، تأكد من أن هذه المواقف التقاط أورجانويدس داخل جميع الآبار المتبقية وضبط الأعلى/أسفل حسب الحاجة. وهذا يسمح لنطاق z لاستخدامها لتفحص واحد يتضمن كل أورجانويد داخل كل بئر.
    3. القبض على 15 – 35 ض-الطائرات الواحدة كذلك، باستخدام عدد أكبر لدقة أكبر. التقاط الصورة بأكملها جيدا، ودمج وجمع الأرباع أو الأقسام الفرعية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: من المستحسن اتخاذ z-طائرات متعددة بدلاً من واحدة z-الطائرة، كما هو مبين في الشكل 1 باء التي يتم أورجانويدس من التركيز عند التقاط z-طائرة واحدة فقط.
    4. حفظ الصور z-المكدس لتحليل المتلقين للمعلومات.
  2. تحليل الصور باستخدام برامج الصور مع قدرات رسم شكل حر.
    1. فتح صورة z-طائرة واحدة من الخطوة 3.1.4.
    2. إذا لزم الأمر، تجانب الصور التي اتخذت في كل طائرة z الفردية إلى صورة واحدة، والجامعة أيضا. حفظ صورة جديدة كملف منفصل. كرر هذه العملية لكل طائرة z المكتسبة.
    3. استخدام برنامج الصور، افتح الصورة الجامعة، حسنا لكل طائرة ض من بئر واحدة وإنشاء مدد عمق الميدان (EDF) صورة من كومة من z-الطائرات.
      ملاحظة: هذا النوع من الصور سيتم تحديد منطقة التركيز أفضل من كل ض الطائرة لخلق صورة واحدة في التركيز من البئر.
    4. تعيين حجم بكسل من البرامج إلى شريط مقياس للصورة التي يتم قياسه.
    5. باستخدام أداة الرسم شكل حر من البرمجيات الصورة، وتتبع محيط كل أورجانويد في البئر.
    6. الحصول على مقاييس القياس لمحيط أورجانويد تتبع من البرنامج الصورة.
      ملاحظة: معلمات الموصى بها هي منطقة، والتدوير، ونسبة نصف قطرها الحد الأقصى/الحد الأدنى. وتظهر نتائج تمثيلية توضح تطبيق هذه المقاييس في الشكل 1. منطقة يحسب من المضلع يحددها المحيط أورجانويد. التدوير هو النسبة منطقة أورجانويد إلى منطقة دائرة مع النمس القطر المساواة أورجانويد للحد الأقصى، حيث 0 أقل دائرية و 1 أكثر دائرية. نسبة الحد الأقصى/الحد الأدنى نصف قطرها هي نسبة بين نصف القطر الأقصى والحد الأدنى من دائرة نصف قطرها من أورجانويد تتبع.
      التدوير =Equation 1
      نسبة نصف قطرها =Equation 2

4-تثبيت الفورمالين والبارافين التضمين من أورجانويدس لنهايات سلسلة التفاعل النسيجي

