Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以指导人类的原发性前列腺有机体处理, 然后建议终点, 以评估表型。介绍了种子、培养维护、基质凝胶回收、形态定量、嵌入切片、ffpe 切片、全装染色及商业检测的应用。
Abstract
本文详细介绍了人类原发性前列腺组织的三维培养、处理和评价。这个过程包括在96孔微板上的三维基质凝胶中疏生地播种上皮细胞, 并通过介质变化来培育向有机体的扩张。然后通过对 z 堆栈图像的整井捕获来评估形态。z 堆栈的压缩创建一个单一的焦点图像, 从中测量有机体, 以量化各种输出, 包括圆度、圆度和面积。脱氧核糖核酸、rna 和蛋白质可以从基质凝胶中回收的有机生物中收集。感兴趣的细胞群可以通过有机体离解和流式细胞仪进行评估。福尔马林固定石蜡包埋 (ffpe), 然后切片用于组织学评估和抗体染色。全安装免疫荧光染色保存有机体形态, 并促进观察蛋白质定位在有机生物原位。传统上用于2d 单层细胞的商业检测可以修改为三维有机体。结合使用, 该协议中的技术提供了一个可靠的工具箱来量化前列腺有机体的生长, 形态特征, 和分化标记的表达。
Introduction
有机体是研究器官发生和疾病的宝贵工具。它们为动物模型提供了一种成本更低的替代品, 患者衍生的有机生物正在发展成为个性化医学1、2、3 的策略。这种三维 (3d) 培养系统包括将干细胞或祖细胞 (从组织或诱导多能干细胞中提取) 播种到细胞外基质成分的凝胶 (基质凝胶)4中。细胞增殖和分化, 形成组织型结构, 重述感兴趣器官功能单元的细胞层次和形态。有机物质是利用来自各种器官的细胞生长的, 包括唾液腺、胃、肠、肝脏、前列腺、肺和大脑4.虽然有许多协议描述步骤建立前列腺有机化合物5,6, 它是具有挑战性的找到足够详细的方法, 如何实现定量终点从有机体。本文总结了为人类原发性前列腺细胞开发的方法, 并详细介绍了一系列评估有机体表型的建议终点。这些技术针对前列腺有机体进行了优化, 可能适用于其他三维细胞培养。
前列腺类有机体培养体最近已成为一种有价值的体外模型, 缺乏使用已建立的永生细胞系的单层培养的局限性。良性前列腺上皮和前列腺癌是一个挑战, 以模型在体外使用永生细胞系。良性细胞系的数量是有限的, 都经历了癌基因7的转化。单层的原发前列腺上皮细胞不分化为腔细胞, 缺乏雄激素受体8。大多数前列腺癌细胞系没有功能性雄激素受体, 这是早期疾病状态的重要中介, 缺乏在患者肿瘤9中发现的关键基因变化。前列腺类有机体培养物可从良性上皮中轻松生长, 对研究干细胞特性、祖细胞、分化和微环境实验变化的影响有价值4,5。前列腺癌有机体可以作为一种精确的医学方法的一部分来种植, 以模拟病人的疾病和对治疗10的反应.
该协议是根据使用各种细胞类型的现有协议汇编的, 但在这里已经优化, 可用于人类原代前列腺细胞。它是对 sawyers、clevers 和 shen 5,6 概述的描述前列腺小鼠和人体有机体生长、传代、明亮场成像、冷冻保存、rna 和 dna 分离的协议的补充。整个装载协议由 mae等人修改.11, 谁使用胃肠上皮类固醇, 并描述活体成像和冷冻和石蜡嵌入。borten等人12描述了从明亮场成像的乳房, 结肠和结直肠癌有机体形态的分析。此外, richards等人。13. 采用前列腺有机体形态形态学评价的方法。最后, 胡等人.14描述了一种方法, 坚持前列腺有机体粘附到房间滑块过夜之前, 免疫荧光染色观察单个细胞和分散球体流式细胞仪分析。
该协议的目标是将这些技术上具有挑战性的方法作为一种协议, 包括细胞播种, 充分详细地演示这些方法;培养基和基质凝胶维护;流式细胞仪的细胞集合;rna、dna 和蛋白质提取;从明亮场 z 堆栈分析中进行形态学评估组织学染色的包埋、处理和切片;和整个安装用于免疫荧光或荧光探针检测。这些不同端点的生物学相关性和解释将因实验设计和用于分析的抗体而异。通过利用此协议, 用户应该准备好使用终结点工具包进行实验。
人类原发性前列腺上皮细胞 (pre) 是根据 peehl 15,16 描述的协议在实验室中建立的, 并按照前面描述的 17, 维持到数量有限的通道 (最多 4个), 但它们也是可从商业供应商处获得。肝细胞无血清培养基为基础 6, ksfm 为基础的13和 r-bosi1-条件5培养基都被作为成功生产了有机化合物而出版。基于 ksfm 的添加剂所需的添加剂数量最少, 因此这里对此进行了描述。
Protocol