  1. إعداد اللوازم التضمين: حبس، حل أجار 2%، وصبغ وسم النسيجي، وجل علم الأنسجة، "الماصة؛" تلميح العفن، والشريط، والمكبس من حقنه الأنسولين cc 1 وحزمة الجليد، وأشرطة الكاسيت، 10% فورمالين مخزنة محايدة (NBF)، وقلم رصاص و 75% الصف النسيجي الإيثانول (EtOH).
    1. إعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي اثنين من حل أجار 2%. احتضان في حمام مائي أو على كتلة حرارة عند 100-110 درجة مئوية للحفاظ على أجار في شكل سائل. إضافة 1-2 قطرات من نسيجية وسم صبغ إلى واحد من الحلول أجار 2%، والتي تدل على الجزء العلوي من أجار توصيل والمساعدة في الحفاظ على التوجه خلال التضمين. مزيج جيد.
    2. الحارة جل علم الأنسجة في كتلة مياه حمام أو الحرارة في 55-65 درجة مئوية.
    3. استخدام تلميح ماصة 1000 ميكروليتر، إنشاء قوالب بالاستغناء عن قسم صغير من طرف ماصة جعل اسطوانة التي تحمل ~ 50 ميكروليتر. إنشاء العفن ثانيا، الأوسع نطاقا التي تناسبها حول القالب الأول.
    4. إنشاء كتلة باردة التفاف حزمة الجليد مع الشريط (لاصق الجانب الأعلى) والتقيد بقوالب للشريط.
    5. إنشاء المكبس عن طريق إزالة المكبس من حقنه الأنسولين 1 نسخة.
  2. تضمين في أورجانويدس في سد جل علم الأنسجة للتجهيز، وبعد سير العمل هو مبين في الشكل 2 ألف.
    1. فصل هلام مصفوفة وبيليه أورجانويدس باتباع الخطوات 2.1-2.7.
    2. أغسل بيليه أورجانويد مرة واحدة مع 1 مل من حبس وإعادة بيليه بالغزل لمدة 3-5 دقيقة في 300 x ز وإزالة المادة طافية.
    3. إعادة تعليق بيليه أورجانويد في 30-50 ميكروليتر من جل الأنسجة السائلة. المزيج بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ببطء. نقل الخليط هلام/أورجانويد علم الأنسجة في قالب على الكتلة الباردة والسماح للعينة بارد وترسخ في المكونات.
    4. استخدام المكبس لدفع المكونات من الصغيرة العفن والعفن أكبر. ماصة أجار 2% واضحة حول المكونات لملء القالب أكبر.
    5. ماصة النسجية صبغ ملون 2% أجار على رأس المكونات للدلالة على الجزء العلوي من النموذج.
    6. بمجرد تبريد، استخدام المكبس لنقل المكونات إلى كاسيت علم الأنسجة. قم بتسمية الكاسيت باستخدام قلم رصاص ومكان كاسيت إلى 10% NBF للتثبيت بين عشية وضحاها.
    7. نقل راديو كاسيت من 10% NBF إلى 70% نسيجية الصف EtOH.
  3. عملية الجل الأنسجة المكونات استخدام بروتوكول خزعة محددة مسبقاً على معالج، إذا كان متوفراً. إذا لم يتوفر الإعداد المسبق، إدخال تسلسل والاطوال التالية: 70% EtOH لمدة دقيقة 6، 70% EtOH لدقيقة 10، 80% EtOH لمدة 10 دقائق، 95% EtOH 2 مرات لمدة 10 دقائق، 100% EtOH 3 مرات لمدة 10 دقائق، زيلين نفط 3 مرات لمدة 15 دقيقة ، وينحرف البارافين 3 مرات عن 15 دقيقة من الموصى معالجة التسلسل يمكن أن ينتج تمزق أورجانويدس (الشكل 3A).
  4. تضمين المكونات جل علم الأنسجة مع الجزء الملونة التي تواجه، كما سيسمح هذا الجزء مشوه التي تحتوي على أورجانويدس أن مقطوع في المقام الأول.
  5. قسم علم الأنسجة FFPE هلام كتل:
    1. جمع اللوازم الضرورية: علم الأنسجة FFPE هلام كتل، القلم علم الأنسجة، وحوض ماء تعويم الأنسجة، دلو الجليد بالجليد، ومبضع، ريش مبضع، تضمين محطة عمل، إيجابيا يحمل شرائح المجهر، ومختبر الفرن.
    2. تعبئة المياه حمام حتى كاملة جداً ومجموعة إلى 40 درجة مئوية، ثم فرن مختبر قبل الحارة إلى 45-50 درجة مئوية.
    3. إعداد دلو الجليد، ثم ملء مع الجليد وإضافة المياه خلق الطين الماء المثلج. البرد الكتل على الجليد حتى أنهم من شدة البرد.
      ملاحظة: يمكن تعيين كتل الجليد ليصل إلى 1 يوم، ولكن إذا ترك بين عشية وضحاها، الكتل سوف تصبح رطب، وسوف تحتاج إلى أن تكون أعيدت معالجتها.
    4. إدراج كتلة المشبك كاسيت مبضع وإضافة الشفرة لحامل سكين، وإطلاق العنان لأي تدابير تأمين الحماية على الجهاز.
    5. نبدأ بقص الوجه كتلة البارافين (تواجه) في سمك 10 ميكرون. حالما يظهر مقطع يحتوي على منطقة التوصيل، إيقاف التشذيب وقفل الدوار مبضع، ونقل كتلة يعيدوه الجليد لالبرد. إذا كان كتل عدة أن يكون مقطوع، كتلة المواجهة كل قبل الانتقال إلى الخطوة 4.5.6.
    6. نقل النصل إلى جزء غير مستخدمة وجديدة ونقل الكتلة مرة أخرى إلى المشبك. فتح الجهاز ويبدأ التشذيب في 5 ميكرومترات كل قسم.
      ملاحظة: 5 ميكرومترات المستحسن للحصول على أفضل النتائج، ولكن أيضا مقبول 3-10 ميكرومتر.
    7. استخدام الملقط، نقل المقطع إلى حمام الماء 40 درجة مئوية، وتتيح للقسم انتشرت. نقل المقطع إلى شريحة غمس عمودياً في الماء.
      ملاحظة: غمس بزاوية يمكن نقل فقاعات من الجزء السفلي من الحمام للقسم ويسبب تشويها للعينة.
    8. تصور المقطع تحت المجهر (الشكل 2، ج).
      ملاحظة: إذا كان أورجانويد الحالي، سوف تظهر مشابهة للسهم الأحمر في الشكل 2. يمكن أن تظهر أورجانويدس فقاعات (الشكل 2B، السهم الأزرق) وهي أسهل لتمييز على شريحة جديدة كما أورجانويدس الجافة تظهر شفافة (الشكل 2). إذا كانت لا أورجانويدس موجودة، القسم زيادة في الكتلة.
  6. عندما اكتسبت الشرائح التي تحتوي على أورجانويدس، دائرة المنطقة المحيطة بالقسم على الجزء الخلفي الشريحة مع القلم علم الأنسجة وخبز بين عشية وضحاها في 45-50 درجة مئوية.
  7. جمع الشرائح والمضي قدما إلى ح & ه (راجع الخطوة 4.9.1)، المناعي (راجع الخطوة 4.9.2)، أو إيممونوفلوريسسينت تلطيخ (راجع الخطوة 5).
    ملاحظة: تظهر نتائج الممثل في الشكل 3B.
    1. لإجراء ح & ه تلطيخ، الحصول على مجموعة من قائمة المواد واتبع مواصفات الشركة المصنعة.
    2. القيام بتلوين المناعي، الحصول على مجموعة أدوات وجسم أساسي من قائمة المواد واتبع مواصفات الشركة المصنعة.