下面的协议是使用从芝加哥伊利诺伊大学医院的病人组织中提取的人类原发前列腺上皮细胞进行优化的。用于这些实验的所有人体组织都是通过机构审查委员会批准的协议和芝加哥伊利诺伊大学的豁免获得的。虽然培养条件会根据感兴趣的细胞类型而有所不同, 但端点可应用于其他组织的有机体。
1. 上皮细胞渗入基质凝胶和改变培养基
- 收集必要的材料: 人类原代前列腺上皮细胞 (pre)、冰上基质凝胶、96孔微板、冰上角质形成细胞无血清学介质 (ksfm)、木炭剥离胎血清 (fbs) 和双氢睾酮 (dht)。
- 将47.5 毫升的 ksfm 木炭剥离 fbs 和双氢睾酮 (dht) 与 10 nm dht 的最终浓度结合起来, 然后在冰上保留, 从而制备基于 ksfm 的有机介质。
- 使用无菌技术将细胞放入细胞培养罩中的三维基质中。
- 轻轻混合冷 ksfm 为基础的有机介质与冰凉基质凝胶, 通过缓慢地上下移液获得50% 的基质凝胶混合物, 避免气泡。
注: 基质凝胶应在4°c 下解冻一夜, 并尽可能保持在冰上。它可在室温 (rt) 下快速固化。 - 在冷介质中预湿移液器尖端, 并将40–50μl 的50% 基质凝胶转移到每个井的底部, 用于96孔板。将井底涂在一起, 形成基层。
注: 不要完全分配到移液器上的第二个停止, 因为这会产生气泡。 - 将96孔板放入37°c 孵化器中30–45分钟, 以固化基层。
注意: 在基层凝固之前, 不要将上皮细胞粘在基层上, 否则细胞可能会通过基质掉到板的底部, 作为单层生长。 - 将悬浮在 cells/100 基有机体介质中的上皮细胞与基质凝胶混合, 最终浓度为100–1000细胞100μl 和33% 的基质凝胶。基层顶部的板上皮细胞, 每口用100μl 的33% 基质凝胶细胞混合物。
注: 先前的实验表明, 在3d 中种子上皮细胞过于密集将限制有机体生长的大小, 而播种过于稀疏可能会导致非常低的产量13。根据患者特有的有机体形成效率, 优化细胞类型的播种条件对其进行优化具有重要意义。
- 轻轻混合冷 ksfm 为基础的有机介质与冰凉基质凝胶, 通过缓慢地上下移液获得50% 的基质凝胶混合物, 避免气泡。
- 将96孔板放置在37°c 孵化器中 30-45分钟, 使基质凝胶凝固, 然后通过缓慢地移液在井边上移液, 在细胞顶部轻轻添加100μl 的 ksfm 有机介质。
- 每2-3天更换一次媒体。在井侧移液, 在介质和基质凝胶之间留出空间, 小心去除50μl 介质, 并更换50μl 的新鲜介质。
注: 对于长期培养, 基质凝胶需要每2-3周更换一次。如果基质凝胶培养出现不稳定, 并在显微镜下显示半透明的皱纹, 那么基质凝胶已经分解, 需要更换。
2. 从基质凝胶中收集有机生物
注: 用于基质凝胶的变化、传代或 rna 提取终点、dna 提取、蛋白质提取和流式细胞术, 需要收集有机生物。
- 在37°c 的水浴中, 温暖中性蛋白酶和汉克斯的平衡盐溶液 (hbss)。
- 在不破坏基质凝胶的情况下, 小心地从井中取出介质。
- 在基质凝胶的 ~ 1:2 比下, 在每口井中加入 ~ 200μl 中性蛋白酶: 中性蛋白酶, 在37°c 孵育20分钟。
- 机械解离基质凝胶: 中性蛋白酶混合物通过移液上下。
- 在37°c 下孵化20分钟。
- 根据体积的不同, 将中性蛋白酶-基体凝胶细胞混合物转移到微离心管或锥形管。以 300 x g离心, 3分钟至5分钟。
注: 如果没有细胞颗粒出现, 基质凝胶可能不会完全分离, 可以可视化为一个半透明的相, 在管的底部不同于粉红色上清液。去除上清液, 以1:2 的比例添加更多中性蛋白酶, 将凝胶颗粒基质, 在37°c 下再孵育 20-40分钟, 并以 300 x g 的速度重复离心. - 当获得有机体颗粒时, 去除上清液。继续进行传代 (参见步骤 2.7.1)、用于 rna、dna 或蛋白质提取的有机裂解 (请参阅步骤 2.7.2)、流式细胞仪处理单个细胞和单细胞测序 (见步骤 2.7.3)。
- 对于长期培养, 按照步骤 1.1-1.5 中描述的步骤, 在33% 的新鲜基质凝胶和板中轻轻重新悬浮完整的有机体。要分离有机体并作为单个细胞复制, 请将颗粒重新悬浮在1毫升的温热细胞离解酶中, 在37°c 孵育 10-15分钟, 用 hbss 的5毫升清洗一次, 并按照步骤 1.1-1.5 在新鲜基质凝胶中重新装板。
- 将有机体颗粒重新用于适当的裂解缓冲液中, 用于 rna 提取、dna 提取或蛋白质提取, 如材料表所列, 并遵循制造商的协议。
- 在1毫升的温细胞离解酶中重新杀存在有机生物, 并在37°c 孵育 10-15分钟, 将有机体分解成单个细胞。用 hbss 的5毫升清洗一次, 并采用流式细胞仪5或单细胞测序18的协议.
注: 要在低浓度的基质凝胶中分离成单个细胞, 可能不需要中性蛋白酶, 并且细胞分离酶可以在步骤2.2 后直接应用于井中。
3. 全井图像采集与有机形态分析
- 使用电动 xyy 扫描阶段 (工作流程如图1a 所示), 使用透射光倒置显微镜采集整井 z 堆栈图像。
- 当焦点位置调整到井底时, 开始向上聚焦, 直到遇到第一个有机体, 由于从基层的半月板, 才会在井的中心。在此位置设置底部 z 平面。
- 继续向上聚焦, 直到最后一个有机体聚焦, 这将是在井的外围。在此位置设置顶部 z 平面。
注: 设置 z 堆栈的顶部和底部后, 请确保这些位置捕获所有剩余油井中的有机体, 并根据需要调整顶部/底部。这样, z 范围就可以用于一次扫描, 其中包括每口井内的每一个有机体。 - 每个井捕获 15–35 z 平面, 使用较大的数字以获得更高的分辨率。捕获整个油井图像, 根据需要合并和收集象限或子节。
注: 建议采用多个 z 平面, 而不是单个 z 平面, 如图 1 b所示, 其中有机体在捕获一个 z 平面时不对焦。 - 保存 z 堆栈图像以进行下游分析。
- 使用具有自由绘图功能的图像软件分析图像。
- 从步骤3.1.4 打开单个 z 平面图像集。
- 如果需要, 将在每个 z 平面拍摄的图像平铺为一个完整的图像。将新映像另存为单独的文件。对获取的每个 z 平面重复此过程。
- 使用图像软件, 从一个井打开每个 z 平面的整井图像, 并从 z 平面堆栈创建扩展的景深 (edf) 图像。
注: 这种类型的图像将选择每个 z 平面的最佳焦点区域, 以创建一个井的焦点图像。 - 将软件的像素比例设置为要测量的图像的比例栏。
- 利用图像软件的自由绘制工具, 追踪井中每一个有机体的周长。
- 从图像软件中获取跟踪的有机体周长的测量指标。
注: 推荐的参数是面积、循环和最大最小半径比。图 1c 显示了说明这些指标应用的代表性结果。面积是根据有机体周长定义的多边形计算的。循环是有机体面积与直径等于有机体最大雪貂的圆面积的比率, 其中0是较少的圆形, 1 是较圆的。最小半径比是被追踪的有机体的最大半径和最小半径之间的比率。
循环 =
半径比 =
4. 用于组织学终点的有机生物的福尔马林固定和石蜡嵌入
- 准备嵌入用品: hbss, 2% 琼脂溶液, 组织学标记染料, 组织学凝胶, 液尖模具, 胶带, 从 1 cc 胰岛素注射器的柱塞, 冰袋, 盒式磁带, 10% 中性缓冲福尔拉林 (nbf), 铅笔, 和75% 的组织学分级乙醇 (etoh)。
- 准备两个2% 琼脂溶液的微离心管。在水浴中或在100–110°c 的热块中孵化, 以保持琼脂的液体形式。在2% 琼脂溶液中加入1–2滴组织学标记染料, 这将表示琼脂插头的顶部, 并有助于在嵌入过程中保持方向。混合好。
- 在55–65°c 的水浴或热块中加热组织学凝胶。
- 使用1000μl 移液器尖端, 通过切割移液器尖端的一小部分来制造模具, 从而形成一个容纳 ~ 50μl 的圆柱体。创建第二个更宽的模具, 适合在第一个模具周围。
- 用胶带 (胶带边) 包裹一个冰袋, 并将模具粘在胶带上, 从而创建一个冷块。
- 从 1 cc 胰岛素注射器中取出柱塞, 创建柱塞。
- 按照图 2a所示的工作流程, 将有机体嵌入组织凝胶塞进行处理。
- 按照步骤2.1-2.7 分离基质凝胶和颗粒有机体。
- 用 hbss 1 毫升清洗一次有机体颗粒, 然后在 300 x克旋转 3-5分钟, 去除上清液。
- 在30-50μl 的液体组织学凝胶中重新悬浮有机体颗粒。通过缓慢向上和向下移液轻轻混合。将组织学明胶-有机体混合物转移到冷块上的模具中, 并使试样冷却并凝固成一个插头。
- 使用柱塞将插头从小模具中推出, 并插入较大的模具。移液器清除2% 琼脂周围的插头, 以填补较大的模具。
- 移液剂组织学染色染色2% 琼脂在插头上, 以表示样品的顶部。
- 冷却后, 使用柱塞将插头转移到组织学盒式磁带中。用铅笔将盒式磁带贴上标签, 并将盒式磁带放入10% 的 nbf 中, 以便隔夜固定。
- 将盒式磁带从10% 的 nbf 转移到70% 的组织学等级 etoh。
- 如果有的话, 使用处理器上的预置活检协议处理组织学凝胶插头。如果预设不可用, 请输入以下序列和长度: 70% etoh 6分钟, 70% etoh 10分钟, 80% etoh 10分钟, 95% etoh 2次 10分钟, 100% etoh 3次, 二甲苯 3次, 15分钟, 石蜡 3次, 15分钟. 偏离建议的处理顺序可能会导致有机体破裂 (图 3 a)。