5. تلوين إيمونوفلوريسسينت من فب ومقطعة أورجانويدس

  1. جمع اللوازم: شريحة خبز من الخطوة 4، زيلين نفط، 100% EtOH، 95% EtOH، 70% EtOH، والمياه (دي ح2س)، كوبلين الجرار، 1 x مستضد استرجاع الحل (سترات الصوديوم المخزن المؤقت أو المخزن المؤقت تريس يدتا)، مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، 5% (مصل الحصان العادي دائرة الصحة الوطنية) مع المنظفات غير الأيونية 0.1% في برنامج تلفزيوني، 1% البقري ألبومين المصل (BSA) مع المنظفات غير الأيونية 0.3% في برنامج تلفزيوني، تلطيخ رف، وتلطيخ طبق، ديكلواكينج الدائرة والدائرة الرطوبة، درجة 1 والقلم حاجز مسعور 2 ° الأجسام المضادة للفائدة، وكونتيرستاينس من الفائدة.
  2. ديبارافينيزي وترطيب الشرائح بغمس في كوبلنس مليئة بالحلول التالية: زيلين نفط (الانخفاضات 3, 5 دقيقة)، 100% EtOH (الانخفاضات 2، 3 دقيقة كل)، 95% EtOH (الانخفاضات 2، 3 دقيقة كل) و 70% EtOH (الانخفاضات 2، 3 دقيقة كل) ودي ح2س (الانخفاضات 2 ، 3 دقيقة).
  3. ملء الطبق المصبوغة مع مستضد استرجاع الحل والدائرة ديكلواكينج قبل الحرارة إلى 100 درجة مئوية.
  4. إجراء استرداد مستضد بغمر الشرائح إلى طبق المصبوغة قبل ساخنة واحتضان لمدة 5 – 10 دقيقة عند 100 درجة مئوية. بمجرد اكتمال الدورة، تسمح الدائرة ديكلواكينج للجلوس لمدة 20 دقيقة قبل فتح الغطاء.
  5. مرة واحدة قد يبرد الطبق الشريحة إلى الرايت، ضع الطبق المصبوغة قيد التشغيل دي ح2س شطف الشرائح لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة الشرائح من طبق المصبوغة ورسم دائرة حول العينة بقلم حاجز مسعور، وتخطيط الشريحة في قاعة الرطوبة.
  7. كتلة أي جسم غير محدد تلطيخ بتطبيق النظام الصحي الوطني 5% مع المنظفات غير الأيونية 0.1% في برنامج تلفزيوني لدائرة مسعور حول العينة (ميكروليتر حوالي 30 مطلوب لتغطية العينة).
  8. شرائح المياه والصرف الصحي في كوبلنس مليئة ببرنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
  9. إضافة الأجسام المضادة 1° (جدول المواد) المخفف في جيش صرب البوسنة 1% بنسبة 0.3% المنظفات غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لدائرة مسعور حول العينة (ميكروليتر حوالي 30 ينبغي أن يشمل القسم)، ثم احتضانها ح 1 RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دائرة الرطوبة.
  10. يغسل الشرائح في كوبلنس مليئة ببرنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
  11. إضافة جسم مضاد 2° المخفف في جيش صرب البوسنة 1% بنسبة 0.3% المنظفات غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لدائرة مسعور حول العينة (حوالي 30 ميكروليتر سوف تغطي المنطقة)، ثم احتضانها ح 1 في RT في دائرة الرطوبة.
  12. يغسل الشرائح في كوبلين مليئة ببرنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
  13. إضافة DAPI، المخفف لمواصفات الشركة المصنعة، في جيش صرب البوسنة 1% مع المنظفات غير الأيونية 0.3% في برنامج تلفزيوني لدائرة مسعور حول العينة، ثم احتضانها لمدة 2-5 دقيقة في RT في الظلام (30 ميكروليتر).
  14. يغسل الشرائح في كوبلينس مليئة ببرنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
  15. تحميل الشرائح مع تصاعد أنتيفادي وسائل الإعلام وساترة، ثم تصور النتائج تحت مجهر.