- 嵌入组织学凝胶塞与彩色部分朝上, 因为这将允许含有有机体的变色部分被切割成第一。
- 部分 ffpe 组织学凝胶块:
- 收集必要的用品: ffpe 组织学凝胶块, 组织学笔, 组织浮水浴, 冰桶与冰, 微孔, 微孔叶片, 嵌入, 正电荷显微镜幻灯片, 和实验室烤箱。
- 将水浴灌满至非常满, 并设置为 40°c, 然后预热实验室烤箱至45–50°c。
- 准备一个冰桶, 然后加满冰, 并添加水, 以创建一个冰水泥浆。把方块冷却在冰上, 直到很冷。
注: 块可以设置在冰上长达 1天, 但如果连夜离开, 块将变得水合, 需要重新处理。 - 将方块插入微型盒式磁带夹具, 将刀片添加到刀架上, 并解锁机器上的任何保护锁定措施。
- 首先, 以10μm 的厚度修剪石蜡块的表面 (朝外)。一旦出现包含插头区域的部分, 停止修剪, 锁定微孔转子, 并将块转移回冰面冷却。如果要分割几个方块, 则在移动到步骤4.5.6 之前, 对每个块进行对峙。
- 将刀片移动到新的未使用部分, 并将块移回夹具。解锁机器, 并开始以每节5μm 的速度进行修剪。
注: 建议使用5μm 以获得最佳效果, 但也可接受3–10微米。 - 使用推子, 将部分转移到 4 0°c 的水浴中, 让部分展开。通过垂直浸入水中, 将部分转移到幻灯片上。
注: 以一定角度浸渍可以将气泡从浴缸底部转移到部分, 并导致样品变形。 - 在显微镜下可视化截面 (图 2b, c)。
注: 如果存在有机体, 它将类似于图2b 中的红色箭头。泡泡 (图 2b, 蓝色箭头) 可能看起来类似于有机生物, 并且更容易在新鲜的幻灯片上识别, 因为干燥的有机体看起来半透明 (图 2c)。如果没有有机生物存在, 则再进入块部分。
- 当含有有机生物的幻灯片被获取后, 用组织学笔在幻灯片背面的部分周围循环, 并在45–50°c 下烤一夜。
- 收集幻灯片并进行 h & e (请参阅步骤 4.9.1)、免疫组织化学 (请参阅步骤 4.9.2) 或免疫荧光染色 (见步骤 5)。
注: 具有代表性的结果如图3b 所示。- 要进行 h & e 染色, 请从材料列表中获取试剂盒, 并遵循制造商的规格。
- 要进行免疫组织化学染色, 请从材料清单中获取试剂盒和原代抗体, 并遵循制造商的规格。
5. ffpe 和分离有机体的免疫荧光染色
- 收集耗材: 从步骤 4, 二甲苯, 100% etoh, 95% etoh, 70% etoh, 去离子水 (di h2o), 共聚糖罐, 1x 抗原回收溶液 (柠檬酸钠缓冲液或 edta-tris 缓冲液), 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 5% 正常的马血清 (nhs) 与0.1% 的非离子洗涤剂在 pbs, 1% 牛血清白蛋白 (bsa) 与0.3% 非离子洗涤剂在 pbs, 染色架, 染色盘, 脱脂室, 疏水屏障笔, 湿度室, 1°和2°的利益和反色兴趣。
- 通过浸入充满以下解决方案的共应用, 对幻灯片进行分离和补水: 二甲苯 (3 滴, 每次 5分钟), 100% etoh (2 滴, 每次 3分钟), 95% etoh (2 滴, 每次 3分钟), 70% etoh (2 滴, 每次 3分钟), 和 di h2o (2 滴水, 每次 3分钟)。
- 用抗原回收溶液填充染色盘, 并将预热脱脂室灌至100°c。
- 通过将幻灯片浸入预热染色盘进行抗原回收, 并在100°C 孵育5-10分钟。循环完成后, 让脱孔室在打开盖子前坐20分钟。
- 将滑盘冷却到 rt 后, 将染色盘放在运行的 dih2o 下, 冲洗滑梯5分钟。
- 从染色盘中取出幻灯片, 用疏水屏障笔在样品周围画一个圆圈, 然后将幻灯片放置在湿度室上。
- 通过在 pbs 中使用 5% nhs 与0.1% 的非离子洗涤剂在样品周围的疏水循环中应用5% 的 nhs 来阻止任何非特异性抗体染色 (需要大约30μl 来覆盖样本)。
- 用填充 pbs 的共装中清洗幻灯片 3次, 每次5分钟。
- 将在 1% bsa 中稀释的1°抗体 (材料表) 与 pbs 中0.3% 的非离子洗涤剂一起稀释到样品周围的疏水循环中 (约30μl 应覆盖部分), 然后在 rt 孵育 1小时, 或在湿度室中隔夜孵育。
- 用充满 pbs 的卷板清洗幻灯片 3次, 每次5分钟。
- 将在 1% bsa 中稀释的2°抗体与 pbs 中0.3% 的非离子洗涤剂添加到样品周围的疏水循环中 (约30μl 将覆盖该区域), 然后在湿度室的 rt 中孵育1小时。
- 用填充 pbs 的共装清洗幻灯片 3次, 每次5分钟。
- 添加 dapi, 稀释到制造商的规格, 在 1% bsa 与0.3% 的非离子洗涤剂在 pbs 到周围的样品周围的疏水循环, 然后在黑暗中在 rt 孵育 2-5分钟 (30μl)。
- 用充满 pbs 的卷板清洗幻灯片 3次, 每次5分钟。
- 使用防褪色安装介质和盖板安装幻灯片, 然后在显微镜下可视化结果。
6. 免疫荧光染色有机生物的整体安装
- 收集用品: 室滑梯或共焦盘, 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 固剂, 50 mm nh4 cl在pbs, 0.1% 的非离子洗涤剂在 pbs, 5% nhs 与0.1% 的非离子洗涤剂在 pbs, 1% bsa 与0.3% 非离子洗涤剂在 pbs, 1°和2°抗体利益, 和利益的反污渍。
- 小心地去除尽可能多的介质, 而不会通过移液对井边的移液来破坏有机体培养, 在介质和基质凝胶之间留下空间。
- 使用经过修剪的、预湿的介质或 pbs、1, 000μl 移液器尖端, 绘制一滴 (25–50μl) 的基质凝胶, 其中包含感兴趣的有机体, 并放在室滑井或共焦盘的中间。
注: 33% 的基质凝胶不是固体。它是一种胶状液体, 处理类似于没有完全设置的果冻。一个修剪的移液器尖端与一个大的开口将防止有机体在转移过程中破裂。 - 如果有机体仍留在父母文化中, 则用基于 ksfm 的温暖媒体取代媒体。
- 使用肉眼或解剖范围, 用细尖移液器 (10–200μl) 从腔内滑块中吸气多余的介质和基质凝胶。
注: 使用粘附试剂预处理腔内滑块是可选的。 - 将等量的基质凝胶放入腔内滑块的空井中, 作为可选的控制, 以观察剩余基质的自荧光。
- 将室滑块放置在37°c 孵化器中 30-45分钟, 以促进有机体粘附在玻璃上, 并防止清洗步骤中的样品丢失。
- 慢慢移液, 防止脱离滑块, 在轻轻晃动的同时, 用200μl 的 1x pbs 清洗有机体5分钟。
- 取下 1x pbs, 在轻轻晃动时, 用200μl 的4% 甲醛固定30分钟。确保在此步骤之后, 基质凝胶显示清晰。
注: 甲醇或福尔拉林固定也是可能的。固定方法应针对特定抗体进行优化, 因为某些固定方法可能会将感兴趣的抗原交联或淬火感兴趣的荧光标签蛋白。 - 取下固定装置, 用200μl 的 1x pbs 清洗 5分钟, 同时轻轻晃动。
注: 清洗步骤的长度应根据有机体的大小进行优化。五分钟是一个足够的起点, 但清洗步骤可以根据需要加长。 - 在 1x pbs 中使用200μl 的 50 mm nh 4 cl在rt 中30分钟轻轻晃动时进行自动荧光。
注: 此步骤将从有机体腔内的碎片和可能出现在实验设计中的荧光蛋白表达 (如 gfp) 中解压自荧光。如果需要在488通道中使用荧光体, 则应将其包括在内, 但如果需要, 可以跳过以保留 gfp 信号。 - 取下 nh4 cl, 用200μl 的 1x pbs 清洗两次, 轻轻晃动5分钟。
- 在200μl 中渗透有机物质, 0.1% 非离子洗涤剂-100 在 1x pbs 中, 在 rt 中轻轻晃动30分钟。
- 在 1x pbs 中取出0.1% 的非离子洗涤剂-100, 用 1x pbs 的200μl 清洗两次, 在轻轻晃动的同时进行5分钟。
- 用 200μl 0.1% 的非离子洗涤剂 x-100 在 pbs 中使用5% 的 nhs 块, 并在轻轻晃动时在 rt 孵育60分钟。
- 取下封堵缓冲液, 用200μl 的 1x pbs 清洗两次, 轻轻晃动5分钟。
- 用 0.3% triton x-100 在 1x pbs 中稀释 1% bsa 中的1x 抗体, 并将其添加到腔内幻灯片的200μl 中, 然后在4°c 下孵育1-3天。
- 取出1x 抗体, 用200μl 的 1x pbs 清洗两次, 轻轻晃动5分钟。