6-تركيب كل من أورجانويدس لتلوين إيمونوفلوريسسينت

  1. جمع اللوازم: شريحة الدائرة أو [كنفوكل] طبق، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، مثبت، 50 مم NH4Cl في برنامج تلفزيوني، المنظفات غير الأيونية 0.1% في برنامج تلفزيوني، دائرة الصحة الوطنية 5% مع المنظفات غير الأيونية 0.1% في برنامج تلفزيوني، جيش صرب البوسنة 1% مع المنظفات غير الأيونية 0.3% في أجسام PBS، 1 و 2 درجة للفائدة، وكونتيرستينس للفائدة.
  2. بعناية قم بإزالة الوسائط قدر ممكن دون الإخلال بثقافة أورجانويد التي بيبيتينج ضد الجانب من البئر، ترك مساحة بين جل وسائل الإعلام ومصفوفة.
  3. استخدام المشذبة، الرطب مسبقاً مع وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني، 1,000 ميكروليتر ماصة تلميح، وضع قطره واحدة (25-50 ميكروليتر) لجل مصفوفة تحتوي على organoid(s) للفائدة والاستغناء عن إلى منتصف الشريحة الدائرة جيدا أو [كنفوكل] طبق.
    ملاحظة: جل مصفوفة 33% ليست صلبة. وهو سائل هلامي الذي يعالج مماثلة إلى جيلو التي لم تحدد تماما. سيمنع تلميح ماصة المشذبة مع فتح كبير أورجانويدس من كسر أثناء عمليات النقل.
  4. إذا أورجانويدس لا تزال في ثقافة الأم، تحل محل وسائل الإعلام مع الوسائط المستندة إلى كسفم الحارة.
  5. بالعين المجردة أو بنطاق تشريح، نضح جل وسائل الإعلام ومصفوفة الزائدة من الشريحة الدائرة مع ماصة نصيحة الغرامة (10 – 200 ميكروليتر).
    ملاحظة: من اختياري بريتريات الشريحة الدائرة مع كاشف انضمام.
  6. لوحة بحجم تساوي جل المصفوفة في بئر فارغة من الشريحة الدائرة كعنصر اختياري لمراقبة أوتوفلوريسسينسي من بقايا المصفوفة.
  7. ضع الشريحة الدائرة في حاضنة 37 درجة مئوية 30 – 45 دقيقة لتشجيع أورجانويد على التقيد بالزجاج ومنع فقدان عينات من خلال خطوات الغسيل.
  8. بيبيتينج ببطء لمنع مفرزة من الشريحة، وتغسل أورجانويدس مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الرايت بينما تهز برفق.
  9. إزالة 1 × برنامج تلفزيوني والإصلاح مع 200 ميكروليتر من بارافورمالدهيد 4% لمدة 30 دقيقة في الرايت بينما تهز برفق. تأكد من أن جل مصفوفة يظهر واضحا بعد هذه الخطوة.
    ملاحظة: التثبيت الميثانول أو الفورمالين أيضا ممكنة. أسلوب التثبيت ينبغي أن يكون الأمثل لأجسام مضادة محددة بعض أساليب التثبيت التشعب مستضدات الفائدة أو إخماد فلوري-وسم-البروتينات للفائدة.
  10. إزالة مثبت وتغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل طول الغسيل الخطوات تبعاً لحجم أورجانويد. خمس دقائق نقطة انطلاق كافية، ولكن يمكن أن تطول هذه الخطوة الغسيل حسب الحاجة.
  11. آرو أوتوفلوريسسينسي مع 200 ميكروليتر من 50 مم NH4Cl في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 30 دقيقة في الرايت بينما تهز برفق.
    ملاحظة: هذه الخطوة سوف يشفي أوتوفلوريسسينسي من الحطام في التجويف أورجانويد، ومن تعبير البروتينات الفلورية (مثل التجارة والنقل) الذي قد يقدم من التصميم التجريبي. فإنه ينبغي إدراج إذا كان مطلوباً لاستخدام فلوروفوري في قناة 488 لكن يمكن تخطي إذا رغبت في الحفاظ على إشارة التجارة والنقل.
  12. إزالة NH4Cl ويغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق.
  13. بيرميبيليزي أورجانويدس في 200 ميكروليتر من المنظفات غير الأيونية 0.1%-100 في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 30 دقيقة في الرايت بينما تهز برفق.
  14. إزالة المنظفات غير الأيونية 0.1%-100 1 × برنامج تلفزيوني ويغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق.
  15. كتلة مع دائرة الصحة الوطنية 5% مع 200 ميكروليتر من المنظفات غير الأيونية X-100 0.1% في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 60 دقيقة في الرايت بينما تهز برفق.
  16. إزالة المخزن المؤقت حظر ويغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق.
  17. تضعف جسم 1° في جيش صرب البوسنة 1% مع 0.3% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة إلى 200 ميكروليتر من الشريحة الدائرة، ثم احتضانها لمدة 1 – 3 في 4 درجات مئوية.
  18. إزالة جسم 1° ويغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق.
  19. تضعف جسم 2° في جيش صرب البوسنة 1% مع 0.3% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة إلى 200 ميكروليتر من الشريحة الدائرة، ثم احتضانها لمدة 1 – 3 في 4 درجات مئوية في الظلام.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون طول أوقات الاحتضان الأمثل لحجم أورجانويد والأجسام المضادة. بعض سيتطلب المزيد من الوقت لاختراق من خلال أورجانويد. تركيز الضد ستحتاج أيضا إلى أن يكون الأمثل. وبصفة عامة، 2 x تركيز المستخدمة للأبواب فب مناسب للأجسام المضادة 1° وتركيز نفسه للمقاطع فب المناسبة للأجسام المضادة 2°.
  20. إزالة جسم 2° ويغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق.
  21. كونتيرستاين الأكتين مع فالويدين والنواة مع DAPI أو هويخست، المخفف وفقا لتوصيات الشركة المصنعة في جيش صرب البوسنة 1% مع 0.3% تريتون-X في 1 x برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكروليتر إلى شريحة الدائرة، ثم احتضانها في RT لمدة 40 دقيقة في الظلام.
  22. جبل في 200 ميكروليتر 1 جديدة x برنامج تلفزيوني أو تركيب وسائل الإعلام والصورة مباشرة (الأسفار ينبغي الحفاظ عليها لمدة 5 أيام، أن لم يكن أطول). وتظهر نتائج الممثل في الشكل 3.
    ملاحظة: يمكن إضافة أزيد الصوديوم لعينات لمنع التلوث إذا كان تصوير [كنفوكل] ليست متاحة بسهولة. يمكن إضافة عامل تطهير لتحسين التصوير.

7-تركيب كل من أورجانويدس لفحوصات والمسابير نيون

ملاحظة: هناك فحوصات المتاحة تجارياً والمسابير/الأصباغ الفلورية (أمثلة مدرجة على قائمة المواد) التعديل للاستخدام في أورجانويدس الجامعة التي شنت لمراقبة مجموعة متنوعة من نقاط النهاية مفيدة19. البروتوكول التالي لعدة انتشار إيدو المسمى فلوريسسينتلي، ولكن يمكن تعديل أي مواد للاستخدام مع عينة مثبتة على كل.