- 用 0.3% triton x-100 在 1x pbs 中稀释 1% bsa 中的2°抗体, 并在室内滑动液中添加 200μl, 然后在黑暗中4°c 孵育1-3天。
注: 培养时间的长度应针对有机体大小和抗体进行优化。有些需要更多的时间才能穿透有机体。抗体浓度也需要优化。一般情况下, 用于 ffpe 切片的浓度为2倍适用于1°抗体, 而 ffpe 部分的相同浓度适用于2x 抗体。 - 取出2°抗体, 用200μl 的 1x pbs 清洗两次, 轻轻晃动5分钟。
- 用 phapi 和 hoescht 用丁烯胺和细胞核来对抗肌动蛋白, 根据制造商的建议在 1% bsa 中稀释, 在 1x pbs 中稀释0.3% 的三氯丁酮-x。在室内滑梯上加入 200μl, 然后在黑暗中在 rt 孵育40分钟。
- 立即将200μl 的新鲜 1x pbs 或安装介质和图像安装 (荧光应保存长达 5天, 如果不是更长的时间)。有代表性的结果如图 3c所示。
注: 如果共聚焦成像不容易获得, 可以将氮化钠添加到样品中, 以防止污染。添加清除剂可以改进成像。
7. 用于检测和荧光探针的有机体的整体安装
注: 有商业上可获得的检测和荧光探针染料 (例如包括在材料清单上) 修正, 可用于全装有机生物, 以观察各种有用的端点 19.下面的协议适用于荧光标记的 edu 增殖试剂盒, 但任何试剂盒都可以修改为与整个安装样品一起使用。
- 小心去除50μl 介质, 并通过在井侧移液, 在介质和基质凝胶之间留出空间, 以50μl 的 20μm 2x 工作 edu 溶液代替。
- 在4°c 下孵化 1-3天 (应根据所选择的细胞类型优化 edu 整合所需的时间长度)。
- 按照步骤 6.2-6.8 将感兴趣的有机体转移到室内滑梯或共焦盘上。
- 在轻轻晃动的情况下, 取出 pbs 并固定200μl 的3.7% 的甲醛30分钟。确保在此步骤之后, 基质凝胶显示清晰。
- 取下固定装置, 用200μl 的 1x pbs 清洗 5分钟, 同时轻轻晃动。取出 pbs, 在 1 x pbs 中加入200μl 的0.5% 非离子洗涤剂 100, 在 rt 中轻轻晃动30分钟。
- 根据制造商的规格准备1x 荧光反应鸡尾酒。
- 在 1 x pbs 中, 用200μl 的 3% bsa 在 1 x pbs 中取下0.5% 的非离子洗涤剂-100, 用200μl 清洗 5分钟, 同时轻轻晃动。
- 在黑暗中加入反应鸡尾酒, 在 rt 孵育30分钟。
- 取下荧光反应鸡尾酒, 在轻微晃动的情况下, 用200μl 的 3% bsa 在 1x pbs 中清洗5分钟。按照步骤 6.21–6.22 (图 3d) 进行反和安装。
Representative Results
在成功培养人类原发性前列腺组织后, 可采用明亮场图像分析、ffpe 和整体染色技术进行形态学和分化评估。
明亮场图像捕获的过程如图 1a 所示。有机体生长在三维矩阵中, 分散在不同的震源平面上。为了观察多个平面上的焦点中的有机体, 建议使用 edf 图像 (图 1b, 右) 而不是单个 z 平面 (图 1b, 左)。在实验室中, 在不同实验条件下生长的有机生物可能会导致形态的变化。使用面积、圆形 (由有机体与圆的相似程度定义) 和最大半径 (长度测量) 可指示用户的有机体大小和形状, 并提供可量化的形态读数。为了强调这些措施的有用性, 图1c显示了具有相似面积但形态不同的有机生物的代表性图像, 其中长的有机体会比球形的体积更小, 最大的最小比也更大有机的。
用于组织学的嵌入有机体是观察样品内部并确保在有机体核心内不存在坏死的有用终点。图 2a、b、c 提供了这一过程的工作流程以及在明亮场显微镜下对未染色、切片样品的代表性结果。图 3 a 显示了与图3 a (右) 和图 3 b中适当处理的有机体相比处理不当的有机体 (左)。为了确定样品的分化状态, 建议查看基底细胞标记 (细胞角蛋白5和 p63)8以及腔细胞标记 (细胞角蛋白 8)8。如果希望在现场对有机硅进行染色, 整体染色是一种方便的选择, 这些具有代表性的结果如图 3c, d 。
图 1: 3d 培养中有机生物的形态评估。(a)用电动 x/y 扫描级和配套软件, 通过透射光倒置显微镜获得的人类原发性前列腺有机体的图像采集和压缩工作流程。(b)单个 z 堆栈 (左)与人类原发性前列腺组织的全井样本的 edf 图像 (右), 表明当多个 z 堆栈合并到一个投影图像 (刻度条 = 1000μm) 时, 更多的有机体处于焦点。(c)具有相同面积 (刻度条 = 200μm) 的形态不同的人类原发性有机体的面积、循环和最大比的代表性图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 有机嵌入工作流和具有代表性的切片结果。(a)人原发性前列腺有机体嵌入工作流程。(b)在明亮的野外显微镜下放置含有人类原发性巨细胞的未染色的新鲜幻灯片的代表性图像, 该幻灯片描绘琼脂 (绿色箭头)、组织学凝胶 (黑色箭头)、气泡 (蓝色箭头)、有机体 (红色箭头) (刻度栏 = 1000μm). (c)未染色的新切割滑梯 (左) vs。未染色干燥滑块 (右), 有机体 (红色箭头) 在干燥时呈半透明 (刻度条 = 500μm), 在明亮的显微镜下更难分辨。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 切片和整个安装的有机体的组织学染色。(a) h & e 染色的一个破碎的人类初级前列腺有机体从处理不当 (腐蚀性移液, 错误的处理协议, 左) 旁边处理良好的有机体 (右) 旁边 (刻度棒 = 100μm)。(b)人原发性前列腺素, 已被福尔马林固定, 石蜡嵌入, 切片, 并染色基部细胞角蛋白5或腔细胞角蛋白 8 (顶部) 或基底 p63 和腔细胞角蛋白 8 (底部), 并用共聚焦显微镜成像 (刻度杆 = 100μm)。(c)全身安装的人原发性前列腺器官染色基部细胞角蛋白5或腔细胞角蛋白 8, 并与药物蛋白和 dapi 进行反染色, 用共聚焦显微镜成像 (刻度棒 = 100μm)。(d)用荧光标记的 edu 染色的全装人类原发前列腺细胞有机体, 用共聚焦显微镜 (刻度条 = 500μm) 成像,请点击此处查看这一数字的更大版本.
Discussion
有组织型培养是一种令人兴奋的新方法, 具有体外环境的便利性。目前, 实验室从多种类型的组织中为不同的端点生长有机生物。本文介绍的方法总结了有用的端点, 并突出了全面描述三维原代前列腺细胞培养的新技术。
有多种培养基配方用于培养人类原发性前列腺细胞有机体 5,6,13。虽然所有的人都取得了可行和可比的结果 , 但基于 ksfm 的介质13使用的是最小的添加剂, 所以这里描述了它。此外, 还发表了使用多种浓度的基质凝胶, 从10% 到 75%, 以培养前列腺有机体5,6,13。因为基质凝胶是一种昂贵的试剂, 33% 的基质凝胶已被证明足以培养长期 (2-3周), 可行, 未聚集的有机生物 13,这是推荐的浓度。然而, 基质凝胶在蛋白质浓度上可以在手数之间发生变化, 因此在电镀时应该考虑到这一点。还建议大量购买基质凝胶, 用于多个实验, 以减少批次之间的不一致。其他实验室已经公布了不同的格式电镀基质凝胶, 如液滴, 而不是涂层96孔板井5。这两种方法都形成了可行的有机生物, 但这里描述的格式允许细胞更稀疏地镀膜, 这已经被证明可以促进细胞膨胀为更大的有机体13。然而, 电镀密度应根据患者的具体形成效率进行优化。基质凝胶有多种形式, 包括生长因子还原、无红苯酚、高浓度等. 在定义的培养条件下, 建议减少生长因子, 在使用表达 gfp 的细胞或涉及堆栈图像捕获的实验时, 建议使用无红的苯酚。由于基质凝胶在室温下快速凝固, 使用冷试剂进行任何基质凝胶电镀步骤都是至关重要的。
在不同的实验处理下生长的有机体可能会导致形状的变化, 因此明亮场成像被广泛用于研究观察到的形态表型。然而, 记录和量化区域或形状是一个挑战, 原因有二: 1) 图像捕获过程中的选择偏差; 2) 将区域等二维参数应用到三维样本中。图像捕获的一种策略是记录一个随机字段并测量该字段中预定数量的有机体, 但这可能会在选择过程中产生偏差, 并且选定字段中的所有有机体可能都不在焦点上。针对96孔微板格式进行优化的全井成像通过收集感兴趣的整个有机体群体来消除这种采样偏差。然而, 根据手头的显微镜目标, 可能需要收集和平铺多个字段, 以获得完整的图像。一些实验室描述了从单个 z 平面12 测量区域,但为了捕获聚焦中的所有有机生物, 建议收集多个平面并将其堆叠到一个 edf 图像13中。在某些情况下, 矩阵凝胶中的半月板可能会导致图像出现晕影, 可能需要使用图像分析软件应用背景校正方法。理想情况下, 精确体积是最适合于有机体尺寸的测量方法;但是, 即使使用多个 z 堆栈图像, 也很难精确地获得。其他有用的形态维度, 如循环和最大值最小比, 可以很容易地计算从所有的有机体在整个井 edf 图像。这些方法共同克服了采样偏差的挑战, 并能够在3d 空间中测量3d 对象的2d 参数。