  1. إزالة 50 ميكروليتر من وسائل الإعلام واستبدالها مع 50 ميكروليتر من 20 ميكرو 2 × يعمل الحل إيدو التي بيبيتينج ضد الجانب من البئر، ترك مساحة بين جل وسائل الإعلام ومصفوفة بعناية.
  2. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 – 3 أيام (الطول المطلوب من الوقت لإدماج إيدو ينبغي أن يكون الأمثل لنوع الخلية الاختيار).
  3. اتبع الخطوات من 6، 2 – 6.8 لنقل أورجانويدس للفائدة على شريحة الدائرة أو طبق [كنفوكل].
  4. إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاحها مع 200 ميكروليتر من بارافورمالدهيد 3.7 في المائة لمدة 30 دقيقة في الرايت بينما تهز برفق. التأكد من أن المصفوفة جل تظهر واضحة بعد هذه الخطوة.
  5. إزالة مثبت وتغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من المنظفات غير الأيونية 0.5%-100 في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 30 دقيقة في الرايت بينما تهز برفق.
  6. إعداد 1 س رد فعل الفلورسنت كوكتيل وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
  7. إزالة المنظفات غير الأيونية 0.5%-100 ويغسل مرتين مع 200 ميكروليتر من جيش صرب البوسنة 3% في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 5 دقائق في حين تهتز برفق.
  8. إضافة رد فعل كوكتيل واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
  9. إزالة رد فعل الفلورسنت كوكتيل ويغسل مرة واحدة مع 200 ميكروليتر من جيش صرب البوسنة 3% في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 5 دقائق بينما تهز برفق. كونتيرستاين وجبل باتباع خطوات 6.21 – 6.22 (3D الشكل).

Representative Results

عند نجاح ثقافة البشرية أورجانويدس البروستاتا الأولية، مورفولوجيا المفاضلة يمكن تقييم واستخدام تحليل صورة مشرقة الحقل وفب وتقنيات المصبوغة كلياً-جبل.

عملية التقاط صورة مشرقة الميدانية يتضح في الشكل 1A. نمت في مصفوفة 3D أورجانويدس وموزعين في جميع أنحاء الطائرات التنسيق المختلفة. لمراقبة أورجانويدس في التركيز عبر العديد من الطائرات، يقترح استخدام صورة شركة كهرباء فرنسا (الشكل 1B، حق) بدلاً من z-طائرة واحدة (الشكل 1B، اليسار). في المختبر، أورجانويدس نمت تحت ظروف تجريبية مختلفة قد تسفر التغييرات في التشكل. استخدام المجال والتدوير (المعرفة بكيفية مماثلة أورجانويد دائرة) ودائرة نصف قطرها ماكس/دقيقة (مقياس للطول) تعطي المستخدمين مؤشرا لحجم أورجانويد والشكل وتوفر قراءات القابلة للقياس الكمي مورفولوجيا. للتأكيد على فائدة هذه التدابير، تظهر الصور التمثيلية من أورجانويدس بمنطقة مشابهة ولكن مختلفة مورفولوجيا في الشكل 1، التي أورجانويد طويلة سوف تكون أقل تعميما ونسبة الحد الأقصى/الحد الأدنى أكبر من كروية أورجانويد.

يكون نقطة مفيدة مراقبة المناطق داخلية العينات والتأكد من أن النخر غير موجود داخل نواة أورجانويد التضمين أورجانويدس لعلم الأنسجة. وتقدم سير عمل لهذه العملية ونتائج العينات أونستينيد، مقطعة تحت مجهر مشرق الميدان الممثل في الشكل 2 أ، ب، ج. ويبين الشكل 3 ألف أورجانويد أساءوا (يسار) بالمقارنة بشكل صحيح لتسليم أورجانويدس في الشكل 3 ألف (يمين) و الشكل 3B. لتحديد التمايز-الحالة العينة، من المستحسن أن ننظر في الخلايا القاعدية علامات (سيتوكيراتين 5 و p63)8 جنبا إلى جنب مع الخلية لومينال علامات (سيتوكيراتين 8)8. إذا كان ذلك هو المطلوب لوصمة عار أورجانويدس في الموقع، كل جبل تلطيخ بديل مناسب، وترد هذه النتائج الممثلة في الشكل 3، دال

Figure 1
رقم 1: تقييم مورفولوجيا أورجانويدس في ثقافة 3D. (A) سير العمل بجمع وضغط الصورة للبشرية أورجانويدس البروستاتا الأولية التي حصل عليها ضوء منقولة مقلوب المجهر مع يجهز X/Y المرحلة ورفيق برنامج المسح الضوئي. (ب) صور الممثل z-مكدس واحد (يسار) مقابل. صورة شركة كهرباء فرنسا (يمين) من عينة كل بئر من البشرية أورجانويدس البروستاتا الأولية، تبين أن أورجانويدس أكثر في التركيز عندما يتم دمج مكدسات z متعددة في صورة واحدة المتوقعة (شريط المقياس = 1000 ميكرون). (C) الصور التمثيلية لنسبة غير المتشابهة شكلياً أورجانويدس البروستاتا الأولية البشرية التي لها نفس المنطقة منطقة والتدوير وماكس/دقيقة (شريط مقياس = 200 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: أورجانويد تضمين سير العمل والممثل تمزيقها النتائج. (أ) أورجانويد البروستاتا الأولية البشرية تضمين سير العمل. (ب) صورة تمثيلية شريحة جديدة أونستينيد، والتي تحتوي على أورجانويدس البروستاتا الأولية البشرية تحت مجهر حقل مشرق يصور أجار (السهم الأخضر)، وجل علم الأنسجة (السهم الأسود)، فقاعة (السهم الأزرق)، أورجانويدس (الأسهم الحمراء) (شريط المقياس = 1000 μ m)-(C) أونستاينيد طازجة قص الشريحة (يسار) مقابل. أونستينيد الشرائح الجافة (على اليمين)، أورجانويدس (الأسهم الحمراء) تظهر شفافة عند الجافة (شريط مقياس = 500 ميكرومتر) ويصعب تمييز تحت مجهر مشرق الميدانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تلطيخ نسيجية في مقطعة ومثبتة على كل أورجانويدس. (أ) ح & ه تلطيخ لكسر البشرية الأولية أورجانويد البروستاتا من امتهان (بيبيتينج العدوانية، بروتوكول المعالجة الخاطئة، اليسار) بجوار حسن التعامل مع أورجانويد (يمين) (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ب) البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية التي كانت ثابتة الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ البارافين، مقطوع، والملون مع سيتوكيراتين القاعدية 5 أو سيتوكيراتين لومينال 8 (أعلى) أو p63 القاعدية وسيتوكيراتين لومينال 8 (أسفل) وتصويرها مع (مجهر [كنفوكل] شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (C) ملطخة سيتوكيراتين القاعدية 5 أو سيتوكيراتين لومينال 8 مثبتة على كل بشرية الأولية البروستاتا أورجانويد وكونتيرستاينيد مع فالويدين و DAPI، تصويرها بالمجهر [كنفوكل] (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (د) أورجانويد مثبتة على كل بشرية الأولية البروستاتا خلية ملطخة فلوريسسينتلي المسمى إيدو وملطخة مضادة هويخست، تصويرها بالمجهر [كنفوكل] (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الثقافة أورجانوتيبيك طريقة جديدة مثيرة لأتصدى الأنسجة مع الراحة لبيئة في المختبر . في الوقت الراهن، تنمو مختبرات أورجانويدس من أنواع عديدة من الأنسجة لمختلف نقاط النهاية. الطرق الموضحة في هذه الورقة تلخيص نقاط النهاية مفيدة، وتسليط الضوء على تقنيات جديدة لوصف الثقافات الخلية البروستاتا الأولية 3D تماما.

وهناك مجموعة متنوعة من وصفات وسائل الإعلام لزراعة الخلايا البشرية البروستاتا الأولية أورجانويدس5،،من613. بينما الجميع تحقيق نتائج مجدية وقابلة للمقارنة، وسائل الإعلام على أساس كسفم13 يستخدم المواد المضافة إلى الحد الأدنى حتى يتم وصفها هنا. بالإضافة إلى ذلك، تم نشر ورقات استخدام تركيزات متعددة لجل مصفوفة، من 10% إلى 75% للثقافة أورجانويدس البروستاتا5،،من613. لأن جل مصفوفة كاشف مكلفة، وجل مصفوفة 33% قد ثبت أن تكون كافية لزراعة طويلة الأمد (2-3 أسابيع)،13من أورجانويدس قابلة للحياة، أونكلومبيد، وهذا هو تركيز الموصى بها. ومع ذلك، يمكن أن تختلف جل المصفوفة في تركيز البروتين بين الأرقام الكثير، حتى هذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند الطلاء. من المستحسن أيضا لشراء هلام مصفوفة بكميات كبيرة للاستخدام عبر عدة تجارب للحد من التضارب بين الكثير. وقد نشر مختبرات أخرى تنسيقات مختلفة لطلاء جل مصفوفة، مثل قطرات بدلاً من طلاء لوحة 96-جيدا جيدا5. تشكل كلا الأسلوبين أورجانويدس قابلة للحياة، ولكن بالشكل الموصوف هنا يسمح للخلايا لتكون مطلي أكثر قليلة، التي أظهرت لتشجيع توسيع نطاق الخلايا إلى أكبر أورجانويدس13. ومع ذلك، تصفيح الكثافة ينبغي أن يكون الأمثل القائم قبالة كفاءة تكوين خاصة بالمريض. هلام المصفوفة متاح في العديد من الأشكال بما في ذلك تخفيض عامل النمو، خالية من الفينول الحمراء، وعالية التركيز، إلخ. تخفيض عامل النمو ينصح بتعريف شروط الثقافة، وخالية من الفينول الأحمر المستحسن عند العمل مع الخلايا التي تعبر عن التجارة والنقل أو في التجارب التي تنطوي على التقاط صورة z-المكدس. من الأهمية بمكان إجراء أية خطوات الطلاء جل مصفوفة مع الكواشف المثلج، كمصفوفة جل يتصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة.

قد يؤدي التغييرات أورجانويدس نمت تحت علاجات تجريبية مختلفة للشكل، حتى تصوير مشرق حقل يستخدم على نطاق واسع لدراسة الملاحظة المورفولوجية تعمل. ومع ذلك، تسجيل وقياس المساحة أو الشكل تحد لسببين: 1) اختيار التحيز أثناء التقاط الصور و 2) تطبيق معلمة ثنائية الأبعاد مثل المجال لنموذج ثلاثي الأبعاد. استراتيجية واحدة لالتقاط الصور هو سجل حقل عشوائي وقياس عدد محدد سلفا من أورجانويدس في هذا المجال، ولكن يمكن أن يخلق ذلك التحيز أثناء التحديد، وقد لا تكون جميع أورجانويدس في الحقل المحدد في التركيز. تصوير كل جيدا الأمثل لتنسيق الميكروسكوبية 96-جيدا يلغي هذا التحيز أخذ العينات عن طريق جمع السكان أورجانويد كامل للفائدة. ومع ذلك، اعتماداً على أهداف المجهر من ناحية، قد تحتاج حقول متعددة جمعها وتجانب بغية الحصول على صورة الجامعة، حسنا. وقد وصف بعض مختبرات قياس المجال من z-طائرة واحدة12، ولكن لالتقاط جميع أورجانويدس في التركيز، من المستحسن لجمع وكومة طائرات متعددة في شركة كهرباء فرنسا-صورة واحدة13. وفي بعض الحالات، قد يتسبب غضروف في جل مصفوفة التظليل في الصورة، وأساليب تصحيح الخلفية قد تحتاج إلى تطبيق باستخدام برنامج تحليل الصور. حجم الدقيق مثالي القياس الأكثر ملائمة لحجم أورجانويد؛ ومع ذلك، هذا صعوبة الحصول على وجه التحديد، حتى مع صور z-المكدس متعددة. يمكن بسهولة حساب الأبعاد المورفولوجية الأخرى المفيدة، مثل التدوير ونسبة الحد الأقصى/الحد الأدنى، من جميع أورجانويدس في صورة هيئة كهرباء فرنسا كل بئر. معا، هذه الأساليب التغلب على أخذ العينات التحيز للتحديات وتمكين قياس البارامترات 2D من كائنات ثلاثية الأبعاد في الفضاء ثلاثي الأبعاد.