福尔马林固定和石蜡包埋是一种常用的方法, 以获得血红素和 eosin (h & e), 免疫组织化学 (ihc), 和免疫荧光 (if) 染色的可视化和分析 6,11,20. 然而, 描述这种技术的出版物缺乏关于嵌入过程的全面细节。此外, 在石蜡块中定位有机体可能具有挑战性。一些实验室在布设之前用色氨酸蓝色预染色, 以便在第11节期间在位置上得到帮助。这里描述的方法结合了使用组织学染料定向的有机组织组织凝胶插头在嵌入过程中, 以提高切片的效率。h & e 幻灯片有助于检查坏死, 核纹理和增殖, 因此它应该是一个强制性的终点有机体培养, 以确保细胞是健康的整个领域。有机体培养的一个优点是样本由异质细胞的混合物组成,这些细胞在体内的患者组织中更相似。例如, 在前列腺中, 基部和腔内细胞都存在于前列腺有机体5中, 而在2d 中生长的细胞缺乏腔分化8。为了评估有机体的分化, 建议研究人员评估基础标志物, 如 ck5 和 p63 和腔内标志物, 如雄激素受体和 ck8.任何其他感兴趣的实验蛋白也可以使用这些染色技术进行研究。
虽然 ffpe 部分允许通过组织学方法 (h & e、if、ihc) 显示存在于内隔间的细胞, 但图像仅限于横截面, 而嵌入过程可能会改变有机形状。全贴染色使有机体能够在原地染色和观察, 保持形态表型, 并允许蛋白质定位的图像。全安装是一种用于染色全组织或整个动物标本的工具, 如斑马鱼或小鼠胚胎, 很容易适应有机生物。这里描述的技术是由 maé等人等人的程序修改的.1 1日, 详细介绍了胃肠道有机体直接在室内滑块上的初始生长和培养, 并需要对整个家长培养进行固定。这里概述的方法包括在染色时将一个感兴趣的有机体 (或有机体) 转移到室内滑块上。这使得在不固定父系文化的情况下, 可以在正在进行的实验中选择用于整体安装分析的单个有机体。在进行全装染色时, 有必要优化原生和二级抗体的渗透和培养时间, 以确保在整个标本中渗透 (建议在一天或多天内的任何地方)。一旦通过共聚焦显微镜成像, 就可以制作3d 渲染, 以实现特定蛋白质的可视化和定位, 并计算样本中存在的阳性染色细胞的数量。流式细胞术是一个有用的终点, 以量化基础, 腔内, 或干细胞 5,14的人群.要做到这一点, 细胞从基质凝胶中恢复, 并轻轻分离染色。用户应根据当前文献仔细选择适当的分离标记。对于人原代前列腺上皮细胞, cd26 和 cd49f 分别适用于腔和基部标志物 5,21。
总之, 该协议详细介绍了人类初级前列腺有机体的生长、收集和实验终点。值得注意的是, 所描述的安装技术可应用于通常用于2d 细胞的各种其他检测, 如基于荧光原蛋白的实验, 研究增殖19、凋亡和亚细胞细胞器染色.此外, 这里描述的收集和离解方法可用于制备单细胞 rna 测序18。总的来说, 这证明了研究人员将来可以优化和探索的各种新颖、高保真端点的可能性。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 uic 生物研究所成员 klara valyi-nagy 博士和 alex susma, 以及泌尿科医生 michael abern、daniel moreira 和 simone crivallero 博士为初级细胞培养的组织获取提供了便利。我们感谢 uic 泌尿外科患者将他们的组织捐献给研究。这项工作的部分资金来自国防部前列腺研究计划健康差异理念奖 pc121923 (农) 和 uic 临床和翻译科学前博士教育的临床和转化科学家 (pects) 计划 (mccay 和理查兹) 和由国家卫生研究院的国家癌症研究所, 赠款号码 u54ca202995, U54CA202995, 和 U54CA202995, 被称为芝加哥和平平等合作 (nonn 和理查兹)。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院或国防部的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
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