التثبيت الفورمالين وتضمين برافين أورجانويدس طريقة شائعة للحصول على الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، المناعي (المدينة)، وتلطيخ (إذا كان) إيمونوفلوريسسينت للتصور والتحليل6،11، 20-بيد أن المنشورات التي وصفت هذا الأسلوب تفتقر إلى تفاصيل شاملة عن عملية الدمج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد موقع أورجانويدس داخل كتلة البارافين الصعبة. قبل وصمة بعض مختبرات أورجانويدس مع تريبان الأزرق قبل التضمين للمساعدة في الموقع أثناء تقطيع11. يتضمن الأسلوب الموصوفة هنا استخدام صبغة النسيجي لتوجه جيلبلوج أورجانويد/علم الأنسجة خلال التضمين لتعزيز كفاءة تمزيقها. شرائح ح & ه تيسير دراسة نخر ومادة نووية، وانتشار، وهكذا ينبغي أن يكون نقطة إلزامية للثقافة أورجانويد التأكد من وجود خلايا صحية في جميع أنحاء المجال. قوة الثقافة أورجانويد هو أن عينات تتكون من خليط غير متجانس من الخلايا التي تشبه أفضل في فيفو أنسجة المريض. في البروستاتا، على سبيل المثال، الخلايا القاعدية ولومينال على حد سواء موجودة في البروستاتا أورجانويدس5، بينما الخلايا التي نمت في 2D عدم التفريق لومينال8. تقييم التمايز أورجانويد، من المستحسن أن الباحثين تقييم علامات القاعدية مثل CK5 و p63 وعلامات لومينال مثل مستقبلات الاندروجين و CK88. يمكن أيضا دراسة أي البروتينات تجريبية أخرى للاهتمام باستخدام هذه التقنيات المصبوغة.

على الرغم من تمكن المقاطع FFPE التصور الخلايا المقيمين في المقصورة الداخلية عن طريق النسجية أساليب (H & E، إذا، المدينة)، الصور تنحصر في المقاطع العرضية، وقد غيرت شكل أورجانويد قبل عملية الدمج. تلوين كل-جبل تمكن أورجانويد الملون ولوحظ في عين المكان، الحفاظ على الخصائص المورفولوجية تعمل وتسمح بصور للتعريب البروتين. تركيب كل أداة تستخدم لوصمة عار عينات الأنسجة الجامعة أو الجامع والحيوان، مثل الجنين الزرد أو الماوس، وتكييفها بسهولة أورجانويدس. تعديل الأسلوب الموصوفة هنا من الإجراء التي تتملكet al. 11تفاصيل النمو الأولية وثقافة أورجانويدس الجهاز الهضمي مباشرة على شريحة دائرة لتلطيخ، ويتطلب تثبيت ثقافة الأصل كاملة. الأسلوب المبين هنا ينطوي على نقل أورجانويد واحد (أو أورجانويدس) من الفائدة إلى شريحة دائرة في الوقت لتلطيخ. وهذا يتيح اختيار أورجانويدس الفردية لتحليل كل جبل في تجربة جارية دون تثبيت ثقافة الوالدين. عند القيام بتلوين كل جبل، من الضروري تحسين بيرميبيليزيشن وفترة حضانة للأجسام الأولية والثانوية لضمان تغلغل في جميع أنحاء العينة (في أي مكان من واحد أو أكثر من أيام هو مستحسن). وبمجرد تصويرها عبر الفحص المجهري [كنفوكل]، يمكن أن تنتج اﻷداءات ثلاثية الأبعاد لتمكين التعريب بروتين محدد والتصور وحساب عدد الخلايا الملون إيجابيا في عينة. التدفق الخلوي نقطة مفيدة تحديد حجم السكان القاعدية، لومينال، أو الخلايا الجذعية5،14. للقيام بذلك، استعاد جل مصفوفة الخلايا وفصلها برفق لتلطيخ. ينبغي للمستخدمين بعناية تحديد علامات مناسبة لفصل استناداً إلى الكتابات الحالية. للخلايا الظهارية البروستاتا البشرية الأولية، CD26 و CD49f بعلامات مناسبة لومينال والقاعدية، على التوالي5،21.

وباختصار، تفاصيل هذا البروتوكول النمو البشري أورجانويد البروستاتا الأولية وجمع نقاط النهاية التجريبية. من المذكرة، يمكن تطبيق تقنية متزايدة ووصف لمجموعة متنوعة من الاختبارات الأخرى التي تستخدم عادة لخلايا ثنائية الأبعاد، مثل الفلورسنت التجارب المستندة إلى التحقيق يبحث في انتشار19والمبرمج والبقع عضية سوبسيلولار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أسلوب جمع وتفكك الموصوفة هنا استعدادا ل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة18. جماعياً، وهذا يدل على إمكانية قيام مجموعة متنوعة من الرواية، النهاية عالية الدقة التي يمكن تحسين الباحثين واستكشاف في المستقبل.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء "اتحاد المحاكم الإسلامية بيوريسبوسيتوري"، الدكتورة كلارا فالي-ناجي، وأليكس Susma، فضلا عن أطباء، الدكتور مايكل أبيرن، ودانيال موريرا، وسيمون كريفاليرو، لتيسير اقتناء الأنسجة للثقافات الخلية الأولية. ونحن نشكر مرضى "المسالك البولية اتحاد المحاكم الإسلامية" للتبرع الأنسجة للبحوث. تم تمويل هذا العمل، في جزء منه، إدارة للدفاع البروستات سرطان البحث برنامج الصحة الفوارق فكرة جائزة PC121923 (نون) ومركز اتحاد المحاكم الإسلامية السريرية وترجمة العلوم بريدوكتورال التعليم (السريرية والعلماء متعدية برنامج PECTS) (McCray وريتشاردز) ومن معاهد الصحة الوطنية في المعهد الوطني للسرطان، ومنحة أرقام U54CA202995، U54CA202997، و U54CA203000، المعروف "شيكاغو الصحة الإنصاف التعاونية" (نون وريتشاردز). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الدفاع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells of interest
Keratinocyte-SFM (KSFM) ThermoFisher Scientific 17005042
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) ThermoFisher Scientific 12676029
5α-Dihydrotestosterone (DHT) Sigma-Aldrich D-073-1ML
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Matrigel (matrix gel) Corning Various Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application
Ice Bucket
Cell Culture Hood
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical ThermoFisher Scientific 05-408-130, 339650
Centrifuge
Dispase (neutral protease) STEMCELL Technologies 7923 neutral protease
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025076
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018 suggested RNA extraction solution
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900 suggested protein extraction solution
DNAzol ThermoFisher Scientific 10503027 suggested DNA extraction solution
Organoids
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Brightfield microscope with camera capabilities ex. ‎EVOS FL Auto Imaging System
Photo analysis software ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler
Graphing software ex. Graphpad, Excel, etc
Organoids
Ice pack
Masking tape
Pipette tips (1000 μL)
Razor blade
Dispase STEMCELL Technologies 7923
Agarose Sigma-Aldrich A9045
HistoGel (histology-gel) ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Pencil
"Plunger" from 1 cc insulin syringe
Tissue Casette Thomas Scientific 1202D72
Container to hold fixative
10% neutral buffered formalin (NBF) Sigma-Aldrich HT501128
Histology pen, xylene and EtOH-resistant Sigma-Aldrich Z648191-12EA STATMARK pen
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 For fixation and graded dilutions during processing
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water
Paraffin Leica various
Tissue processor
Embedding workstation
Economy Tissue Float Bath Daigger EF4575E XH-1001
Microtome
Microtome blades Ted Pella 27243
Positively charged microscope slides Thomas Scientific 1158B91
Laboratory Oven ThermoFisher Scientific PR305225G
Hematoxylin and Eosin Stain Kit Vector Laboratories H-3502 Suggested H&E staining kit
ABC Peroxidase Standard Staining Kit ThermoFisher Scientific 32020 Suggested immunohistochemistry staining kit
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) Cell Signaling Technology 5153S Suggested primary antibody for IHC
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 dilutions should be performed using deinoized water
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water (DI H2O)
Antigen retrieval solution Sigma-Aldrich, Abcam C9999, ab93684
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Coplin Fisher Scientific 19-4
Staining rack IHC World M905-12DGY
Staining dish IHC World M900-12B
Decloaking chamber Biocare Medical DC2012
Humidity chamber Thomas Scientific 1219D68
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Microscope cover glass Globe Scientific 1414-10
Anti-fade mounting media ThermoFisher Scientific S36972
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240 optional adherent reagent
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
4% paraformaldehye (PFA) Biotium 22023 other fixatives such as methanol or formalin can be used
50mM NH4Cl sigma-Aldrich 254134
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum (NHS) thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin (BSA) sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Counterstain (phalloidin) thermoFisher Scientific A22287
Sodium azide sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Visikol HISTO-M Visikol various optional clearing agent
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Cell assay of interest Various Various Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)
Organoids
Ice bucket
Cell culture hood
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical
Microcentrifuge
Dispase STEMCELL Technologies 7923
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175079
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap Fisher Scientific 08-771-23
Cytokeratin 5 Antibody - FITC Millipore Sigma FCMAB291F Suggested flow antibody
Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 Abcam ab210139 Suggested flow antibody
CD49f - Alexafluor 647 BioLegend 313609 Suggested flow antibody
CD26 - PE BioLegend 320576 Suggested flow antibody
Flow cytometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  2. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  3. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
  4. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  7. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
  8. Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
  9. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
  10. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
  11. Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
  12. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
  13. Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
  14. Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
  15. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
  16. Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
  17. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
  18. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  19. Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، 143 قضية، أورجانويد، ونقطة النهاية، 3D، كوانيفيكيشن، وتحليل الصور، فب، كل جبل، مورفولوجيا، والبروستاتا، والإنسان، الفلورة
معالجة وتقييم الثقافة البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCray, T., Richards, Z., Marsili,… More

McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. J. Vis. Exp. (143), e59051, doi:10.3791/59051 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter